CN113072627A - MccJ25突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种MccJ25突变体及其制备方法和应用。该MccJ25突变体氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。以质粒pUC5725为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的序列为引物进行PCR扩增得扩增产物；将所述扩增产物加入内切酶，去除pUC5725模板得所述MccJ25高水溶性突变体；然后将步骤(1)中所述质粒pUC5725为MccJ25编码基因序列根据AF061787优化合成后插入pUC57的EcoRI‑SalI位点中得到MccJ25高水溶性突变体。该MccJ25高水溶性突变体的稳定性和杀菌活性优于或等于野生型，而且对人工胃肠液的敏感性提高。

Description

MccJ25突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种MccJ25突变体及其制备方法和应用。
背景技术
MccJ25是由大肠杆菌Escherichia coli AY25产生的长21AA的细菌素，分离自人粪便(Blond,A.,J.Péduzzi,C.Goulard,et al.1999.The cyclic structure of microcinj25,a 21-residue peptide antibiotic from escherichia coli.Febs Journal,259(3),747)。MccJ25编码基因位于低拷贝质粒pTUC100上长4.8kb片段内，含有4个基因，分别是mcjA、mcjB、mcjC和mcjD(Solbiati,J.O.,M.Ciaccio,R.N.Farías,et al.1996.Geneticanalysis of plasmid determinants for microcin j25 production andimmunity.Journal of Bacteriology,178(12),3661-3)。mcjA基因长174bp，为MccJ25前体，加工成熟过程中切除N-末端37aa形成MccJ25。
溶液核磁共振(solution NMR)结构解析表明，它形成类似套马索状结构，稳定折叠的主要相互作用是氨基酸侧链之间的范德华力，本质上主要是疏水基团和极性基团之间的相互作用，两个主要的疏水区域位于表面上：第一个区域涉及Tyr20、Val6和Glu8的亚甲基侧链，第二个区域包括Pro7、Phe10、Pro16和Phe19，另外His5和Gly21之间因静电作用形成盐桥，有助于稳定C-末端(Rosengren,K.J.,R.J.Clark,N.L.Daly,et al.2003.Microcinj25 has a threaded sidechain-to-backbone ring structure and not a head-to-tail cyclized backbone.Journal of the American Chemical Society,125(41),12464-74)。所以，残基变化可直接影响MccJ25结构稳定性，使其耐热、耐酸碱、耐酶性质发生变化。MccJ25必须先被受体识别、结合、摄入，然后才能作用于靶位点。残基Ala3和His5可以同外膜铁受体蛋白FhuA结合，残基Gly4、Pro7、Tyr9、Phe10、Phe19和Gly21抑制RNA聚合酶活性(Destoumieux-Garzón等，2005)。替换MccJ25的G12、I13或T15残基将增强其抗菌活性(Pan等，2011)。因此，残基变化可直接影响MccJ25的识别、摄入及与靶位点的结合活性，进而影响其杀菌活性。
MccJ25表面两个疏水区域(Rosengren,K.J.,R.J.Clark,N.L.Daly,etal.2003.Microcin j25 has a threaded sidechain-to-backbone ring structure andnot a head-to-tail cyclized backbone.Journal of the American ChemicalSociety,125(41),12464-74)，使它在水中的溶解度不高，在生产过程中会降低回收率和浓缩倍数，进而提高生产成本。
