CN113024657A - 靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向胰高血糖素样肽‑1受体的exendin‑4放射性探针及其制备方法，属于放射性药物化学领域；本发明的放射性探针的结构式如下。本发明的放射性探针的标记时间为8min，标记产率>99％，radio‑HPLC测定产品放化纯>99％，产物表现出对胰高血糖素样肽‑1受体的高亲和力和高特异性，同时具有较好的体内生物代谢性质，是较有潜力的胰高血糖素样肽‑1受体PET显像剂。
Figure DDA0002987729920000011

Description

靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针及其制 备方法
技术领域
本发明涉及一种靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针及其制备方法，属于放射性药物化学技术领域。
背景技术
近年来，我国糖尿病患病率呈快速增长趋势。《中国2型糖尿病防治指南》(2020版)显示，我国糖尿病患病率在逐渐增加：2010年为9.1％，2013年为10.4％，2017年为11.2％。目前，中国的糖尿病患者人数已达1.164亿，占世界患者总人数的四分之一，高居全球首位(International Diabetes Atlas,2019)。糖尿病已成为继高血压之后的第二大慢性疾病，其合并症已给我国民众带来了严重的疾病负担和社会负担。早发现、早治疗是治疗糖尿病的最佳策略，能够极大提高患者的生存质量。
糖尿病是一类以高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素分泌不足导致的血糖水平失调引起。胰岛素由位于胰腺内分泌部的胰岛β细胞产生。研究表明，I型糖尿病(T1D)和II型糖尿病(T2D)均以β细胞质量的相对减少为主要特征，且该病理变化在患者出现明显症状之前就已发生。因此，监测β细胞质量是对糖尿病进行早期诊断的关键，可有效地在早期发现糖尿病的发生，从而尽早对症下药，并对疾病的进展进行监测。由于β细胞总质量仅占胰腺总质量的2％且分散在整个胰腺中，因此，监测β细胞质量存在巨大的困难。
目前，公认的监测β细胞质量的金标准方法是胰腺活体组织检查法，但该侵入性方法对患者伤害大，且无法在早期(症状出现之前)评估β细胞质量。其它可用的方法也仅是对β细胞质量的间接反映，无法准确地评估β细胞质量的变化。
胰岛素瘤是一种由胰岛β细胞过度增殖引起的神经内分泌肿瘤，在大多数情况下(>90％)为良性。但由于肿瘤不受控地分泌大量胰岛素而引起的症状可能很严重，不仅会影响患者的生活质量，甚至威胁患者生命。由于肿瘤体积小(<1厘米)，传统的成像技术如腹部超声、计算机断层扫描等很难定位病变。
核医学成像技术为体内β细胞质量的定量监测和胰岛素瘤诊断有效方法的寻求指明了方向。正电子发射断层成像(Positron emission tomography，PET)是在活体内实现从分子水平探索病理变化的无创影像技术，作为功能显像，PET具有高灵敏度、高分辨率的特点。推动PET发展的关键技术之一是“特异性PET分子探针”，但目前报道的用于β细胞质量监测和胰岛素瘤显像的放射性PET放射性探针均因存在特异性低、肾摄取高等问题而未取得成功。
胰高血糖素样肽-1受体是特征最清楚的胰岛G蛋白偶联受体，在胰岛β细胞中特异性表达，几种稳定肠降血糖素水平的胰高血糖素样肽-1受体激动剂已广泛用于T2D的治疗(如2019年美国FDA批准的首个口服胰高血糖素样肽-1受体激动剂降糖药Semaglutide)，因此靶向胰高血糖素样肽-1受体的放射性分子探针研究是目前研究者最关心的方向。
胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)虽是胰高血糖素样肽-1受体的天然配体，但其在人体内易被二肽基肽酶4迅速降解而具有较短的血浆半衰期，因此不适合用作探针。艾塞那肽(Exenatide)是一种胰高血糖素样肽-1受体激动剂，已于2005年获得美国FDA批准用于治疗T2D；其天然存在形式exendin-4是有效的胰高血糖素样肽-1受体激动剂，在人体内不易被降解，因此成为研究最为广泛的β细胞放射性探针靶向基团。
目前，已有部分对β细胞或胰岛素瘤具有成像能力的exendin-4类PET放射性探针报道，如2012年Connolly等人报道的[64Cu]Cu-[Lys40(DOTA)NH2)-exendin-4、2016年Nilantha等人报道的[68Ga]Ga/[64Cu]Cu-DO3A-VS-Cys40-exendin-4、2020年Boss等人报道的[68Ga]Ga-NODAGA-exendin-4等。已有临床实验证明[68Ga]Ga-NOTA-MAL-Cys40-exendin-4、[68Ga]Ga-DOTA-exendin-4等在人胰岛素瘤中有特异性高摄取。
胰高血糖素样肽-1受体在人大脑黑质、额叶皮层、海马体和小脑中同样有高表达，这些表达与许多神经功能(如运动、认知、学习、记忆功能)密切相关。最新研究表明胰高血糖素样肽-1受体的表达可能与某些神经退行性疾病和精神疾病(如帕金森氏病PD、阿尔茨海默氏病AD、中风、抑郁症等)之间存在紧密的关系。因此胰高血糖素样肽-1受体成为了潜在的新型中枢神经生物标志物，受到了越来越多的关注。Lizhen Wang、Yu Liu等人曾使用exendin-4类PET放射性探针[18F]AlF-NOTA-MAL-Cys39-exendin-4对老年大鼠和抑郁症大鼠进行显像，发现这两类大鼠脑部对探针的摄取均较正常大鼠有所降低。
综上，以exendin-4为靶向基团、胰高血糖素样肽-1受体作为靶点的放射性探针既可用于测量β细胞质量，又可用于胰岛素瘤显像和脑显像，已受到大家的密切关注。
但是，目前已报道的探针均存在胰岛β细胞特异性摄取较低、肾脏非特异性摄取过高等问题，有很大的改进空间。
因此，提供一种新型放射性探针，标记反应条件更为温和，效率更高，具有更高的胰岛β细胞特异性摄取、胰岛素瘤摄取和靶/非靶比值，表现出对胰高血糖素样肽-1受体的高亲和力和高特异性，同时具有较好的体内生物代谢性质，就成为该技术领域急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针，该类放射性探针表现出对胰高血糖素样肽-1受体的高亲和力和高特异性，同时具有较好的体内生物代谢性质，是较有潜力的胰高血糖素样肽-1受体PET显像剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针，其结构式如下：
