CN113069554A - 一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法及其应用 - Google Patents

一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及齐墩果酸季铵盐‑肝素‑壳聚糖纳米粒的制备方法及其应用，有效解决齐墩果酸季铵盐‑肝素‑壳聚糖纳米粒的制备，实现在制备抗炎、降压、抗癌、抗菌药物中的应用，提高药物吸收率和疗效问题，齐墩果酸用溶剂溶解，加入N,N‑二异丙基乙胺、1‑乙基‑3(3‑二甲基丙胺)碳二亚胺和1‑羟基苯并三唑，超声反应，加入N,N‑二甲基乙二胺，酰胺化反应，得中间体化合物，有机溶剂溶解，加入无机碱和碘甲烷，得齐墩果酸季铵盐溶于甲醇，加入肝素去离子水溶液，搅拌过夜，蒸发为薄膜，水化薄膜，探针超声，离心，上清液过滤，得齐墩果酸季铵盐‑肝素纳米粒溶液，滴加到壳聚糖醋酸溶液中，离心，上清液过滤，得齐墩果酸季铵盐‑肝素‑壳聚糖纳米粒。

Description

一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法及其 应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法及其应用。
背景技术
齐墩果酸( oleanolic acid，OA)为齐墩果烷型五环三萜类化合物，是一种天然植物提取物，以游离形式或与糖结合成苷形式广泛分布于自然界，存在于木犀科植物齐墩果的叶、女贞果实；龙胆科植物川西獐牙菜、青叶胆全草；伞形科植物大星芹的叶和根；五加科植物德木的根皮及茎皮；葫芦科植物大籽雪胆、可爱雪胆、中华雪胆（金龟莲、罗锅底）的块根中。具有保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化、调节免疫等多种药理作用。OA的水溶性小，口服吸收差，但鉴于其确切的药理作用，国内外学者对其修饰做了大量的研究工作。将OA作先导化合物，来合成OA的衍生物，并通过研究所得衍生物来筛选和发掘生物活性潜力更大的物质。齐墩果酸的五环三萜骨架的刚性较强，同时结构中缺少水溶性片段，因此导致其水溶性较差，而水溶性较差则直接影响生物利用度和生物活性。纳米技术可以提高药物溶解度，稳定性，生物利用度等，近年来研究表明齐墩果酸其衍生的制剂可通过调节细胞内线粒体信号通路发挥抗乳腺癌活性。肝素（Heparin，HEP）是生理pH下表现负电性的聚阴离子多糖，线性糖链中的磺酸基和羧基通过静电相互作用能够与显正电性的化合物结合，譬如肝素与带正电荷的小檗碱或阿霉素形成复合物。壳聚糖(Chitosan，CS)是与哺乳动物细胞具有良好生物相容性的天然材料，由带阳离子的氨基葡萄糖残基组成多糖链。在肝素或壳聚糖纳米颗粒内引入疏水药物，可以确保低水溶性药物发挥抗肿瘤作用。针对齐墩果酸水溶性差，生物利用度低等，很难实现对肿瘤的有效治疗。基于聚阳离子和阴离子载体的前药递送系统，可以用于提高难溶性药物的溶解度。因此设计并合成一种齐墩果酸的前药，采用肝素和壳聚糖作为前药的载体构建纳米粒子，期望改善其吸收效率，提高其抗肿瘤药效是非常必要的，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备方法及其应用，可有效解决齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备，实现在制备抗炎、降压、抗癌、抗菌药物中的应用，提高药物吸收率和疗效问题。
本发明解决的技术方案是，一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备方法，包括以下步骤：
（1）、中间体化合物（QDN）的制备：
首先将齐墩果酸（OA）溶解在有机溶剂中，然后加入N,N-二异丙基乙胺(N-Ethyldiisopropylamine，简写DIPEA)、1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride)，简写EDCI）和1-羟基苯并三唑(1-Hydroxybenzotriazole，简写HOBT)，超声辅助溶解使溶液澄清，室温或冰浴搅拌反应8～12小时；再加入N,N-二甲基乙二胺(N,N-Dimethylethylenediamine)，发生酰胺化反应，反应温度为0～25℃，搅拌反应12～24小时，摩尔用量比为齐墩果酸︰1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺︰1-羟基苯并三唑︰N,N-二异丙基乙胺︰N,N-二甲基乙二胺＝1︰1.2-3︰1.2-3︰1.2-3︰1.2-3，得齐墩果酸酰胺化的中间体化合物（Oleanolic acid texamine derivative，QDN）；
所述的有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇中的一种或两种以上任意体积比的混合物；
（2）、齐墩果酸季铵盐（QDT）的制备：
将中间体化合物（QDN）溶解在有机溶剂中，然后加入干燥的无机碱和碘甲烷（CH3I），摩尔用量比为中间体化合物︰无机碱︰碘甲烷＝1∶1.5∶3-5，反应温度50～100℃，避光搅拌反应4～12小时，得齐墩果酸季铵盐（Oleanolic acid quaternary ammonium saltderivative，QDT）；