MccJ25作为一种抗菌肽，可以应用在很多产品中起到杀菌或是防腐的作用。但是未改造的MccJ25的水溶性很差，会限制一些对水溶性要求高的产品的结合使用。比如MccJ25作为抗菌肽可以制备兽药，MccJ25制备的生物兽药，可以杀灭大肠杆菌和沙门氏菌，降低仔猪和雏鸡阶段的细菌性腹泻，如仔猪黄白痢，鸡沙门氏菌白痢，同时减少蛋鸡体内沙门氏菌数量，减少种蛋中沙门氏菌感染率，从而提高种鸡孵化率。兽药可以溶到水中后，通过水线进行集中饲喂，效果较好。但是许多兽药要求水溶性好，无不溶性固体，不溶性固体会堵塞水线，影响动物饮水。
MccJ25可以抑菌，是化妆品不错的防腐剂，但是未改造的MccJ25难溶于水，很难做成化妆品的膏状或者乳状。改造后，水溶性提高，可以大量溶解到化妆品中作为防腐剂，延长化妆品保质期。目前没有相关文献报道MccJ25作为化妆品的防腐剂。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种提高野生型MccJ25水溶性的方法。
将MccJ25表面第二个疏水区域内残基I13、T15分别突变为P和G等小侧链氨基酸。
进一步，所述方法具体为：以质粒pUC5725为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的序列为引物进行PCR扩增得扩增产物；将所述扩增产物加入内切酶，去除pUC5725模板得所述MccJ25高水溶性突变体；所述质粒pUC5725为MccJ25编码基因序列根据AF061787优化合成后插入pUC57的EcoRI-SalI位点中得到。
进一步，所述PCR扩增的程序为：98℃3min；98℃×10s，55℃×15s，72℃×2min运行15循环；72℃×5min。
进一步，所述内切酶为DpnI内切酶。
具体地，在本发明某些实施例中，所述PCR扩增的扩增条件为：5×缓冲试剂10μl；SEQIDNO.2的引物10-15pmol；SEQIDNO.3所示的引物10-15pmol；模板pUC5725<500ng；DNA缓冲液0.5μl；1.25u/μl的聚合酶0.5μl，后加水至50μl。
另外地，可以对MccJ25突变体利用液相色谱方法进行纯化。所述液相色谱方法进行纯化具体为：流动相：A为0.1％三氟乙酸水溶液，B为0.1％三氟乙酸90％乙腈；柱温：25℃；进样量：100μL；流速：1.5mL/min；检测波长：280nm。
另外地，在设计引物时，针对不同的突变体设计不同的引物，选择不同的载体进行PCR扩增。
另外地，除了MccJ25高水溶性突变体之外，以野生型MccJ25为基础，不同的突变位点发生突变得到的其他有较高水溶性的突变体，或具有其他性质的突变体，在本发明某些实施例中，还包括MccJ25突变体较野生型提高耐酸、耐碱、耐胃肠酶的性质。在本发明某些实施例中，在β发夹区替换I13P、T15G残基得到MccJ25突变体。
本发明目的在于还提供一种前述的方法制备的MccJ25突变体。
进一步，所述MccJ25突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示及其同一性大于等于90％的序列。
本发明目的在于还提供一种编码权利前述的MccJ25突变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明目的在于还提供一种包含前述的核苷酸序列的重组质粒。
进一步，所述重组质粒为所述的核苷酸序列与表达载体构建而成。
本发明目的在于还提供一种包含前述的重组质粒的大肠杆菌。
进一步，所述大肠杆菌以大肠杆菌DH5α为宿主，pUC57为表达载体。
另外地，对不同的突变体可以选择不同的大肠杆菌宿主以及不同的表达载体进行重组得到不同的大肠杆菌。
具体地，在本发明某些实施例中，将菌株划线于含50μg/ml氨苄青霉素LB平板上，37℃过夜培养。挑单克隆于3ml液体LB培养基中，37℃×220rpm培养12-16h作为种子液。取40μl种子液，接种到含40ml发酵培养基的摇瓶中(250ml容量)，37℃×220rpm培养22h，得到包含菌体及分泌的突变体的发酵液。
包含菌体及分泌的突变体的发酵液经8000rpm离心15min，取上清，-80℃预冻3h后冻干浓缩。冻干后的固体称重，用80％的乙腈(0.2g/mL)洗涤三次，8000rpm离心5min，保存上清液。将第二、三次上清液旋转蒸发浓缩后，经0.22μm有机滤膜过滤得到较纯的突变体。
本发明目的在于还提供一种前述的的MccJ25突变体在制备液体制剂中的水相中的应用。
所述液体制剂指的是含有水的制剂或者使用状态含有水的固体制剂，并不仅仅指传统意义上流动性比较大的水剂，这里的含有水的制剂，比如敷料，即膏状的制剂，乳状的制剂或者凝胶制剂；或者使用使用状态含有水的固体制剂，如口服的颗粒或粉末制剂等，这些颗粒或者粉末使用时，溶于水后，MccJ25突变体溶液即为水相。
优选地，所述液体制剂包括水溶性兽药、膏状或乳状化妆品。