Figure BDA0002987729900000031
本发明的另一目的在于提供一种上述靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的制备方法，其步骤如下：在碱和缩合剂的存在下，使双功能连接剂HBED-CC和马来酰亚胺进行缩合反应，用酸脱去保护基团后，与Cys39-exendin-4连接，将所得产物溶解在醋酸钠缓冲液中，加入[68Ga]GaCl3溶液，混合均匀，加热，得到上述结构式所示的68Ga标记的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针。
反应式如下：
Figure BDA0002987729900000041
优选地，靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的制备方法的具体步骤如下：
步骤1：靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记前体的合成：
将化合物3,3'-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-亚苯基))二丙酸溶于无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中依次加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺以及1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；室温下反应过夜后，向混合溶液中加入乙酸乙酯，用水以及饱和食盐水洗涤；有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，除去固体杂质；利用旋转蒸发仪除去滤液中的有机相，用二氯甲烷、甲醇和氨水混合液过硅胶柱分离，收集组分，减压，除去溶剂，将得到的无色油状物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌，利用旋转蒸发仪减压，除去溶剂，用乙醇/乙醚重结晶；将得到的白色固体溶于DMSO溶液，经Semi-HPLC纯化(0.1％TFA水溶液/乙腈＝8/2)得到无色油状物HBED-CC-MAL；将HBED-CC-MAL用DMSO溶解后，加入溶有Cys39-exendin-4的PBS中，室温下反应过夜，反应液用Semi-HPLC纯化，得到白色絮状固体HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4；
步骤2：靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记
将标记前体HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4溶于醋酸钠缓冲液，得标记前体的醋酸钠溶液，用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器，将所得[68Ga]GaCl3的盐酸溶液加入标记前体的醋酸钠溶液中，均匀混合，50℃反应，冷却至常温，用带放射性检测器的高效液相色谱(radio-HPLC)测定其标记率，得放射化学产率>99％的[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4。
优选地，靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的制备方法的具体步骤如下：
步骤1：靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记前体的合成：
将化合物3,3'-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-亚苯基))二丙酸溶于无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中依次加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺以及1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；室温下反应过夜后，向混合溶液中加入乙酸乙酯，用水以及饱和食盐水洗涤；有机相用无水硫酸镁干燥，过滤除去固体杂质；利用旋转蒸发仪除去滤液中的有机相，用二氯甲烷、甲醇和氨水的混合液过硅胶柱分离，收集组分，减压，除去溶剂，将得到的无色油状物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌，利用旋转蒸发仪减压，除去溶剂，用乙醇/乙醚重结晶；将得到的白色固体溶于DMSO中，经Semi-HPLC纯化，得到无色油状物HBED-CC-DiMAL；将HBED-CC-DiMAL用DMSO溶解后，加入溶有Cys39-exendin-4的PBS中，室温下反应过夜，反应液用Semi-HPLC纯化，得到白色絮状固体HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)；
步骤2：靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记
将标记前体HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)溶于醋酸钠缓冲液，得标记前体的醋酸钠溶液，用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器，将所得[68Ga]GaCl3的盐酸溶液加入标记前体的醋酸钠溶液中，均匀混合，50℃反应，冷却至常温，用radio-HPLC测定其标记率，得放射化学产率>99％的[68Ga]Ga-HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)。
优选地，步骤1中，所述二氯甲烷、甲醇和氨水混合液的体积比为90：9：1。
有益效果：
本发明的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针表现出对胰高血糖素样肽-1受体的高亲和力和高特异性，同时具有较好的体内生物代谢性质，是较有潜力的胰高血糖素样肽-1受体PET显像剂。
下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4的标记反应液的radio-HPLC图谱。
