CN113030291A - 益母草注射液的hplc-elsd特征图谱及其建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种益母草注射液的HPLC‑ELSD特征图谱及其建立方法。按照本发明方法建立的益母草注射液的HPLC‑ELSD特征图谱的共有特征峰包含以下1～4号峰中的3个或4个：以2号峰为参照峰，1号峰相对保留时间0.80±0.05，2号峰相对保留时间1.00±0.05，3号峰相对保留时间1.08±0.05，4号峰相对保留时间1.30±0.05。本发明提供的益母草注射液的HPLC‑ELSD特征图谱建立方法精密度、重复性好，耐用性佳，利用该HPLC‑ELSD特征图谱能够对益母草注射液中不带紫外显色基团的糖及糖醇类物质进行有效的质量控制，使制剂更加稳定、可控。本发明建立的益母草注射液的HPLC‑ELSD特征图谱为益母草注射液提供了一种新的质量控制方法。

Description

益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱及其建立方法

技术领域

本发明属于注射制剂质量控制领域，具体涉及益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱及其建立方法。

背景技术

益母草注射液是一种治疗妇产科疾病的临床常用中药。研究表明，孕妇流产后采用益母草注射液能减少产后出血，因为益母草注射液作为收缩子宫药，它具有十分强烈的兴奋子宫平滑肌的作用，用于流产患者有助于恢复再生其子宫内膜的创伤，减少患者阴道的出血量和缩短出血的时间；此外，益母草注射液还具有治疗痛经的作用，能治疗月经期偏头痛。

益母草注射液的主要有效成分为总生物碱，根据物质基础研究结果表明，益母草注射液中总生物碱主要由盐酸水苏碱和氯化胆碱组成，其中盐酸水苏碱约占生物碱总量的90％。根据《卫生部药品标准中药成方制剂第二十册》，益母草注射液每支(1mL)含总生物碱以盐酸水苏碱(C₇H₁₃NO₂·HCl)计算，应为18～22mg。

由于益母草注射液中所含成分复杂，使益母草注射液的稳定性和可控性较差，不同药材、成品批次不同，质量也有较大的浮动。除总生物碱碱外，益母草注射液还包含很多其他已知或未知的成分。因此，单一成分含量测定不足以说明益母草注射液的质量，亦缺乏专属性。

中药指纹图谱是指某种(或某产地)中药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材或中成药药物特性的共有峰的图谱。根据质量控制目的，可分为指纹图谱和特征图谱。特征图谱是选取图谱中某些重要的特征信息，作为控制中药质量的重要鉴别手段。特征图谱能较为全面地反映其所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价；它既能全面反映中药个体之间的共性，亦能反映中药种群之间的唯一性。因此，运用特征图谱控制益母草注射液的质量，可以为益母草注射液的质量控制提供更全面的质量控制手段。

文献(姜卫东等，益母草药材与益母草注射液HPLC特征图谱相关性研究，药物分析杂志，2008，28(11))公开了一种益母草注射液特征图谱建立方法，该方法应用反向HPLC色谱法，采用AichromBond-AQ-C₁₈(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，以0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(pH 5.5)为流动相，流速1.0mol/L，检测波长242nm。但是，该文献报道的HPLC特征图谱建立方法中采用的检测器为紫外分光光度计，利用该HPLC特征图谱，只能对益母草注射液中带紫外显色基团的物质进行质量控制，无法对益母草注射液中其余不带紫外显色基团的物质进行有效的质量控制。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种益母草注射液HPLC-ELSD特征图谱及其建立方法，该HPLC-ELSD特征图谱中的共有特征峰为益母草注射液中不带紫外显色基团的糖及糖醇类物质的特征峰，利用该HPLC-ELSD特征图谱能够对益母草注射液中不带紫外显色基团的糖及糖醇类物质进行有效的质量控制，使制剂更加稳定、可控。

本发明提供了一种益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱的建立方法，所述方法利用高效液相色谱仪和蒸发光散射检测器检测，具体包括以下步骤：

(1)制备供试品溶液：取益母草注射液，即得；

(2)取供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，得到益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱；