具体地，制备水溶性生物兽药来预防和治疗动物细菌性疾病，如可以杀灭大肠杆菌和沙门氏菌，降低仔猪和雏鸡阶段的细菌性腹泻，如仔猪黄白痢，鸡沙门氏菌白痢，同时减少蛋鸡体内沙门氏菌数量。作为化妆品防腐剂延长化妆品保质期等中的应用。
具体地，通常化妆品包括水相、油相、乳剂及其他的一些辅料制成膏状或者乳状的制剂进行使用，MccJ25突变体溶于水后作为水相与其他的进行混合制成膏状或者乳状等制剂，即液体制剂。
本发明目的在于还提供一种抑菌成份浓度可调的水相。
所述水相中，所述抑菌成份含有前述的MccJ25突变体，所述MccJ25突变体的浓度为0.01-35.83mg/ml。
优选地，所述MccJ25突变体的浓度为33.90-35.83mg/ml。
具体地，抑菌成份可能还包括其他的抑菌剂，MccJ25突变体与野生型突变体抑菌能力相差无几，提高野生型水溶性后，MccJ25突变体溶于水作为水相扩宽了野生型MccJ25作为抑菌剂的使用场景，不仅仅是MccJ25野生型作为抗菌肽的使用，很多其他的生物抗菌肽且都比较难溶于水，高水溶性MccJ25可以满足很多液体制剂的要求。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的MccJ25高水溶性突变体水溶性约为35g/L，比野生型提高4倍。
本发明提供的MccJ25高水溶性突变体抑菌谱同野生型相同，MIC为2-128μg/ml，杀菌能力同野生型相当。
本发明提供的MccJ25高水溶性突变体耐热可达到100℃、可耐pH低至2的强酸环境和pH高达11的强碱环境。
本发明提供的MccJ25高水溶性突变体，人工胃液对突变体的降解率为1.7％，人工肠液对突变体的降解率为9.3％，比野生型略有提高，但仍属于耐受范围。
本发明提供的MccJ25高水溶性突变体的稳定性和杀菌活性优于或等于野生型。
附图说明
图1为MccJ25突变体质谱图。
图2a为MccJ25突变体检测波长为230nm的纯化色谱图
图2b为MccJ25突变体检测波长为280nm的纯化色谱图。
图3为MccJ25突变体检测色谱图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中大肠杆菌宿主菌DH5α购自北京天跟生化科技有限公司，大肠杆菌M4j65-11为申请人实验室保存。
本发明实施例中所用指示菌CVCC1497、CVCC1569、CVCC1499、CVCC1555、CVCC1506购自中国兽医药品监察所。
本发明实施例中ATCC6962、ATCC25922购自ATCC，E.coli O157、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、大耐、K88为申请人实验室保存。
本发明实施例中LB培养基配方：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/L氯化钠，纯化水定容至1L，121℃高压灭菌后待用。发酵培养基配方(g/L)：20g酵母粉，6g KH2PO4，pH6.2，溶于1L去离子水中，高温高压灭菌。
本发明实施例中氨苄青霉素、猪胃蛋白酶、牛胰蛋白酶购自美国Sigma公司。
本发明实施例中Phusion DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、内切酶等核酸修饰酶购买自美国Fermentas公司。
本发明实施例中色谱级三氟乙酸(TFA)、色谱级乙腈购自Thermo。
本发明实施例中DNA纯化试剂盒Wizard DNA Clean-Up system(A7280)购自Promega，
本发明实施例中质粒小提试剂盒(DP103)购自天根生化科技(北京)有限公司。
本发明实施例中MH固体培养基、MH液体培养基、胃蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂购自北京索莱宝科技有限公司。
实施例1
MccJ25编码基因序列根据AF061787优化合成，并插入pUC57的EcoRI-SalI位点中，质粒命名为pUC5725。
实施例2制备突变体
以SEQIDNO.3S2f(5‘-AGTATTTTGTGGGGCCGGGTGGACCTATATCTT-3’)、SEQIDNO.4S2r(5‘-AAGATATAGGTCCACCCGGCCCCACAAAATACT-3’)以质粒pUC5725为模板扩增，扩增长度为3.6kb，PCR程序：98℃3min；98℃×10s，55℃×15s，72℃×2min运行15循环；72℃×5min，扩增体系见表1。
表1 PCR体系
Figure BDA0002756758280000071
PCR反应结束后加入DpnI内切酶2μl，37℃水浴1h，去除pUC5725模板。
