CN113040050A - 一种诱导紫果西番莲四倍体的培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导紫果西番莲四倍体的培育方法，包括如下步骤：(1)利用0mg/L～200mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行混培培养；(2)利用2mg/L～4mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行浸渍处理；(3)以秋水仙素诱导获得的四倍体叶片为试验材料，平均每个四倍体叶片分化出5‑7个不定芽；(4)以1/2MS+0.5mg/LIBA+0.2％炭粉进行生根诱导，将生根的无菌苗移至正常室内炼苗，对生根苗进行移栽。本发明的法利用诱变剂，采用混培和浸渍处理材料，获得变异体，即缩短了培育时间，又简化了培育的步骤，可为建立紫果西番莲种创新奠定基础。

Description

一种诱导紫果西番莲四倍体的培育方法
技术领域
本发明涉及苗木种质创新育的技术领域，具体涉及一种诱导紫果西番莲四倍体的培育方法。
背景技术
西番莲果汁有“饮料之王”的美誉，市场上西番莲果汁产品种类繁多，广受消费者欢迎，供不应求。但西番莲果汁在加工过程中存在籽多问题，增加了加工难度，加工过程繁琐。无籽果实的研究在一些植物中已取得成果，如无籽刺梨经选育驯化品种“贵农49号”，果径大、口感好，减少了加工过程的投入；三倍体无籽西瓜食用方便、品质优良、抗病耐涝、产量高且稳定、耐储运，深受消费者喜爱，种植面积不断扩大；三倍体无籽枸杞物候期早、生长势强、营养成分高、适应性强、便于深加工；无籽果实的优势显著，但目前国内并没有无籽紫果西番莲的报道，仅张琴等从西番莲胚乳诱导得到三倍体植株。本发明以紫果西番莲无菌苗叶片分化的不定芽作为研究材料，进行紫果西番莲多倍体的诱导研究，为西番莲多倍体研究提供技术支持，为解决紫果西番莲含籽量多问题提供解决途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，而提供了一种培育时间短的紫果西番莲四倍体苗木培育的方法。
为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种诱导紫果西番莲四倍体的培育方法，包括如下步骤：
(1)利用0mg/L～200mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行混培培养，处理15d后，转入未添加秋水仙素培养基中继续培养45d后，对不定芽进行流式细胞检测；
(2)利用2mg/L～4mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行浸渍处理，处理时间为3d-5d后，转入未添加秋水仙素培养基中培养45d后，对不定芽进行流式细胞检测；
(3)以秋水仙素诱导获得的四倍体叶片为试验材料，利用不同浓度配比的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和吲哚丁酸(IBA)进行分化培养，其中最适分化培养基配方为：MS+0.4mg/L吲哚丁酸(IBA)+1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)，分化率为80％，平均每个四倍体叶片分化出6个不定芽；
(4)以1/2MS培养基+0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.2％炭粉进行生根诱导，将生根的无菌苗移至正常室内炼苗，对生根苗进行移栽。
进一步地，在步骤(1)中，检测结果秋水仙素浓度为100mg/L时，四倍体的诱导率为17.5％-22.5％。
进一步地，在步骤(2)中，检测结果为利用3mg/L的秋水仙素处理4d时四倍体的诱导率为17.50％。
更进一步地，在步骤(2)中，处理时间为3d-5d。
进一步地，在步骤(3)中，其中最适分化培养基配方为：MS+0.4mg/L IBA+1.0mg/L6-BA，分化率为80％。
进一步地，在步骤(4)中，四倍体植株的主根长度为2.4cm-9.80cm，平均4.90cm；侧根长度2.6cm-3.50cm，平均2.93cm；生根率33.33％-66.67％，平均44.44％。
有益效果：本发明的法利用诱变剂，采用混培和浸渍处理材料，获得变异体，即缩短了培育时间，又简化了培育的步骤，可为建立紫果西番莲种创新奠定基础。本发明以紫果西番莲无菌苗不定芽为试验材料，采用秋水仙碱混培法和浸渍法处理不定芽，成功诱导出四倍体，为紫果西番莲倍性育种提供了新的途径。
附图说明
下面将结合附图进一步说明，附图中：
图1为本发明的混培处理的不定芽图；
图2为本发明的浸渍处理的不定芽的示意图；
图3为本发明的四倍体叶片分化不定芽图；
图4为本发明的生根苗移栽图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例1