检测条件如下：

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES；

流动相：由A相B相组成，其中，A相为乙腈，B相为水；

检测器：蒸发光散射检测器。

进一步地，步骤(2)中，所述A相与B相的体积比为(75～80)：(20～25)；所述检测的流速为0.8～1.2mL/min；所述检测的柱温为25～35℃；

和/或，所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为100～110℃，气体流量为2.0～3.0L/min。

进一步地，步骤(2)中，所述A相与B相的体积比为77：23；所述检测的流速为1.0mL/min；所述检测的柱温为30℃；

和/或，所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为105℃，气体流量为2.5L/min。

进一步地，所述高效液相色谱仪为Thermo Dionex U3000，所述蒸发光散射检测器为Alltech 6000ELSD。

进一步地，所述步骤还包括取对照品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，所述对照品为D-阿拉伯糖醇或其对映异构体、果糖或其对映异构体、D-甘露糖醇或其对映异构体中的一种或多种。

本发明还提供了一种益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱，它是按照上述的方法构建的，它的共有特征峰包含以下1～4号峰中的3个或4个：以2号峰为参照峰，1号峰相对保留时间0.80±0.05，2号峰相对保留时间1.00±0.05，3号峰相对保留时间1.08±0.05，4号峰相对保留时间1.30±0.05。

进一步地，它包含以下4个共有特征峰：以2号峰为参照峰，1号峰相对保留时间0.80±0.05，2号峰相对保留时间1.00±0.05，3号峰相对保留时间1.08±0.05，4号峰相对保留时间1.30±0.05。

进一步地，所述2号峰为D-阿拉伯糖醇或其对映异构体的吸收峰，3号峰为果糖或其对映异构体的吸收峰，4号峰为D-甘露糖醇或其对映异构体的吸收峰。

进一步地，所述HPLC-ELSD特征图谱如图8所示。

本发明还提供了一种益母草注射液，它具有上述的HPLC-ELSD特征图谱。

本发明提供的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱建立方法精密度、重复性好，耐用性佳，利用该HPLC-ELSD特征图谱能够对益母草注射液中不带紫外显色基团的糖及糖醇类物质进行有效的质量控制，使制剂更加稳定、可控。本发明提供的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱为益母草注射液提供了一种新的质量控制方法。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为不同柱温下测得的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱，其中上到下的柱温分别为30℃、25℃和35℃。

图2为不同流速下测得的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱，其中从上到下的流速依次为1.0ml/min，0.8ml/min和1.2ml/min。

图3为不同流动相比例下测得的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱，其中从上到下流动相中乙腈与水的体积比分别为77:23，75:25，80:20。

图4为不同仪器下测得的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱，其中自下而上依次为：批号190801-1、190801-2、190301、190302。

图5为使用另一种色谱柱测得的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱。

图6为12批益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱。

图7为各对照品与益母草注射液的HPLC色谱图，其中从上而下依次为：D-阿拉伯糖醇对照品、D-甘露糖醇对照品、益母草注射液、混标对照品、果糖对照品。

图8为实施例2建立的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱，其中，1号峰为未知峰，2号峰为D-阿拉伯糖醇，3号峰为果糖，4号峰为D-甘露糖醇。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

D-阿拉伯糖醇对照品购自ScienMax，批号：19HK2105-2，果糖对照品购自中检院，D-甘露糖醇对照品购自Macklin，批号：C10840762。

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES(4.6×250mm，5μm)色谱柱，是一种聚苯乙烯一二乙烯基苯键合的氨基糖柱。

仪器：Thermo Dionex U3000高效液相色谱仪-Alltech 6000ELSD蒸发光散射检测器。

实施例1、制备益母草注射液

取益母草加3倍重量的水煎煮三次，第一次2小时，第二次1.7小时，第三次1.5小时，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.36～1.38(80℃)的清膏，放冷，加水稀释至含水量为35％；然后用乙醇沉淀处理三次，第一次加入乙醇使含醇量达78％，第二次加入乙醇使含醇量达88％，第三次加入乙醇使含醇量达92％；静置，取上清液回收乙醇至稠膏(命名为醇沉膏)。