处理产物纯化后取10μl转化大肠杆菌DH5α，测序验证突变体。
实施例3突变体纯品的制备
取甘油管保存的野生型和突变克隆菌(宿主为M4j65-11)株划线于含50μg/ml氨苄青霉素LB平板上，37℃过夜培养。挑单克隆于3ml液体LB培养基中，37℃×220rpm培养12-16h作为种子液。取40μl种子液，接种到含40ml发酵培养基的摇瓶中(250ml容量)，37℃×220rpm培养22h，称为发酵液。
发酵液8000rpm离心15min，取上清，-80℃预冻3h后冻干浓缩。冻干后的固体称重，用80％的乙腈(0.2g/mL)洗涤三次，8000rpm离心5min，保存上清液。将第二、三次上清液旋转蒸发浓缩后，经0.22μm有机滤膜过滤待用。
纯化色谱条件，流动相：A为0.1％三氟乙酸水溶液，B为0.1％三氟乙酸90％乙腈；柱温：25℃；进样量：100μL；流速：1.5mL/min；检测波长：230、280nm，见图2。梯度洗脱程序如下表2。
表2梯度洗脱程序
Figure BDA0002756758280000081
纯化结束后，将收集到的馏分使用冷冻干燥机冻干。
实施例4突变体检测
准确称取5-10mg野生型和突变体纯品于2mL离心管中，加入1mL超纯水或者B相，震荡摇匀、超声(35℃)15min使之完全溶解。采用倍比(一倍)稀释法，依次稀释得到10个不同浓度的样品。
检测色谱条件流动相：A为0.1％三氟乙酸水溶液，B为0.1％三氟乙酸90％乙腈；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：1.0mL/min；检测波长：214nm、230nm、254nm、280nm；梯度洗脱程序如下表3。
表3突变体检测洗脱程序
Figure BDA0002756758280000091
平衡系统至基线水平。从低浓度样品开始，0.22μm滤膜过滤后，依次进样分析检测，记录色谱图，见图3。待10个样品检测完后，用外标定量法建立新的校正表，将方法重新命名并保存，完成标准曲线的建立。
实施例5突变体质谱鉴定
(1)鉴定步骤
质谱条件三重四级杆串联质谱仪，Agilent 6460Triple Quad LC/MS，AgilentTechnologies公司，美国；离子源：喷射流离子聚焦电喷雾离子源Jet Stream TechnologyIon Source(AJS)；分析软件：Agilent MassHunter Workstation software(VersionB.04.00)；电喷雾离子源(ESI)正离子扫描模式：毛细管电压为3500V；雾化器温度350℃；雾化器流速为12L/min；鞘气温度400℃；鞘气流速10L/min。
取少量的馏分，以针泵恒流进样分别在ESI+模式和ESI-模式下进行扫描，选择效果较好的离子模式，得到母离子为[M+H]+。
(2)鉴定结果
突变体氨基酸序列为SEQIDNO.1(GGAGHVPEYFVGPGGPISFYG)，理论分子量为2047.3，图1中：[M+2H]2+1024.2；[M+3H]3+683.2。由此可见，突变体理论分子量与实际分子量相吻合。
实施例6突变体溶解度的测定
(1)测定步骤
测定物质的平衡溶解度常常使用经典的摇瓶法，这种方法在药物研究和高纯度材料制备领域得到了广泛的应用，同时经常被用来作为标定新的溶解度测定方法的标准。具体方法如下：
取过量突变体置于100mL具塞三角瓶中，加入超纯水100mL，超声至突变体不再溶解，置于37℃水浴恒温振荡器，200rpm振摇，用注射器吸取溶液约5mL，然后经0.22μm微孔滤膜过滤(在同样温度下预热过的)，弃去初滤液，用微量移液器吸取续滤液1mL，快速用HPLC流动相稀释至一定浓度后进样。一般取样点在振摇12h之后，取样三次以上(12h，24h和36h)。由标准曲线计算突变体在水中的溶解度，前后数据RSD小于2％，其平均值即为平衡溶解度。
(2)测定结果
研究中测得突变体在37℃条件下水中的平衡溶解度为35mg/ml，其溶解性能比野生型MccJ25显著提高，主要原因是突变位点(I13P、T15G)残基的水溶性相对较好。根据《中国药典》2005版及2010版采用“极易溶解、易溶、溶解、略溶、微溶、极微溶解、几乎不溶或不溶”来描述药品在不同溶剂中溶解性能，因此突变体在水中的溶解性能为“溶解”。其溶解度测定结果如下表4。
表4突变体溶解度测定结果
MccJ25(mg/ml) 突变体(mg/ml)
12h 8.59±0.10 34.55±0.65
24h 8.73±0.43 35.38±0.06
36h 8.77±0.16 35.16±0.67
注：溶解度单位为mg/ml，MccJ25为野生型。