本发明的一种诱导紫果西番莲四倍体的培育方法，包括如下步骤：
(1)利用200mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行混培培养，处理15d后，转入未添加秋水仙素培养基中继续培养45d后，对不定芽进行流式细胞检测；检测结果秋水仙素浓度为100mg/L时，四倍体的诱导率为22.5％。
(2)利用4mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行浸渍处理，处理时间为4d后，转入未添加秋水仙素培养基中培养45d后，对不定芽进行流式细胞检测；检测结果为利用3mg/L的秋水仙素处理4d时四倍体的诱导率为17.50％。处理时间为3d。
(3)以秋水仙素诱导获得的四倍体叶片为试验材料，利用不同浓度配比的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和吲哚丁酸(IBA)进行分化培养，其中最适分化培养基配方为：MS+0.4mg/L吲哚丁酸(IBA)+1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)，分化率为80％，平均每个四倍体叶片分化出6个不定芽；
(4)以1/2MS培养基+0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.2％炭粉进行生根诱导，四倍体植株的主根长度为2.4cm，平均4.90cm；侧根长度2.8cm，平均2.93cm；生根率66.67％，平均44.44％。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：
在步骤(1)中，利用10mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行混培培养，处理15d后，转入未添加秋水仙素培养基中继续培养45d后，对不定芽进行流式细胞检测；检测结果秋水仙素浓度为100mg/L时，四倍体的诱导率为17.5％。
在步骤(2)中，利用3mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行浸渍处理，处理时间为3d后，转入未添加秋水仙素培养基中培养45d后，对不定芽进行流式细胞检测；检测结果为利用3mg/L的秋水仙素处理4d时四倍体的诱导率为17.50％。处理时间为5d。
在步骤(3)中，以秋水仙素诱导获得的四倍体叶片为试验材料，利用不同浓度配比的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和吲哚丁酸(IBA)进行分化培养，其中最适分化培养基配方为：MS+0.4mg/L吲哚丁酸(IBA)+1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)，分化率为80％，平均每个四倍体叶片分化出5个不定芽；
在步骤(4)中，以1/2MS培养基+0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.2％炭粉进行生根诱导，四倍体植株的主根长度为9.80cm，平均4.90cm；侧根长度3.50cm，平均2.93cm；生根率33.33％，平均44.44％。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：
在步骤(1)中，利用0mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行混培培养，处理15d后，转入未添加秋水仙素培养基中继续培养45d后，对不定芽进行流式细胞检测；检测结果秋水仙素浓度为100mg/L时，四倍体的诱导率为20％。
在步骤(2)中，利用2mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行浸渍处理，处理时间为5d后，转入未添加秋水仙素培养基中培养45d后，对不定芽进行流式细胞检测；检测结果为利用3mg/L的秋水仙素处理4d时四倍体的诱导率为17.50％。处理时间为4d。
在步骤(3)中，以秋水仙素诱导获得的四倍体叶片为试验材料，利用不同浓度配比的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和吲哚丁酸(IBA)进行分化培养，其中最适分化培养基配方为：MS+0.4mg/L吲哚丁酸(IBA)+1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)，分化率为80％，平均每个四倍体叶片分化出7个不定芽；
在步骤(4)中，以1/2MS培养基+0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.2％炭粉进行生根诱导，四倍体植株的主根长度为7.80cm，平均4.90cm；侧根长度2.6cmcm，平均2.93cm；生根率56.67％，平均44.44％。