所述的无机碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸氢钠中的一种；
（3）、齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEP NPs）溶液的制备：
齐墩果酸季铵盐（QDT）和肝素（HEP）分别溶于甲醇和去离子水中，室温下齐墩果酸季铵盐溶液滴加到肝素溶液中，齐墩果酸季铵盐（QDT）︰肝素（HEP）的质量比为4～12︰4～12，搅拌过夜8-12h，37℃减压旋转蒸发为薄膜，用去离子水水化薄膜，探针超声处理5min，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEP NPs）溶液；
（4）、齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备：
将齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEP NPs）溶液滴加到壳聚糖（CS）醋酸溶液中，质量比齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒︰壳聚糖＝16︰0.1～0.8，搅拌2h，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得表面修饰壳聚糖的聚电解质纳米粒溶液，浓缩干燥，得齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）；
所述的壳聚糖醋酸溶液pH6.0。
齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）具有诱导癌细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞活性，可有效用于制备抗炎、降压、抗癌、抗菌药物。
本发明方法新颖独特，易操作，高效可控，产品稳定性好，开拓了制备抗炎、降压、抗癌、抗菌药物的新途径，是药物上的一大创新，有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的体外稳定性对比图。
图2为本发明齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒和游离齐墩果酸季铵盐（QDT）对4T1细胞的毒性试验对比图。
图3为本发明(a)测量的肿瘤体积变化(b)治疗期间小鼠体重变化(c)肿瘤平均重量(d)肿瘤抑制率图。
图4为本发明齐墩果酸酰胺化的中间体化合物的氢谱数据图。
图5为本发明齐墩果酸季铵盐（QDT）的氢谱数据图。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备方法，包括以下步骤：
（1）、中间体化合物（QDN）的制备：
首先将齐墩果酸溶解在有机溶剂四氢呋喃中，然后加入N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，超声辅助溶解使溶液澄清，室温搅拌反应10小时；再加入N,N-二甲基乙二胺，发生酰胺化反应，反应温度为12℃，搅拌反应18小时，摩尔用量比为齐墩果酸︰1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺︰1-羟基苯并三唑︰N,N-二异丙基乙胺︰N,N-二甲基乙二胺＝1︰2︰2︰2︰2，得齐墩果酸酰胺化的中间体化合物（QDN）；
（2）、齐墩果酸季铵盐（QDT）的制备：
将中间体化合物（QDN）溶解在有机溶剂四氢呋喃中，然后加入干燥的无机碱碳酸钾和碘甲烷（CH3I），摩尔用量比为中间体化合物︰碳酸钾︰碘甲烷＝1∶1.5∶4，反应温度75℃，避光搅拌反应4～12小时，得齐墩果酸季铵盐（QDT）；
（3）、齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEP NPs）溶液的制备：
齐墩果酸季铵盐（QDT）和肝素（HEP）分别溶于甲醇和去离子水中，室温下齐墩果酸季铵盐溶液滴加到肝素溶液中，齐墩果酸季铵盐（QDT）︰肝素（HEP）的质量比为8︰8，搅拌过夜10h，37℃减压旋转蒸发为薄膜，用去离子水水化薄膜，探针超声处理5min，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEPNPs）溶液；
（4）、齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备：
将齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEP NPs）溶液滴加到壳聚糖（CS）醋酸溶液中，质量比齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒︰壳聚糖＝16︰0.4，搅拌2h，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得表面修饰壳聚糖的聚电解质纳米粒溶液，浓缩干燥，得齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）。
实施例2
本发明一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备方法，包括以下步骤：
（1）、中间体化合物（QDN）的制备：