实施例7抑菌谱和MIC的测定
(1)测定步骤
(a)12株甘油管保存指示菌MH平板划线，37℃培养20h活化；挑取单菌落于MH液体培养基，37℃×220rpm，培养12-16h，用生理盐水将菌液稀释至OD600为0.1(约108CFU/ml)，备用(无菌生理盐水稀释25-40倍)。
(b)灭菌的培养皿中倒入10ml 1.5％水琼脂做铺底，待冷却后每个平板均匀的放置8个牛津杯。待MH固体培养基冷却至50±5℃时，按100μL指示菌菌液加入到100ml琼脂培养基的比例将稀释好的指示菌菌液加入到MH固体培养基中，摇晃均匀，每个平板倒入25ml，保证每株指示菌的平板在18个以上，待冷却后，取出牛津杯，打孔板置于4℃冰箱备用，每种指示菌平板拿取1个，使用25μg/ml氯霉素与蒸馏水加样检验铺制效果。
(c)Hammami等，在2015年研究J25突变体抑菌效果的研究中，测得大部分突变体大肠杆菌和沙门氏菌MIC在2—500μg/ml的范围内，J25野生型MIC在0.2—13μg/ml范围内，Hammami使用96孔板法测MIC，打孔板法测得的数值高5—20倍(以J25野生型对K88指示菌为例，96孔板法测定MIC值为0.2μg/ml，打孔板法测定MIC值为4μg/ml)，鉴于Hammami做的突变体与野生型抑菌效果差别极大，故选定1—512μg/ml的范围进行试验。称取野生型和突变体纯品7.68mg,溶于15ml蒸馏水中，震荡混匀，用蒸馏水按照2倍梯度稀释，配制成512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml(pH均为7.5)的样品溶液，待用。打孔板每个孔加样品溶液200μl，加200μl蒸馏水作空白对照，样品全部加完后，打孔板置于4℃冰箱1—2h，待样品扩散，37℃过夜培养，次日统计MIC和抑菌谱。
(2)测定结果
MccJ25及其突变体通过FhuA-Smba途径被摄入，作用于靶标RNAP发挥杀菌作用，研究表明MccJ25结构中β发夹区Phe10-Ile17与摄入相关，且残基Ile13只被外膜蛋白FhuA识别。本实施例突变体(I13P、T15G)突变位点在β发夹区，结合表5中抑菌谱及MIC结果看：突变体抑菌谱无变化，抑菌活性同野生型相当，但某些菌株对突变体的敏感性降低。
表5突变体测MIC及抑菌谱结果
MccJ25 突变体
鸡白痢沙门氏菌 2 4
CVCC1499 4 2
CVCC1506 4 4
ATCC25922 4 16
K88 4 4
CVCC1497 8 16
O157 128 128
CVCC1569 无 无
CVCC1555 无 无
ATCC6962 无 无
鼠伤寒沙门氏菌 无 无
大耐 无 无
注：MIC单位为μg/ml，MccJ25为野生型，“无”表示浓度为512μg/ml
时对该指示菌无抑菌活性。
实施例8耐热、耐酸和耐碱试验
(1)试验步骤
(a)野生型和突变体分别配置浓度为50μg/ml和120μg/ml溶液。
取400μl溶液于2.0ml的EP管中，置于60、70、80、100℃金属浴锅20min，用冷水迅速将样本冷却至室温，HPLC测定含量，每个样品做3组平行实验。
(b)取400μl溶液于2.0ml的EP管中，照需要调pH至pH2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、9.0和11.0，将样本放入37℃水浴锅中处理2h，处理后pH均调至7.5，HPLC测定含量，每个样品做3组平行实验。
(2)试验结果
突变体在50-100℃、pH2-9范围内稳定，结果见表6和表7，由于加热水分蒸发，导致表5中有些实验组数据高于对照组；由于调节pH值加酸、碱溶液体积不同，是造成表7中数据差异的主要原因。
表6耐热试验结果
MccJ25 突变体
温度对照 49.73±0.74 117.45±1.58
100℃ 62.37±1.82 117.99±0.01
注：数据单位为μg/ml，MccJ25为野生型。
表7耐酸碱试验结果
MccJ25 突变体
pH对照 49.73±0.74 117.45±1.58
pH2.0 49.66±3.19 110.96±0.83
pH11.0 50.31±2.70 106.40±2.03
注：数据单位为μg/ml，MccJ25为野生型。
实施例9耐胃蛋白酶、胰蛋白酶试验
(1)试验步骤
(a)配置50×的人工胃液母液，称取0.1g氯化钠、0.175g胃蛋白酶，溶于1ml超纯水中，混匀过滤备用。
(b)配置10×的人工肠液母液，称取0.68g磷酸二氢钾、0.1g胰蛋白酶，溶于10ml超纯水中，氢氧化钠调pH7.8。