试验例1
1、首先配置含有1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)和0.2mg/L吲哚丁酸(IAA)的MS培养基，将其高温灭菌后趁还未凝固时分别加入50mg/L、100mg/L、200mg/L的秋水仙素，以未添加秋水仙素的培养基为对照处理。待培养基凝固后，把无菌苗继代增殖获得的不定芽接入培养基中。
采用混培法处理西番莲无菌苗不定芽第一周观察发现，不定芽均正常存活，部分处理出现污染情况。10天后发现除对照处理外，其余植株的叶片颜色均有浅绿色变成深绿色。培养15天后，对照处理的不定芽有长高趋势且叶片数也增加，秋水仙素处理不定芽的叶片变大，但无长高趋势，且浓度最大的处理材料的叶片有变黄现象。将经秋水仙素处理的材料接到正常培养基中继续培养，20天后秋水仙素浓度为100mg/L和200mg/L的处理部分叶片的叶脉变得更明显，且叶片边缘有卷曲，且植株有新的叶片长出。培养30天后发现，所有经秋水仙素处理的材料叶片均变宽，且颜色更深，秋水仙素浓度为100mg/L和200mg/L的处理植株的茎段变粗，叶片变宽且叶边缘有锯齿出现(图1)。经不同浓度的秋水仙素混培处理的西番莲不定芽在正常培养基中培养30天，其诱导结果见表1。此次试验诱导处理的480株材料中，共存活317株，其中经流式细胞仪检测倍性，变异植株有124株，四倍体植株有33株。混培法对紫果西番莲不定芽的变异影响如表1所示：
表1
Figure BDA0003019427280000051
注：表中的数据为平均值±标准误，不同小写字母表示在0.05水平上的差异显著性，下同。
2、先配置含有1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)的液体培养基，经高温高压灭菌后，在无菌操作台上分别加入浓度为2mg/L、3mg/L、4mg/L的秋水仙素。接着把含有秋水仙素的液体培养基倒入锥形瓶中，每200ml培养基倒3瓶。把前期无菌苗叶片分化出的1～2cm左右的不定芽接入锥形瓶中，然后将其放在摇床上分别摇3d、4d、5d，摇床的温度为28℃，转速为130rpm/min。处理结束后放至超净工作台上用无菌水冲洗3～5遍，然后把不定芽接入含有1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)和0.2mg/L吲哚丁酸(IAA)的MS培养基中继续培养。
采用浸渍法处理西番莲无菌苗叶片诱导出的不定芽，处理3天时从摇床上取出的不定芽，秋水仙素浓度不同时，不定芽的生长情况没有明显差异。用摇床浸渍处理4天后发现，含有高浓度秋水仙素的液体培养基颜色变黄，且部分不定芽有褐化现象。用摇床浸渍处理5天后发现，用低浓度秋水仙素处理的不定芽有长高现象，高浓度秋水仙素处理的不定芽无明显长高趋势且部分不定芽出现死亡现象。由此推测高浓度的秋水仙素不利于不定芽的生长，甚至能导致不定芽死亡。把从摇床上取出的不定芽用无菌水冲洗后，接入1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)和0.2mg/L吲哚丁酸(IAA)的MS培养基中继续培养，培养30天左右所有成活的不定芽均形成再生植株(图2)，所有经秋水仙素处理的不定芽形成的植株叶片颜色加深，经高浓度的秋水仙素长时间处理的不定芽形成的部分植株叶片边缘有锯齿出现，经低浓度的秋水仙素处理的不定芽形成的部分植株有腋芽长出。用4种不同浓度的秋水仙素浸渍处理紫果西番莲无菌苗的不定芽不同时间后，此次试验诱导处理的480株材料中，共存活347株，其中经流式细胞仪检测倍性，变异植株有115株，四倍体植株有14株，其诱导结果见表2。秋水仙素浓度一定时，处理时间越长，不定芽的死亡株数越多；处理时间相同时，秋水仙素浓度越大，不定芽的死亡株数越多，即不定芽的存活率随着秋水仙素浓度和处理时间的增大而减低。不定芽的变异率随着秋水仙素浓度的增加先增大后减小，不定芽的存活率随秋水仙素浓度的增加而减低，由此可见，高浓度的秋水仙素可增大不定芽变异几率，但不利于不定芽的存活。浸渍法对紫果西番莲不定芽的变异影响如表2所示：
表2
Figure BDA0003019427280000061
Figure BDA0003019427280000071
3、以经流式细胞仪检测为四倍体材料的叶片为试验材料，取出四倍体不定芽的叶片，去掉叶柄，并在叶脉上用手术刀划出伤口后，将叶片切成1cm×1cm左右的小块接入含有1mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)和不同浓度吲哚丁酸(IBA)的MS培养基中进行增殖培养。每周观察一次，统计最早发芽时间，30天后统计不定芽数及其生长状况。