首先将齐墩果酸（OA）溶解在有机溶剂甲醇中，然后加入N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，超声辅助溶解使溶液澄清，冰浴搅拌反应11小时；再加入N,N-二甲基乙二胺，发生酰胺化反应，反应温度为10℃，搅拌反应20小时，摩尔用量比为齐墩果酸︰1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺︰1-羟基苯并三唑︰N,N-二异丙基乙胺︰N,N-二甲基乙二胺＝1︰1.3︰1.3︰1.3︰1.3，得齐墩果酸酰胺化的中间体化合物（Oleanolic acid texamine derivative，QDN）；
（2）、齐墩果酸季铵盐（QDT）的制备：
将中间体化合物（QDN）溶解在有机溶剂甲醇中，然后加入干燥的无机碱碳酸铯和碘甲烷（CH3I），摩尔用量比为中间体化合物︰碳酸铯︰碘甲烷＝1∶1.5∶3，反应温度60℃，避光搅拌反应11小时，得齐墩果酸季铵盐（Oleanolic acid quaternary ammonium saltderivative，QDT）；
（3）、齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEP NPs）溶液的制备：
齐墩果酸季铵盐（QDT）和肝素（HEP）分别溶于甲醇和去离子水中，室温下齐墩果酸季铵盐溶液滴加到肝素溶液中，齐墩果酸季铵盐（QDT）︰肝素（HEP）的质量比为4.5︰4，搅拌过夜8h，37℃减压旋转蒸发为薄膜，用去离子水水化薄膜，探针超声处理5min，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEPNPs）溶液；
（4）、齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备：
将齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEP NPs）溶液滴加到壳聚糖（CS）醋酸溶液中，质量比齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒︰壳聚糖＝16︰0.2，搅拌2h，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得表面修饰壳聚糖的聚电解质纳米粒溶液，浓缩干燥，得齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）。
实施例3
本发明一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备方法，包括以下步骤：
（1）、中间体化合物（QDN）的制备：
首先将齐墩果酸（OA）溶解在有机溶剂中，然后加入N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，超声辅助溶解使溶液澄清，室温搅拌反应9小时；再加入N,N-二甲基乙二胺，发生酰胺化反应，反应温度为23℃，搅拌反应13小时，摩尔用量比为齐墩果酸︰1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺︰1-羟基苯并三唑︰N,N-二异丙基乙胺︰N,N-二甲基乙二胺＝1︰2.9︰2.9︰2.9︰2.9，得齐墩果酸酰胺化的中间体化合物（QDN）；
所述的有机溶剂为体积比二氯甲烷︰三氯甲烷=1︰1的混合物；
（2）、齐墩果酸季铵盐（QDT）的制备：
将中间体化合物（QDN）溶解在有机溶剂中，然后加入干燥的无机碱碳酸氢钠和碘甲烷（CH3I），摩尔用量比为中间体化合物︰碳酸氢钠︰碘甲烷＝1∶1.5∶5，反应温度90℃，避光搅拌反应5小时，得齐墩果酸季铵盐（QDT）；
（3）、齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEP NPs）溶液的制备：
齐墩果酸季铵盐（QDT）和肝素（HEP）分别溶于甲醇和去离子水中，室温下齐墩果酸季铵盐溶液滴加到肝素溶液中，齐墩果酸季铵盐（QDT）︰肝素（HEP）的质量比为6︰8，搅拌过夜12h，37℃减压旋转蒸发为薄膜，用去离子水水化薄膜，探针超声处理5min，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEPNPs）溶液；
（4）、齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备：
将齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒（QDT-HEP NPs）溶液滴加到壳聚糖（CS）醋酸溶液中，质量比齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒︰壳聚糖＝16︰0.1，搅拌2h，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得表面修饰壳聚糖的聚电解质纳米粒溶液，浓缩干燥，得齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）。
实施例4
