CN113082044A - 铁皮石斛纯化多糖在制备预防或治疗结直肠癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,拓展了铁皮石斛纯化多糖的用途,提供了铁皮石斛纯化多糖在制备预防或治疗结直肠癌药物中的应用。本发明研究结果表明,铁皮石斛纯化多糖不仅能够有效保护肠道黏膜屏障功能,减少肠道炎症,降低结肠癌发病率,抑制与肠炎相关的结肠肿瘤的数量和尺寸,抑制结肠肿瘤的形成与发展。铁皮石斛纯化多糖还能够增强淋巴细胞的免疫抑制功能,提高肿瘤微环境中淋巴细胞的能量代谢能力,增强其抗肿瘤免疫应答,从而提高淋巴细胞对结肠肿瘤细胞起到免疫抑制作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及铁皮石斛纯化多糖在制备预防或治疗结直肠癌药物中的应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全世界第三大常见的恶性肿瘤。其中炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)与肠炎相关的结直肠癌(Colitis-associatedcancer,CAC)风险增加密切相关。干预IBD是防治CAC的关键途径。目前,治疗IBD的药物主要有:糖皮质激素、5-氨基水杨酸类和免疫抑制剂等。但是,这些药物的疗效均存在一定的局限性。而针对CAC的化疗药如奥沙利铂和卡培他滨等,虽然具有一定的治疗效果,然而,长期使用将降低机体免疫功能,可诱导部分肠癌患者病情进一步恶化。因此,开发更理想的防治CAC药物或治疗策略迫在眉睫。
一直以来,人们一直致力于寻找和研究防治CAC的中药。临床实践证明,不少中药抑制CAC的作用突出;并且在增强放化疗的疗效及减少毒副作用、延长生存期、提高患者生存质量等方面,凸显了独特的优势。例如:公布号为CN110179870A的中国专利公开了威灵仙总皂苷抑制结肠炎-癌转化进程的用途,具体公开了威灵仙总皂苷可以有效改善AOM/DSS诱导的CAC模型中结肠炎相关症状,并且减缓小鼠结直肠恶性癌变的进程;公布号为CN111686202 A的中国专利公布了一种抑制活动期溃疡性结肠炎炎症进展的复方中药组合物及其制备方法与应用,具体公开了括如下重量份数的组分:白头翁10~15份,川黄柏8~15份,生大黄3~8份,败酱草10~20份,仙鹤草15~30份,地榆炭10~20份,煨木香10~20份,白及6~15份,三七10~20份,血竭3~8份,生甘草5~10份的中药组方可以降低溃疡性结肠炎的炎症浸润,改善黏膜愈合提高治疗的有效率。然而这些中药对结直肠癌的治疗效果仍有待提高。因此,积极探索中医药干预CAC的作用机理,开发更加有利于结肠癌治疗的中药,可为防治CAC和优化结合中西医治疗方法提供更好的策略。
铁皮石斛是我国一种传统的名贵中药,始载于《神农本草经》,能“补五脏虚劳赢瘦、强阴”,久服“厚肠胃”。然而,多糖作为铁皮石斛主要的活性成分,其是否为铁皮石斛“厚肠胃”的物质基础,其纯化多糖是否能够抑制结直肠癌的形成及发展,尚未报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足,提供铁皮石斛纯化多糖在制备预防或治疗结直肠癌药物中的应用。
本发明的第二个目的在于提供一种预防或治疗结直肠癌药物的药物。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的:
本发明通过AOM与DSS联用诱导构建结直肠癌小鼠模型,探究铁皮石斛纯化多糖(DOPS)对结直肠癌小鼠的肿瘤数量、肿瘤尺寸以及肿瘤微环境中的淋巴细胞能量代谢的影响。实验分为正常对照组(Control组)、模型组(AOM/DSS组)、DOPS低剂量组(50mg/kg/day)、DOPS中剂量组(100mg/kg/day)以及DOPS高剂量组(200mg/kg/day)。通过结肠组织病理学评估铁皮石斛纯化多糖抑制结直肠癌肿瘤形成及发展情况,实验结果表明:AOM/DSS组的小鼠癌变率为100%,给予DOPS后,动物的结肠癌的发病率呈现出剂量依赖性下降,DOPS低、中、高给药组小鼠癌变率分别为:100%,85%,75%;与AOM/DSS组比较,DOPS中、高剂量组能够显著抑制直径大小为2<R<3和3≤R的肿瘤数量;DOPS给药组的不规则的腺体数量较AOM/DSS模型组减少,结肠肿瘤隆起状减少,杯状细胞肿大得以改善,说明DOPS能够保护肠道黏膜屏障功能,减少肠道炎症,抑制结直肠癌的发生发展。本发明还探究了DOPS对结肠癌肿瘤微环境中的淋巴细胞代谢能力的影响,通过检测淋巴细胞ATP含量与CD8+T细胞线粒体数量发现,AOM/DSS模型组动物肿瘤微环境中,淋巴细胞ATP的含量明显降低,与Normal组比较,差异具有显著性(P<0.01);给予了DOPS后,与AOM/DSS模型组比较,DOPS给药组能够剂量依赖性地升高淋巴细胞中ATP的含量,其中DOPS高剂量组肿瘤微环境中ATP的含量升高最为明显,与AOM/DSS模型组比较,差异具有显著性(P<0.05);AOM/DSS模型组动物肿瘤微环境中CD8+T细胞中线粒体的数量与Normal组(24.10±3.15)比较,差异具有显著性(P<0.01);给予了DOPS后,DOPS给药组微环境中CD8+T细胞中线粒体的数量呈剂量依赖性升高;DOPS中、高剂量组CD8+T细胞中线粒体的数量升高最为明显,与AOM/DSS模型组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实验结果表明,铁皮石斛纯化多糖具有预防或治疗结直肠癌的作用。
优选地,所述铁皮石斛纯化多糖的制备方法如下:将铁皮石斛洗净,剥皮,剪至2~3cm的小段;加入去离子水,铁皮石斛与水的比例为1g:25mL,榨汁过滤,滤渣重复榨汁2次,合并汁液;浓缩,不断搅拌,加入无水乙醇,于4℃沉淀,离心取沉淀,沉淀用去离子水复溶,加入无水乙醇,于4℃沉淀24h,如此反复,直至乙醇液为无色,收集沉淀,脱蛋白后冻干,得铁皮石斛粗多糖;将铁皮石斛粗多糖溶于碱性硼酸盐缓冲溶液中,上样于DEAE-52纤维素柱的上端,以NaCl硼酸盐缓冲液溶液为解析液,用2mol/L NaCl硼酸盐缓冲液溶液进行线性解析,收集合并各阶段洗脱液中含多糖的解析液,浓缩、酸化、透析脱盐及冻干得铁皮石斛纯化多糖。
优选地,所述铁皮石斛纯化多糖在制备抑制结肠肿瘤形成药物中的应用。
优选地,所述铁皮石斛纯化多糖在制备抑制结肠肿瘤数量、减小结肠肿瘤尺寸药物药物中的应用。
优选地,所述铁皮石斛纯化多糖在制备保护肠道黏膜屏障功能药物中的应用。
优选地,所述铁皮石斛纯化多糖在制备减少肠道炎症药物中的应用。
优选地,所述铁皮石斛纯化多糖在制备增强淋巴细胞免疫抑制功能药物中的应用。
进一优选地,所述铁皮石斛纯化多糖在制备提高肿瘤微环境中淋巴细胞的能量代谢药物中的应用。
更优选地,所述铁皮石斛纯化多糖在制备提高结肠肿瘤微环境中腺嘌呤核苷三磷酸的含量药物中的应用。
更优选地,所述铁皮石斛纯化多糖在制备增强结肠肿瘤微环境中CD8+T细胞线粒体数量药物中的应用。
优选地,上述任一所述结肠肿瘤为肠炎相关的结肠肿瘤。