取醇沉膏，加3～5倍的注射用水，搅拌，静置，取上清液用15wt.％活性炭脱色至溶液为淡黄色至黄色，用40％氢氧化钠溶液或稀盐酸调节pH至4.8～5.2，加入5wt.％活性炭，煮沸10～15分钟，脱炭过滤得益母草浓溶液(每1ml含总生物碱以盐酸水苏碱计，不得少于35mg)。

准确称取益母草浓溶液[含总生物碱(以盐酸水苏碱计)20g]，置配制罐中，加入适量注射用水，加入苯甲醇10ml，搅匀，加入活性炭(1～5g)，循环脱炭10分钟后补加注射用水使体系至1000ml，搅匀、精滤、灌封、灭菌、包装，即得益母草注射液。

按照上述制备方法，制得12批益母草注射液。

实施例2、本发明益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱的建立方法

本实施例采用Thermo Dionex U3000高效液相色谱仪和Alltech 6000ELSD蒸发光散射检测器，建议益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱。具体步骤如下：

(1)制备供试品溶液：取益母草注射液(按照实施例1的方法制得的)1mL，置10ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

(2)制备对照品溶液：

称取1mg D-阿拉伯糖醇对照品，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶解并定容，即得D-阿拉伯糖醇对照品溶液；该D-阿拉伯糖醇对照品溶液中D-阿拉伯糖醇浓度为0.1mg/mL；

称取1mg果糖对照品，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶解并定容，即得果糖对照品溶液；该果糖对照品溶液中胡芦巴碱浓度为0.1mg/mL；

称取1mg D-甘露糖醇对照品，精密称定，置于10mL容量瓶中，加水溶解并定容，即得D-甘露糖醇对照品溶液；该D-甘露糖醇对照品溶液中D-甘露糖醇浓度为0.1mg/mL。

(3)分别吸取10μL对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，色谱条件如下：

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES(4.6×250mm，5μm)；

流动相：由A相和B相组成，其中A相为乙腈，B相为水，A相与B相的体积比为77:23；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

用蒸发光散射检测器检测：漂移管温度105℃，气体流量2.5L/min。

理论板数按D-阿拉伯糖醇峰、D-甘露糖醇峰计算均应不低于8000，峰3(果糖)和峰4(D-甘露糖醇)的分离度应不低于1.5。

按照上述方法，测得益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱(如图8所示)。图中有4个特征峰，其中特征峰2、3、4分别与对应的对照品溶液的保留时间一致。

以下通过实验例证明本发明检测方法的有益效果。

实验例1对本发明益母草注射液HPLC-ELSD特征图谱的分析

1、实验方法

以实施例1制得的12批益母草注射液为供试样品，按照实施例2的方法，检测12批益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱。

2、实验结果

本发明检测的12批益母草注射液的特征图谱均呈现4个共有特征峰，按保留时间升序排列依次命名为特征峰1、特征峰2、特征峰3、特征峰4。其中，特征峰1为未知峰，特征峰2为D-阿拉伯糖醇的吸收峰，特征峰3为果糖的吸收峰，特征峰4为D-甘露糖醇的吸收峰。

以特征峰2(D-阿拉伯糖醇)为标准峰(S峰)，计算出各特征峰与标准峰的相对保留时间为：0.80(特征峰1)、1.00(特征峰2)、1.08(特征峰3)、1.30(特征峰4)。各相对保留时间应在规定值的5％之内。

实验例2本发明益母草注射液HPLC-ELSD特征图谱建立方法的方法学考察

(1)精密度实验

按照实施例1的方法，制得益母草注射液(批号：190801)，以益母草注射液(批号：190801)为供试样品，按照实施例2的方法进行HPLC测定，连续进样6针，记录色谱图，结果如下。

表1.精密度实验结果

结果显示，连续进样6针所得HPLC-ELSD特征图谱4个共有峰的相对峰面积RSD值均小于1.0％，相对保留时间RSD值均小于1.0％，表明本发明益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱的建立方法的精密度良好。