本发明一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备方法，其中中间体化合物（QDN）的制备，称取齐墩果酸200mg（0.4mmol）、HOBT 180mg（1.3mmol）、EDCI 250mg（1.3mmol）于单口瓶中，滴加DIPEA 200μL（1.3mmol），CH2Cl2 5mL超声溶解，冰水浴下搅拌8h；薄层色谱（TLC）监测反应进程，展开剂：二氯甲烷︰甲醇＝15︰1，显色剂：质量浓度10%硫酸-乙醇溶液，待原料点消失，滴加N,N-二甲基乙二胺130μL（1.2mmol），室温反应，待活化点消失，停止反应，减压旋蒸除去溶剂，粗产物用乙酸乙酯溶解，并用等体积的饱和NaCl水溶液萃取3次，旋转蒸发仪浓缩得白色油状物，经快速色谱系统，用体积比的石油醚︰乙酸乙酯＝5︰1分离纯化，经离心浓缩仪蒸除溶剂，真空干燥得白色固体的齐墩果酸酰胺化的中间体化合物（Oleanolic acid texamine derivative，QDN），101.5mg，产率43.9%。
实施例5
本发明一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒（QDT-HEP-CS NPs）的制备方法，其中齐墩果酸季铵盐（QDT）的制备，精密称取齐墩果酸酰胺化的中间体化合物（QDN）100mg（0.19mmol），用2mL MeOH溶解，加入K2CO3 31.5mg（0.22mmol），然后滴加碘甲烷35.5μL（0.57mmol），70℃回流反应，薄层色谱监测反应进程，展开剂：二氯甲烷︰甲醇＝5︰1，显色剂：质量浓度10%硫酸-乙醇，待原料点消失，停止反应；反应液过滤，减压蒸发除去溶剂，得白色油状物；用体积比乙腈︰纯水＝90︰10半制备液相分离纯化，经试管浓缩仪挥去溶剂，乙醚重结晶，真空干燥得白色固体的齐墩果酸季铵盐（Oleanolic acid quaternaryammonium salt derivative，QDT），112.7mg，产率88.7%。
步骤（3）所述的齐墩果酸季铵盐（QDT）︰肝素（HEP）的质量比还为4.5︰6、4.5︰8、4.5︰10、4.5︰12；4︰8、10︰8或12︰8；
步骤（4）所述的齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒︰壳聚糖的质量比还为16︰0.7或16︰0.8。
要指出的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明的具体实施方式，并非对本发明技术方案请求保护范围的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，凡是变化或变动所作出的技术方案与本发明技术方案本质相同，均属于本发明技术方案的保护范围，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。
本发明实施例1-3产品经核磁共振谱仪进行鉴定，为相同产品，对小鼠乳腺癌4T1细胞具有明显的抗肿瘤作用，从而起到提高齐墩果酸治疗乳腺癌的疗效，相关资料如下：
1、齐墩果酸酰胺化的中间体化合物（QDN）的结构表征：C34H58N2O2，1H-NMR (500MHz, CDCl3)谱显示：δ H 5.38 (1H, br.s, H-12)为一双键上氢质子，δ H 3.23 (1H, t, J=2.7 Hz, H-3)为连氧碳上的氢，δ H 0.75 ~ 1.2之间出现 7 个甲基氢质子，δ H 2.58 (1H,dd, J=14.1, 5 Hz, H-18)，δ H 1.0 ~ 2.1 之间出现多个 CH、CH2 氢信号，δ H 3.38 (2H,t, J = 11.4, 4.3 Hz), δ H 2.54~2.45 (t, 2H)为乙二胺侧链上的氢质子，δ H 2.33 (s,6H)为氮原子上的甲基氢质子。
2、齐墩果酸季铵盐（QDT）的结构表征：C35H61N2O2I，分子量为668.3778，1H-NMR(500 MHz, MeOH)谱显示：δ H 5.41 (1H, br.s, H-12)为一双键上氢质子，δ H 3.23 (1H,t, J=2.7 Hz, H-3)为连氧碳上的氢，δ H 0.75~1.2之间出现 7 个甲基氢质子，δ H 2.83(1H, dd, J=13.4, 4.4 Hz, H-18)，δ H 1.0~2.1 之间出现多个 CH、CH2 氢信号，δ H 3.64(2H, t, J = 13.9, 7.0 Hz), δ H 3.45 (t, 2H)为侧链乙二胺基上的氢质子，δ H 3.23(s, 9H)为氮原子上的甲基氢质子。
3、QDT-HEP-CS NPs的粒径、载药量和包封率
使用纳米粒度与 Zeta 电位仪测量纳米颗粒（QDT-HEP NPs 或 QDT-HEP-CS NPs）的粒径、多分散系数和 Zeta 电位。利用高效液相色谱法测定纳米粒的药物含量，并将纳米粒冻干测得其总质量，计算其载药量和包封率。高效液相条件：色谱柱：X Select HSS T 3柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；检测波长：210 nm；流动相：乙腈：水=90：10（V：V）；流速：1.0mL-min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。
表1 QDT-HEP 纳米粒子的粒径，Zeta电位，包封率和载药量（n=3）
QDT: HEP 粒径(nm) 聚合物分散性指数（PDI） Zeta电位(mV) 包封率 (%) 载药量(%)
4.5:4.0 124.30±0.10 0.201±0.005 -52.87±0.67 50.3±0.4 65.8±0.5