本发明还提供了一种预防或治疗结直肠癌药物的药物,其活性组分为铁皮石斛纯化多糖;所述药物包括药学上可接受的口服制剂和注射制剂。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明拓展了铁皮石斛纯化多糖的用途,提供了铁皮石斛纯化多糖在制备预防或治疗结直肠癌药物中的应用。本发明研究表明,铁皮石斛纯化多糖不仅能够有效保护肠道黏膜屏障功能,减少肠道炎症,降低结肠癌发病率,抑制与肠炎相关的结肠肿瘤的数量和尺寸,抑制结肠肿瘤的形成与发展。铁皮石斛纯化多糖还能够增强淋巴细胞的免疫抑制功能,提高肿瘤微环境中淋巴细胞的能量代谢能力,增强其抗肿瘤免疫应答,从而提高淋巴细胞对结肠肿瘤细胞起到免疫抑制作用。
附图说明
图1为DOPS对小鼠结肠癌发病率的影响。
图2为DOPS对结直肠癌小鼠的结肠下端肿瘤形态图。
图3为DOPS对结直肠癌小鼠结肠肿瘤的数量、尺寸的影响。
图4为不同剂量DOPS组的结直肠癌小鼠结肠肿瘤组织切片图。
图5为DOPS对结直肠癌小鼠淋巴细胞ATP含量的影响。
图6为DOPS对肿瘤浸润CD8+T细胞中线粒体数量的影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例采用的实验动物信息:SPF级,雄性BALB/c小鼠(6~8周龄,18~22g),购买于广州中医药大学实验动物中心,许可证号:SCXK(粤)2013-0034,动物合格证编号为:NO.44007200043643。动物饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级实验动物房,动物饲养条件为:温度(20~25℃),湿度(65~70%),12h光照明暗交替,饲养时,动物给予标准的饲料和自由饮用无菌蒸馏水,每隔一天更换新的垫料。
实施例1铁皮石斛纯化多糖的制备
将新鲜铁皮石斛洗净,剥去老皮,剪至2~3cm的小段。置于榨汁机内,按原药材比水1g:25mL的比例加入去离子水。榨汁3~5min后,过滤,滤渣重复榨汁2次,合并汁液。浓缩至每2mL浓缩液相对于原药材1g,不断搅拌下,加入浓缩液4倍量的无水乙醇,于4℃沉淀24h,离心得沉淀,沉淀用25倍量的去离子水复溶,加入4倍量无水乙醇,于4℃沉淀24h,如此反复,直至乙醇液为无色,收集沉淀,Sevag法脱蛋白后冻干,得铁皮石斛粗多糖。采用碱性硼酸盐缓冲溶液强化DEAE-52纤维素柱层析的方法对铁皮石斛粗多糖进行分级纯化。将一定量的铁皮石斛粗多糖溶于碱性硼酸盐缓冲溶液中,按一次性上样方式将其上样于DEAE-52纤维素柱的上端,以NaCl硼酸盐缓冲液溶液(pH值与柱平衡液相同)为解析液,用2mol/LNaCl硼酸盐缓冲液溶液进行线性解析,收集合并各阶段(部位)洗脱液中含多糖的解析液,分别浓缩、酸化、透析脱盐及冻干得铁皮石斛纯化多糖DOPS。
实施例2铁皮石斛纯化多糖抑制结直肠癌药效学研究
将雄性BALB/C小鼠(6~8周龄,18-22g)适应性饲养7天后,按照体重将动物随机分为:正常对照组(Control组)、模型组(AOM/DSS组)。其中,正常对照组动物腹腔注射生理盐水(0.9%),自由饮用蒸馏水;AOM/DSS组动物腹腔注射AOM(10mg/kg),动物注射隔一天后,给予2%DSS,AOM/DSS模型组动物经历三个2%DSS处理周期,每个造模期以2%DSS连续自由饮用7天和14天自由饮用蒸馏水组成。造模第一个周期完成后,将肠癌模型动物,按照体重和肠炎严重程度,分为:AOM/DSS模型组和DOPS给药组,DOPS给药组分为DOPS低剂量组(50mg/kg/day)、DOPS中剂量组(100mg/kg/day)和DOPS高剂量组(200mg/kg/day),Control组和AOM/DSS模型组动物每天灌胃等量的蒸馏水,DOPS给药组根据动物体重每天给药一次,直到实验结束。每天记录动物的状态。