(c)取400μl溶液(由3.7配制)与8.17μl人工胃液母液混合，另作一组8.17μl 50×的人工胃液缓冲液(0.1g/ml氯化钠)与400μl溶液混合的空白对照，试验组与对照组共同做以下处理，调pH至2.5，37℃水浴2h，调pH至7.5，添加2.9μl浓度为10mg/ml的胃蛋白酶抑制剂(工作浓度0.7μg/ml)，37℃水浴30min，HPLC测定含量，每个样品做3组平行实验。胃蛋白酶论终浓度为3.5mg/ml，胃蛋白酶抑制剂理论终浓度为0.7μg/ml。
(d)取400μl溶液(由3.7配制)与44.45μl人工肠液母液混合，另作一组44.45μl10×人工肠液缓冲液(0.02g/ml氯化钠,0.11g/ml碳酸氢钠,0.18g/ml胆盐)与400μl溶液混合的空白对照，试验组与对照组共同做以下处理，调pH至8.0，37℃水浴2h，调pH至7.5，添加0.85μl浓度为5mg/ml的胰蛋白酶抑制剂(工作浓度0.1μg/ml)，37℃水浴30min，HPLC测定含量，每个样品做3组平行实验。胰蛋白酶论终浓度为1mg/ml，胃蛋白酶抑制剂理论终浓度为0.1μg/ml。
(2)检测结果
人工胃液对突变体的降解率为1.7％，人工肠液对突变体的降解率为9.3％，比野生型略有提高(表8)，但仍属于耐受范围。
表8耐胃蛋白酶、胰蛋白酶试验结果
突变体 MccJ25 突变体
对照1 50.99±1.47 111.96±1.65
人工胃液 50.63±0.24 110.09±1.66
人工胃液降解率(％) 0.7 1.7
对照2 46.77±0.96 107.57±1.00
人工肠液 42.99±0.61 97.51±1.40
人工肠液降解率(％) 8.1 9.3
注：数据单位为μg/ml，“对照1”表示人工胃液对照，“对照2“表示人工肠液对照，MccJ25为野生型。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 申请人
<120> MccJ25高水溶性突变体及其制备方法和应用
<130> 2020-10-27
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Gly Gly Ala Gly His Val Pro Glu Tyr Phe Val Gly Pro Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ile Ser Phe Tyr Gly
20
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggtggtgcag gacatgtgcc tgagtatttt gtggggccgg gtggacctat atctttctat 60
ggc 63
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
agtattttgt ggggccgggt ggacctatat ctt 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agtattttgt ggggccgggt ggacctatat ctt 33

Claims (10)

1.提高MccJ25水溶性的方法，其特征在于，将MccJ25表面第二个疏水区域内残基I13、T15分别突变为P和G小侧链氨基酸。
2.权利要求1所述的方法制备的MccJ25突变体，其特征在于，所述MccJ25突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示及其同一性大于90％的序列。
3.编码权利要求2所述的MccJ25突变体的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.包含权利要求3所述的核苷酸序列的重组质粒。
5.包含权利要求4所述的重组质粒的大肠杆菌。
6.根据权利要求5所述的大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌DH5α为宿主，pUC57为表达载体。
7.权利要求2所述的MccJ25突变体在制备液体制剂中的水相的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述液体制剂包括水溶性兽药、膏状或乳状化妆品。
9.一种抑菌成份浓度可调的水相，其特征在于，所述抑菌成份含有权利要求2所述的MccJ25突变体，所述MccJ25突变体的浓度为0.01-35.83mg/ml。
10.根据权利要求9所述的水相，其特征在于，所述MccJ25突变体的浓度为33.90-35.83mg/ml。
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