4.5:6.0 168.83±2.25 0.192±0.008 -45.34±2.51 57.7±0.8 47.2±0.6
4.5:8.0 158.23±1.29 0.185±0.012 -38.48±0.49 63.4±0.9 31.1±0.5
4.5:10.0 185.57±4.58 0.208±0.009 -44.55±2.07 58.4±0.3 27.2±0.2
4.5:12.0 190.91±6.43 0.219±0.014 -54.88±4.38 54.3±1.1 21.1±0.4
表2 QDT-HEP 纳米粒子的粒径，Zeta电位，包封率和载药量（n=3）
QDT: HEP 粒径(nm) 聚合物分散性指数（PDI） Zeta 电位(mV) 包封率 (%) 载药量 (%)
4.0:8.0 160.35±2.19 0.219±0.017 -62.28±1.04 70.8±4.0 36.8±2.1
6.0:8.0 200.29±0.58 0.182±0.022 -50.47±3.18 66.0±5.8 53.2±0.1
8.0:8.0 172.99±0.36 0.169±0.014 -39.96±3.83 56.4±2.5 56.4±2.5
10.0:8.0 182.78±0.30 0.203±0.007 -55.87±0.55 56.0±2.1 63.5±2.3
12.0:8.0 181.22±1.51 0.196±0.008 -53.26±1.93 56.4±1.7 77.8±2.4
表3 QDT-HEP-CS 纳米粒子的粒径，Zeta电位，包封率和载药量（n=3）
QDT-HEP NPs:CS 粒径(nm) 聚合物分散性指数（PDI） Zeta 电位(mV) 包封率(%) 载药量(%)
16:0.1 150.45±0.68 0.186±0.006 -35.01±4.38 53.1±0.6 36.0±0.3
16:0.2 217.31±1.30 0.248±0.007 -34.29±0.18 54.7±0.1 36.4±0.1
16:0.4 <sup>a</sup> <sup>a</sup> <sup>a</sup> <sup>a</sup> <sup>a</sup>
16:0.8 <sup>a</sup> <sup>a</sup> <sup>a</sup> <sup>a</sup> <sup>a</sup>
a 表示观察到聚沉.
4、透射电子显微镜图像
使用透射电镜观察不同组成的纳米粒子（QDT-HEP NPs或QDT-HEP-CS NPs）的形貌。纳米粒子溶液在铜网上沉积5分钟，滤纸吸去水分，2%磷钨酸溶液负染色，室温下自然晾干，样品置于透射电镜下观察并拍摄照片。结果如下：
QDT-HEP和QDT-HEP-CS质量比为8.0：8.0以及8.0：8.0：0.1时，对QDT纳米粒的透射电镜图像分析显示均表现为粒径相对均匀的螺旋带，然而质量比为8.0：8.0：0.1时，纳米粒表现出更紧致的聚集。在电镜下2种纳米粒的粒径均小于在水环境中测得的粒径。这是因为弱作用力导致粒子表面在水中均匀伸展，而电镜晾干制样导致粒子发生少许皱缩。比较NPs的图像，表明QDT在甲醇水溶液中与肝素发生了静电吸附以及氢键和疏水相互作用等非共价作用驱动的自组装行为，然后醋酸水溶液中的壳聚糖在静电吸附作用下沉积于QDT-HEPNPs表面，QDT-HEP NPs的柔性螺旋转变为QDT-HEP-CS NPs刚性化的带状结构。
5、体外稳定性实验
将QDT-HEP NPs和QDT-HEP-CS NPs与1.8%的NaCl、PBS（2×）和10%葡萄糖（glucose，glu）(1:1，v-v)混合，与RPMI 1640基础培养液、胎牛血清+1640完全培养液、人工胃液、人工肠液和大鼠血浆(1:4，v-v)混合，37℃孵育。24小时后取样测量粒径大小。结果如下：
纳米粒在37℃孵育24h后，其在大鼠血清和1640培养基中粒径变小，混合溶液没有任何浑浊、沉淀现象，说明纳米粒在上述液体环境中可以稳定存在。虽然在不同的溶液中孵育，但QDT-HEP-CS NPs中粒径的变化不明显，提示NPs可用于静脉给药。然而在10%胎牛血清的1640培养基中粒径增大到390nm，说明细胞实验中不能用完全培养基将纳米粒溶液稀释至一系列浓度。在人工胃液、人工肠液中纳米粒粒径增大，说明QDT-HEP NPs在人工胃肠液中不能稳定存在，不可口服给药，但QDT-HEP-CS NPs可做成肠溶制剂。纳米粒在PBS中粒径增大趋势不明显，但是无沉淀现象；而在生理盐水中粒径大于1000nm，说明纳米粒在PBS中稳定性一般。
6、细胞毒性实验
以游离组QDT为对照，测定纳米组QDT-HEP-CS NPs的细胞毒性。以DMSO配制好的QDT溶液和QDT-HEP-CS NPs溶液用RPMI1640基础培养基稀释至终浓度为100、85、70、55、40、25、10μM-L，将4T1细胞与不同浓度的药物按100μL-孔混合，每组设置6个复孔，将无药物处理的细胞作为正常组，另设空白对照（仅有完全培养基）。加药后孵育12，24，48h。再添加5mg-mL的噻唑蓝20μL，继续培养4h后取出，小心移除96孔板内的上清液，加入150μL二甲基亚砜，轻微振荡10min，再在490nm波长下检测下吸光度。