实验结束后,刨开结肠组织,展开于冷托盘上,将结肠组织中的粪便用棉签轻轻地移除,避免伤及结肠黏膜组织。清点结肠组织中肿瘤的数量,使用游标卡尺测量结肠肿瘤的直径(R)(单位:mm),我们根据肿瘤直径的大小把结肠肿瘤划分为3个等级,分别为:0<R≤2,2<R<3,3≤R,分别记录总的肿瘤数和各个等级肿瘤的数量。
结肠组织病理学检查:将结肠组织固定于4%的多聚甲醛固定液中。浸泡24h后,结肠组织被脱水同时包埋成蜡块。切片厚度为4μm,切片置于自动染色仪,进行HE染色。HE染色结束后,采用中性树脂封片。将切片于光学显微镜下观察组织的形态和炎症浸润情况。结果分析如下:
(1)铁皮石斛纯化多糖抑制结直肠癌肿瘤形成及发展
DOPS对小鼠结肠癌发病率的影响如图1所示,给予DOPS后,动物的结肠癌的发病率呈现出剂量依赖性下降,DOPS低、中、高给药组动物癌变率分别为:100%,85%,75%(图1)。动物腹腔注射AOM后,经三个周期的DSS造模,结肠组织有明显的肿瘤形成,结肠下端肿瘤形态如图2所示。与Control组(0.00±0.00)动物相比,AOM/DSS模型组动物结肠组织肿瘤多出现于结肠下端(与肛门处1~2cm),肿瘤多成团聚集;AOM/DSS模型组动物结肠组织平均肿瘤数量数为27.33±2.79,与Control组(0.00±0.00)相比,差异具有显著性(P<0.01)(图3a);给予DOPS后,DOPS给药组能够有效地抑制肿瘤的形成,结肠肿瘤的数量呈剂量依赖性下降,与AOM/DSS模型组比较,DOPS中、高剂量组动物结肠肿瘤数量减少最为明显,差异具有显著性(P<0.05)。此外,我们对结肠肿瘤的直径大小进行分类,结果如图3b~d所示。我们发现AOM/DSS模型组动物结肠肿瘤直径(单位:mm)在R≤2,2<R<3和3≤R的肿瘤数量分别为7.08±1.32,10.08±1.29和10.16±1.29,与Control组相比,其肿瘤的数量显著性升高(P<0.01);给予DOPS后,我们发现DOPS中、高剂量组能够有效地抑制直径大小为2<R<3和3≤R的肿瘤数量,与AOM/DSS模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)(图3b~c);其对R≤2范围的肿瘤数量也有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)(图3d)。这些结果证明DOPS能够有效地抑制AOM联合DSS诱导结肠肿瘤的形成与发展。
(2)DOPS对结直肠癌动物模型结肠肿瘤组织病理学的影响
肿瘤组织切片如图4所示,结肠组织的结构形态发生明显的改变,大量的炎症细胞浸润,杯状细胞坏死和缺失严重,杯状细胞肿大明显,结肠黏膜层脱落,细胞间隙不完整,结肠肿瘤呈现出隆起状,肿瘤处炎症细胞浸润明显,有不规则的腺体结构,肿瘤边缘处,细胞多出现缺裂。肿瘤组织中炎症细胞多聚集在肿瘤边缘,肿瘤边缘处细胞连接紧密,DOPS给药组的不规则的腺体数量较AOM/DSS模型组减少,结肠肿瘤隆起状减少,杯状细胞肿大得以改善。这表明DOPS能够保护肠道黏膜屏障功能,减少肠道炎症,抑制结直肠癌的发生发展。
实施例3铁皮石斛纯化多糖对肿瘤微环境中CD8+T细胞代谢功能影响
将实施例1的结肠肿瘤组织摘除后,用无菌棉球搽干净肿瘤中粪便,肿瘤浸泡于预冷的PBS中漂洗,将肿瘤剪碎成1cm2大小的小块。在小鼠淋巴细胞分离液上,使用10mL注射器内活塞轻轻挤压肿瘤组织。取肿瘤微环境中的淋巴细胞,检查肿瘤微环境中免疫细胞ATP的水平。肿瘤微环境淋巴细胞纯化计数后,加入适量浓度的CD3(FITC)和CD8(PE)抗体,混匀,室温避光孵育25min。孵育完后,细胞在室温下以250×g离心速度离心10min。倒去上清液,每管加入500μL 37℃预热的Deep Red FM染色工作液(浓度为:50nmol/L),轻轻重悬细胞,于37℃避光孵育45min。Deep Red FM染色结束后,室温250×g离心10min。倒去上清液,收集细胞,使用37℃预热新鲜的RPMI 1640培养基或PBS重悬细胞,使用流式细胞仪检测。结果分析如下:
(1)DOPS对肿瘤微环境中淋巴细胞ATP的影响
DOPS对结直肠癌小鼠淋巴细胞ATP含量的影响如图5所示,AOM/DSS组动物肿瘤微环境中,淋巴细胞ATP的含量明显降低,与Control(Normal)组比较,差异具有显著性(P<0.01);给予DOPS后,与AOM/DSS模型组比较,DOPS给药组能够剂量依赖性地升高淋巴细胞中ATP的含量,其中DOPS高剂量组肿瘤微环境中ATP的含量升高最为明显,与AOM/DSS组比较,差异具有显著性(P<0.05)。这表明DOPS能够提高肿瘤微环境中淋巴细胞的能量代谢。
(2)DOPS对结肠组织肿瘤微环境中CD8+T细胞线粒体数量的影响
DOPS对肿瘤浸润CD8+T细胞中线粒体数量的影响如图6所示,在肿瘤微环境中,AOM/DSS模型组动物肿瘤微环境中CD8+T细胞中线粒体的数量为9.33±0.23,与Control(Normal)组(24.10±3.15)比较,差异具有显著性(P<0.01);给予DOPS后,DOPS给药组微环境中CD8+T细胞中线粒体的数量呈剂量依赖性升高;DOPS中、高剂量组CD8+T细胞中线粒体的数量升高最为明显,与AOM/DSS模型组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明DOPS能够改善肿瘤微环境中T淋巴细胞代谢能力,增强CD8+T细胞线粒体的数量,增强其抗肿瘤免疫应答,从而提高淋巴细胞对结肠肿瘤细胞起到免疫抑制作用。
Claims (10)
1.铁皮石斛纯化多糖在制备预防或治疗结直肠癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述铁皮石斛纯化多糖在制备抑制结肠肿瘤形成药物中的应用。
3.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述铁皮石斛纯化多糖在制备抑制结肠肿瘤数量、减小结肠肿瘤尺寸药物中的应用。
4.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述铁皮石斛纯化多糖在制备保护肠道黏膜屏障功能药物中的应用。
5.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述铁皮石斛纯化多糖在制备减少肠道炎症药物中的应用。
6.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述铁皮石斛纯化多糖在制备提高结肠肿瘤微环境中淋巴细胞的能量代谢药物中的应用。
7.根据权利要求6所述应用,其特征在于,所述铁皮石斛纯化多糖在制备提高结肠肿瘤微环境中腺嘌呤核苷三磷酸的含量药物中的应用。
8.根据权利要求6所述应用,其特征在于,所述铁皮石斛纯化多糖在制备增强结肠肿瘤微环境中CD8+T细胞线粒体数量药物中的应用。
9.根据权利要求2、3、6~8任一所述应用,其特征在于,所述结肠肿瘤为结肠肿瘤为肠炎相关的结肠肿瘤。
10.一种预防或治疗结直肠癌药物的药物,其特征在于,其活性组分为铁皮石斛纯化多糖;所述药物包括药学上可接受的口服制剂和注射制剂。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210709 |
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