(2)重复性试验

以益母草注射液(批号：190801)为供试样品，按照实施例2的方法平行制备6份供试品溶液，分别按照实施例2的方法进行HPLC测定，记录色谱图，结果如下。

表2.重复性试验结果

结果显示，6份供试品溶液的HPLC-ELSD特征图谱中4个共有峰的相对峰面积的RSD值均小于1.0％，相对保留时间RSD值均小于1.0％，表明本发明益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱的建立方法的重复性良好。

(3)中间精密度

以益母草注射液(批号：190801)为供试样品，根据中间精密度测定要求，由不同人员于不同日内按照实施例2的方法进行12次HPLC测定，记录色谱图，结果如下。

表3.中间精密度试验结果

结果显示，12次测试所得HPLC-ELSD特征图谱中4个共有峰相对峰面积的RSD值均小于2.0％，保留时间RSD值均小于2.0％，表明本发明益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱的建立方法的中间精密度良好。

(4)溶液稳定性

以益母草注射液(批号：190801)为供试样品，按照实施例2的方法制备成供试品溶液，在室温下放置0小时、2小时、4小时、8小时、12小时、18小时、24小时后，分别按照实施例2的方法进行HPLC测定，记录色谱图。结果如下表。

表4.稳定性实验结果

结果显示，供试品溶液在24小时内各时间点分别测定所得HPLC-ELSD特征图谱中4个共有峰相对峰面积RSD值均小于2.0％，相对保留时间RSD值均小于1.0％，表明本发明制得的供试品溶液在24小时内稳定性良好。

(5)耐用性考察

1)不同柱温的考察

以益母草注射液(批号：190801)为供试样品，参照实施例2的方法，在柱温分别为25℃、30℃、35℃的条件下进行HPLC检测(其余检测条件与实施例2一致)，记录色谱图。

结果(图1)显示，25℃～35℃的柱温下测试对益母草注射液的HPLC特征图谱的测定影响不大。

2)不同流速的考察

以益母草注射液(批号：190801)为供试样品，参照实施例2的方法，在流速分别为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min的条件下进行HPLC检测(其余检测条件与实施例2一致)，记录色谱图。

结果(图2)显示，0.8～1.2ml/min的流速下测试对益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱的测定影响不大。

3)不同流动相比例的考察

以益母草注射液(批号：190801)为供试样品，参照实施例2的方法，在流动相中乙腈与水的体积比分别为75:25、77:23、80:20的条件下进行HPLC检测(其余检测条件与实施例2一致)，记录色谱图。

结果(图3)显示，流动相对益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱中的色谱峰分离度有影响，其中，当流动相中乙腈与水的体积比为77:23时分离效果最佳。

4)不同仪器的考察

按照实施例1的方法，制得不同批次的益母草注射液(批号：190801-1、190801-2、190301、190302)；分别以该不同批次的益母草注射液为供试样品，在以下仪器及检测器中进行HPLC测定(其余检测条件与实施例2一致)，记录色谱图。结果如下。

仪器：Waters e2695-2424elsd型高效液相色谱仪；

检测器：Waters 2424ELSD；ELSD参数：gain＝50；Drift：80℃；Gas:30psi,Nebulize:Heating,60％。

结果(图4)显示，该仪器虽然可以将特征峰2、峰3、峰4分开，但特征峰1与主峰无法达到基线分离，检测效果不佳。

5)不同型号色谱柱的考察

以益母草注射液(批号：190801)为供试样品，将实施例2中的色谱柱更换为以下色谱柱：Dr.Maisch GmbH Prevail Carbohydrate ES(4.6×250mm，5μm)，其余检测条件与实施例2一致，记录色谱图。结果如图5所示，峰1与主峰无法达到基线分离。

实验例3不同批次益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱比较

以实施例1制得的12批益母草注射液为供试样品，按照实施例2的方法进行HPLC测定，得到12批益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱，详见附图6。