纳米组QDT和游离组QDT均有时间依赖性和浓度依赖性的细胞毒性，但纳米组QDT表现出高度的细胞活力，明显高于实验预期。从4T1细胞的抑制率来看，游离QDT在高浓度下对4T1的抑制效果较明显。对于纳米组QDT-HEP-CS NPs，每个时间下药物对肿瘤细胞的抑制作用不强。与纳米组QDT相比，游离组QDT在前12小时表现出明显的毒性；与12小时相比，前药纳米粒子在24小时后表现出更高的细胞毒性，在48小时后纳米粒子毒性小于游离药物。相比游离组QDT，纳米组QDT对肿瘤细胞的抑制作用随时间变化不大。游离组QDT在给药24小时和48小时对肿瘤細胞的抑制作用优于纳米组QDT，纳米组药效明显下降，细胞数量明显回升。这说明前体药物水解在24小时已经水解完全。然而IC50表明不同时间QDT-HEP-CS NPs半数有效剂量要低于游离药组。
7、药效试验
取生长状态良好的4T1小鼠乳腺癌细胞，PBS调整为1×107mL细胞浓度。抽取上述浓度细胞0.1mL（约1×106个）接种于小鼠右侧倒数第4对乳腺皮下脂肪垫，建立荷瘤小鼠模型。以造模后第5天小鼠接种部位可触摸到结节为造模成功标准。当平均肿瘤体积长至约为50-60mm3，随机分成5组（n=10）开始给药，分别为模型组、QDT低剂量组、QDT-HEP-CS NPs低、中、高剂量组。根据人与小鼠等效剂量折算方法确定各组给药剂量分别为10，20，40mg-kg。每只小鼠腹腔注射剂量为200μL，隔天给药共7次。模型组给予相同剂量PBS。游离QDT的制备：将QDT粉末超声处理5分钟溶于由0.1%吐温-80、10%无水乙醇和PBS组成的混合溶液共10mL，实验前用PBS稀释一倍使用。每2天称量小鼠体重，观察并记录动物进食、活动状态及死亡情况，并用电子数显卡尺测量记录肿瘤宽度(W)和长度(L)，根据公式V=LW2-2计算肿瘤体积大小。给药14天后摘眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，剥离肿瘤，并称量肿瘤的重量，计算肿瘤生长抑制率（tumor growth inhibition,TGI）。TGI=（1-(治疗组平均肿瘤重量)-(对照组平均肿瘤重量)）×100%
用原位4T1荷瘤BALB-c小鼠评价QDT-HEP-CS NPs的体内抗肿瘤作用以及乳腺癌的增殖和转移。PBS对照组的肿瘤生长速度快。与PBS对照组相比，纳米组QDT 10mg-kg、20mg-kg、40mg-kg肿瘤体积增长速度均有显著差异，认为具有统计学意义(p<0.05)。纳米粒药物治疗组肿瘤体积增长慢于PBS对照组，能有效地抑制肿瘤的生长，而游离QDT组与对照组相比没有显著差异，不具有统计学意义。与PBS对照组比较，游离组QDT和纳米组QDT低、中、高剂量组的肿瘤重量有显著差异，认为具有统计学意义(p<0.05)。显示的平均肿瘤重量，游离QDT组、QDT-HEP-CS NPs组第15天为0.84±0.18g、0.66±0.09g、0.57±0.02g和0.47±0.02g，对照组为1.04±0.19g。QDT-HEP-CS NPs40mg-kg组的肿瘤最小，表明QDT-HEP-CSNPs 40mg-kg在所有治疗组中抗肿瘤效率最高。对不同分组的肿瘤生长抑制能力进行排列如下：QDT-HEP-CS NPs 40mg-kg>QDT-HEP-CS NPs20mg-kg>QDT-HEP-CS NPs 10mg-kg>游离QDT10mg-kg>PBS。与PBS组相比，游离组QDT抑制率约为20.25%，QDT-HEP-CS NPs 10、20、40mg-kg显示36.05%、41.67%和53.47%的肿瘤抑制率，显示出不同的肿瘤抑制效果。表明在整个实验中，纳米组QDT比游离组QDT显示出的抗肿瘤效果更好。
综上所述，本发明制得的齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒有良好的粒径和载药量，并且在大鼠血清介质中显示出良好的稳定性和载药量，载药量高达65%以上，包封率63%以上，具有很好的诱导癌细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞的活性。本发明齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒解决齐墩果酸水溶性差和生物利用度低等的问题，可有效用于制备抗炎、降压、抗癌、抗菌药物，开拓了抗炎、降压、抗癌、抗菌药物的新途径，是抗炎、降压、抗癌、抗菌药物上的一大创新，有显著的经济和社会效益。

Claims (9)

1.一种齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、中间体化合物的制备：
首先将齐墩果酸溶解在有机溶剂中，然后加入N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，超声辅助溶解使溶液澄清，室温或冰浴搅拌反应8～12小时；再加入N,N-二甲基乙二胺，发生酰胺化反应，反应温度为0～25℃，搅拌反应12～24小时，摩尔用量比为齐墩果酸︰1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺︰1-羟基苯并三唑︰N,N-二异丙基乙胺︰N,N-二甲基乙二胺＝1︰1.2-3︰1.2-3︰1.2-3︰1.2-3，得齐墩果酸酰胺化的中间体化合物；
所述的有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇中的一种或两种以上任意体积比的混合物；
（2）、齐墩果酸季铵盐的制备：
将中间体化合物溶解在有机溶剂中，然后加入干燥的无机碱和碘甲烷，摩尔用量比为中间体化合物︰无机碱︰碘甲烷＝1∶1.5∶3-5，反应温度50～100℃，避光搅拌反应4～12小时，得齐墩果酸季铵盐；