带有伤口的四倍体叶片增殖培养一周天左右，少数叶片的伤口边缘开始出现绿色芽点，其它叶片出现卷曲现象，10天左右，部分叶片伤口边缘开始出现绿色芽点，继续进行增殖培养，30天左右，绿色芽点成长为小不定芽(如图3)。
可见1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)与不同浓度的吲哚丁酸(IBA)配合使用能使四倍体植株的叶片直接分化不定芽，但随着吲哚丁酸(IBA)浓度的不同，不定芽的诱导率及植株增殖率也不同，具体增殖结果见表3。处理2不定芽的诱导率较高，且平均每个叶片诱导的不定芽数较多，说明0.4mg/L的吲哚丁酸(IBA)与1mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)配合使用时，诱导出不定芽的叶片较多，且不定芽的分布较密集，说明该组合处理下，叶片整体诱导出的不定数最多。6-苄基腺嘌呤(6-BA)对四倍体的增殖结果如表3所示：
表3
Figure BDA0003019427280000072
Figure BDA0003019427280000081
4、以四倍体的植株为试验材料，去掉较大的叶片后，将植株接入不含有激素的MS培养基种继续培养20d左右。然后把不定芽接入添加0.2％炭粉以及0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)的1/2MS培养基中进行生根培养。每周观察一次，45天后统计生根情况。将生根的西番莲四倍体植株移到室内培养5d左右后，敞开培养瓶盖子继续练苗5d左右，将出生根苗取出用自来水冲洗干净，多菌灵浸泡10min后，用0.3mg/L吲哚丁酸(IBA)溶液浸泡30min。将生根苗移栽到基质中遮阴培养，移载基质使用红土：腐殖土：珍珠岩＝1:2:1比例混合。四倍体材料的生根结果如表4所示。四倍体材料主根有5-15根，平均8.7根；侧根4-13根，平均8.根3，主根长2.40-9.80cm，平均4.90cm；侧根长2.60cm-3.5c0m，平均2.93cm，生根率为33.33％-66.67％，平均44.44％。
表4
Figure BDA0003019427280000082
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种诱导紫果西番莲四倍体的培育方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)利用0mg/L～200mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行混培培养，处理15d后，转入未添加秋水仙素培养基中继续培养45d后，对不定芽进行流式细胞检测；
(2)利用2mg/L～4mg/L的秋水仙素对紫果西番莲不定芽进行浸渍处理，处理时间为3d-5d后，转入未添加秋水仙素培养基中培养45d后，对不定芽进行流式细胞检测；
(3)以秋水仙素诱导获得的四倍体叶片为试验材料，利用不同浓度配比的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和吲哚丁酸(IBA)进行分化培养，平均每个四倍体叶片分化出6个不定芽；
(4)以1/2MS培养基+0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.2％炭粉进行生根诱导将生根的无菌苗移至正常室内炼苗，对生根苗进行移栽。
2.根据权利要求1所述的诱导紫果西番莲四倍体的培育方法，其特征在于：在步骤(1)中，检测结果秋水仙素浓度为100mg/L时，四倍体的诱导率为17.5％-22.5％。
3.根据权利要求1所述的诱导紫果西番莲四倍体的培育方法，其特征在于：在步骤(2)中，检测结果为利用3mg/L的秋水仙素处理4d时四倍体的诱导率为17.50％。
4.根据权利要求1所述的诱导紫果西番莲四倍体的培育方法，其特征在于：在步骤(2)中，处理时间为3d-5d。
5.根据权利要求1所述的诱导紫果西番莲四倍体的培育方法，其特征在于：在步骤(3)中，其中最适分化培养基配方为：MS+0.4mg/L IBA+1.0mg/L 6-BA，分化率为80％。
6.根据权利要求1所述的诱导紫果西番莲四倍体的培育方法，其特征在于：在步骤(4)中，四倍体植株的主根长度为2.4cm-9.80cm，平均4.90cm；侧根长度2.6cm-3.50cm，平均2.93cm；生根率33.33％-66.67％，平均44.44％。
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张琴: "利用染色体工程培育多倍体西番莲（Passiflora edulis）的技术研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》 *

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