12批益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱的共有峰的保留时间如表5所示：

表5各共有峰的保留时间

从表5可以看出，在本发明的检测条件下，12批益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱的共有峰1～4的保留时间的RSD均小于0.2％，说明本发明建立的母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱能够有效的反映益母草注射液的质量。

实验例4本发明益母草注射液HPLC-ELSD特征图谱的共有峰指认

按照实施例1的方法制得益母草注射液，作为供试样品，按照实施例2的方法进行HPLC测定，得到益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱，将该HPLC-ELSD特征图谱与对照品的HPLC图谱及其保留时间进行比对，指认共有峰。其中，对照品分别为：D-阿拉伯糖醇对照品，果糖对照品，D-甘露糖醇对照品，包含D-阿拉伯糖醇、果糖对照品和D-甘露糖醇的混标对照品。结果如图7所示。

经过鉴定，确定益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱中3个共有峰分别为：D-阿拉伯糖醇(特征峰2)、果糖(特征峰3)和D-甘露糖醇(特征峰4)。

综上，本发明提供了一种益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱及其建立方法。按照本发明方法建立的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱包含4个共有特征峰，按照保留时间升序排列，各共有特征峰分别是：1号峰：相对保留时间0.80±0.05；2号峰：相对保留时间1.00±0.05；3号峰：相对保留时间1.08±0.05；4号峰：相对保留时间1.30±0.05。本发明提供的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱建立方法精密度、重复性好，耐用性佳，利用该HPLC-ELSD特征图谱能够对益母草注射液中不带紫外显色基团的糖及糖醇类物质进行有效的质量控制，使制剂更加稳定、可控。本发明建立的益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱为益母草注射液提供了一种新的质量控制方法。

Claims (10)

1.一种益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱的建立方法，其特征在于，所述方法利用高效液相色谱仪和蒸发光散射检测器检测，具体包括以下步骤：

(1)制备供试品溶液：取益母草注射液，即得；

(2)取供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，得到益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱；

检测条件如下：

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES；

流动相：由A相B相组成，其中，A相为乙腈，B相为水；

检测器：蒸发光散射检测器。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述A相与B相的体积比为(75～80)：(20～25)；所述检测的流速为0.8～1.2mL/min；所述检测的柱温为25～35℃；

和/或，所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为100～110℃，气体流量为2.0～3.0L/min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述A相与B相的体积比为77：23；所述检测的流速为1.0mL/min；所述检测的柱温为30℃；

和/或，所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为105℃，气体流量为2.5L/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪为Thermo DionexU3000，所述蒸发光散射检测器为Alltech 6000ELSD。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤还包括取对照品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，所述对照品为D-阿拉伯糖醇或其对映异构体、果糖或其对映异构体、D-甘露糖醇或其对映异构体中的一种或多种。

6.一种益母草注射液的HPLC-ELSD特征图谱，其特征在于：它是按照权利要求1～5任一项所述的方法构建的，它的共有特征峰包含以下1～4号峰中的3个或4个：以2号峰为参照峰，1号峰相对保留时间0.80±0.05，2号峰相对保留时间1.00±0.05，3号峰相对保留时间1.08±0.05，4号峰相对保留时间1.30±0.05。

7.根据权利要求6所述的HPLC-ELSD特征图谱，其特征在于：它包含以下4个共有特征峰：以2号峰为参照峰，1号峰相对保留时间0.80±0.05，2号峰相对保留时间1.00±0.05，3号峰相对保留时间1.08±0.05，4号峰相对保留时间1.30±0.05。

8.根据权利要求6或7所述的HPLC-ELSD特征图谱，其特征在于：所述2号峰为D-阿拉伯糖醇或其对映异构体的吸收峰，3号峰为果糖或其对映异构体的吸收峰，4号峰为D-甘露糖醇或其对映异构体的吸收峰。

9.根据权利要求8所述的HPLC-ELSD特征图谱，其特征在于：所述HPLC-ELSD特征图谱如图8所示。

10.一种益母草注射液，其特征在于：它具有权利要求6～9任一项所述的HPLC-ELSD特征图谱。

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