所述的无机碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸氢钠中的一种；
（3）、齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液的制备：
齐墩果酸季铵盐和肝素分别溶于甲醇和去离子水中，室温下齐墩果酸季铵盐溶液滴加到肝素溶液中，齐墩果酸季铵盐︰肝素的质量比为4～12︰4～12，搅拌过夜8-12h，37℃减压旋转蒸发为薄膜，用去离子水水化薄膜，探针超声处理5min，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液；
（4）、齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备：
将齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，质量比齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒︰壳聚糖＝16︰0.1～0.8，搅拌2h，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得表面修饰壳聚糖的聚电解质纳米粒溶液，浓缩干燥，得齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒；
所述的壳聚糖醋酸溶液pH6.0。
2.根据权利要求1所述的齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、中间体化合物的制备：
首先将齐墩果酸溶解在有机溶剂四氢呋喃中，然后加入N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，超声辅助溶解使溶液澄清，室温搅拌反应10小时；再加入N,N-二甲基乙二胺，发生酰胺化反应，反应温度为12℃，搅拌反应18小时，摩尔用量比为齐墩果酸︰1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺︰1-羟基苯并三唑︰N,N-二异丙基乙胺︰N,N-二甲基乙二胺＝1︰2︰2︰2︰2，得齐墩果酸酰胺化的中间体化合物；
（2）、齐墩果酸季铵盐的制备：
将中间体化合物溶解在有机溶剂四氢呋喃中，然后加入干燥的无机碱碳酸钾和碘甲烷，摩尔用量比为中间体化合物︰碳酸钾︰碘甲烷＝1∶1.5∶4，反应温度75℃，避光搅拌反应4～12小时，得齐墩果酸季铵盐；
（3）、齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液的制备：
齐墩果酸季铵盐和肝素分别溶于甲醇和去离子水中，室温下齐墩果酸季铵盐溶液滴加到肝素溶液中，齐墩果酸季铵盐︰肝素的质量比为8︰8，搅拌过夜10h，37℃减压旋转蒸发为薄膜，用去离子水水化薄膜，探针超声处理5min，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液；
（4）、齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备：
将齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，质量比齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒︰壳聚糖＝16︰0.4，搅拌2h，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得表面修饰壳聚糖的聚电解质纳米粒溶液，浓缩干燥，得齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒。
3.根据权利要求1所述的齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、中间体化合物的制备：
首先将齐墩果酸溶解在有机溶剂甲醇中，然后加入N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，超声辅助溶解使溶液澄清，冰浴搅拌反应11小时；再加入N,N-二甲基乙二胺，发生酰胺化反应，反应温度为10℃，搅拌反应20小时，摩尔用量比为齐墩果酸︰1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺︰1-羟基苯并三唑︰N,N-二异丙基乙胺︰N,N-二甲基乙二胺＝1︰1.3︰1.3︰1.3︰1.3，得齐墩果酸酰胺化的中间体化合物；
（2）、齐墩果酸季铵盐的制备：
将中间体化合物溶解在有机溶剂甲醇中，然后加入干燥的无机碱碳酸铯和碘甲烷，摩尔用量比为中间体化合物︰碳酸铯︰碘甲烷＝1∶1.5∶3，反应温度60℃，避光搅拌反应11小时，得齐墩果酸季铵盐；
（3）、齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液的制备：
齐墩果酸季铵盐和肝素分别溶于甲醇和去离子水中，室温下齐墩果酸季铵盐溶液滴加到肝素溶液中，齐墩果酸季铵盐︰肝素的质量比为4.5︰4，搅拌过夜8h，37℃减压旋转蒸发为薄膜，用去离子水水化薄膜，探针超声处理5min，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液；
（4）、齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备：
将齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，质量比齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒︰壳聚糖＝16︰0.2，搅拌2h，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得表面修饰壳聚糖的聚电解质纳米粒溶液，浓缩干燥，得齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒。
4.根据权利要求1所述的齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、中间体化合物的制备：
首先将齐墩果酸溶解在有机溶剂中，然后加入N,N-二异丙基乙胺、1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺和1-羟基苯并三唑，超声辅助溶解使溶液澄清，室温搅拌反应9小时；再加入N,N-二甲基乙二胺，发生酰胺化反应，反应温度为23℃，搅拌反应13小时，摩尔用量比为齐墩果酸︰1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺︰1-羟基苯并三唑︰N,N-二异丙基乙胺︰N,N-二甲基乙二胺＝1︰2.9︰2.9︰2.9︰2.9，得齐墩果酸酰胺化的中间体化合物；
所述的有机溶剂为体积比二氯甲烷︰三氯甲烷=1︰1的混合物；
（2）、齐墩果酸季铵盐的制备：
将中间体化合物溶解在有机溶剂中，然后加入干燥的无机碱碳酸氢钠和碘甲烷，摩尔用量比为中间体化合物︰碳酸氢钠︰碘甲烷＝1∶1.5∶5，反应温度90℃，避光搅拌反应5小时，得齐墩果酸季铵盐；
（3）、齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液的制备：
齐墩果酸季铵盐和肝素分别溶于甲醇和去离子水中，室温下齐墩果酸季铵盐溶液滴加到肝素溶液中，齐墩果酸季铵盐︰肝素的质量比为6︰8，搅拌过夜12h，37℃减压旋转蒸发为薄膜，用去离子水水化薄膜，探针超声处理5min，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液；
（4）、齐墩果酸季铵盐-肝素壳聚糖纳米粒的制备：
将齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒溶液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，质量比齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒︰壳聚糖＝16︰0.1，搅拌2h，10000rpm离心10min，取上清液，用0.45μm孔径的滤膜过滤，得表面修饰壳聚糖的聚电解质纳米粒溶液，浓缩干燥，得齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒。
5.根据权利要求1所述的齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的中间体化合物的制备，称取齐墩果酸200mg、HOBT 180mg、EDCI 250mg于单口瓶中，滴加DIPEA 200μL，CH2Cl2 5mL超声溶解，冰水浴下搅拌8h；薄层色谱监测反应进程，展开剂：二氯甲烷︰甲醇＝15︰1，显色剂：质量浓度10%硫酸-乙醇溶液，待原料点消失，滴加N,N-二甲基乙二胺130μL，室温反应，待活化点消失，停止反应，减压旋蒸除去溶剂，粗产物用乙酸乙酯溶解，并用等体积的饱和NaCl水溶液萃取3次，旋转蒸发仪浓缩得白色油状物，经快速色谱系统，用体积比的石油醚︰乙酸乙酯＝5︰1分离纯化，经离心浓缩仪蒸除溶剂，真空干燥得白色固体的齐墩果酸酰胺化的中间体化合物。
6.根据权利要求1所述的齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的齐墩果酸季铵盐的制备，精密称取齐墩果酸酰胺化的中间体化合物100mg，用2mLMeOH溶解，加入K2CO3 31.5mg，然后滴加碘甲烷35.5μL，70℃回流反应，薄层色谱监测反应进程，展开剂：二氯甲烷︰甲醇＝5︰1，显色剂：质量浓度10%硫酸-乙醇，待原料点消失，停止反应；反应液过滤，减压蒸发除去溶剂，得白色油状物；用体积比乙腈︰纯水＝90︰10半制备液相分离纯化，经试管浓缩仪挥去溶剂，乙醚重结晶，真空干燥得白色固体的齐墩果酸季铵盐。
7.根据权利要求1所述的齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的齐墩果酸季铵盐︰肝素的质量比还为4.5︰6、4.5︰8、4.5︰10、4.5︰12；4︰8、10︰8或12︰8。
8.根据权利要求1所述的齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的齐墩果酸季铵盐-肝素纳米粒︰壳聚糖的质量比还为16︰0.7或16︰0.8。
9.权利要求1-8所述方法制备的齐墩果酸季铵盐-肝素-壳聚糖纳米粒在制备抗炎、降压、抗癌、抗菌药物中的应用。
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