图2为本发明实施例2中制备的[68Ga]Ga-HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)的标记反应液的radio-HPLC图谱。
图3为本发明应用实施例1中生物分布实验分析[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4在正常大鼠和糖尿病模型大鼠胰腺的分布图。
图4为本发明应用实施例1中生物分布实验分析[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4与大鼠胰腺β细胞中胰高血糖素样肽-1受体的特异性结合图。
图5为本发明应用实施例2中[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4在荷瘤鼠体内microPET/CT显像结果图。
具体实施方式：
除非特别说明，以下实施例和对比实施例中所述的制备方法和检测方法中所用的试剂和原料均为市场上可购得的商品，所用设备均为常用设备。
实施例1([68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4)
步骤1：68Ga标记的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记前体的合成
HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4即N,N'-双[2-羟基-5-(羧乙基)-苄基]乙二胺-N,N'-二乙酸-N-乙基琥珀酰亚胺-(半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-亮氨酸-色氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-丝氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-甘氨酸-谷氨酸-甘氨酸-组氨酸)的合成；
合成反应方程式：
Figure BDA0002987729900000071
合成方法：
将化合物3,3'-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-亚苯基))二丙酸(64毫克，0.1毫摩尔)溶于2mL无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中依次加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，57毫克，0.15毫摩尔)，1-羟基苯并三唑(HOBt，25.3毫克，0.15毫摩尔)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，41.3毫克，0.32毫摩尔)以及1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(14毫克，0.1毫摩尔)；室温下反应过夜后，向混合溶液中加入30mL乙酸乙酯，用水(10mL×2)以及饱和食盐水(10mL)洗涤；有机相用无水硫酸镁干燥，过滤除去固体杂质；利用旋转蒸发仪除去滤液中的有机相，用二氯甲烷/甲醇/氨水(v/v/v，90/9/1)过硅胶柱分离，收集组分，减压，除去溶剂，将得到的无色油状物溶于5毫升三氟乙酸中，室温下搅拌3小时，利用旋转蒸发仪减压，除去溶剂，用乙醇/乙醚重结晶；将得到白色的固体溶于DMSO中，经Semi-HPLC纯化(0.1％TFA水溶液/乙腈＝8/2)得到无色油状物HBED-CC-MAL 62毫克(产率：38％)；
化合物HBED-CC-MAL的确认：
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.20(dd,J＝39.6,14.4Hz,4H),6.90(d,J＝7.7Hz,2H),6.77(s,2H),4.41(s,4H),3.93(s,4H),3.58(d,J＝48.6Hz,6H),3.29(s,2H),2.81(d,J＝32.3Hz,4H),2.66(d,J＝6.6Hz,2H),2.44(s,2H).
将10毫克HBED-CC-MAL用100μL DMSO溶解后，取6μL(0.6毫克，1.4微摩尔)，加入3ml溶有Cys39-exendin-4(3毫克，0.7微摩尔)的PBS(×1，pH＝7.4)中，室温下反应过夜，反应液用Semi-HPLC纯化(0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈＝7/3)，得到3.1毫克的白色絮状固体HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4(产率89％)；产品经LC/MS鉴定为目标产物；
化合物HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4的确认：
HRMS(ESI)理论分子量C216H316N54O70S2[M+H]+4857.36；实测分子量1619.8171[M+3H+]3+,1214.6093[M+4H+]4+,971.6797[M+5H+]5+,810.3989[M+6H+]6+，694.7677[M+7H+]7+；
步骤2
68Ga标记的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记
[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4即镓[68Ga]Ga-N,N'-双[2-羟基-5-(羧乙基)-苄基]乙二胺-N,N'-二乙酸-N-乙基琥珀酰亚胺-(半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-亮氨酸-色氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-丝氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-甘氨酸-谷氨酸-甘氨酸-组氨酸)。
标记反应方程式：
Figure BDA0002987729900000091
标记方法：
将50微克的标记前体HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4溶于200μL 3N的醋酸钠缓冲液，用4mL高纯0.05N盐酸溶液淋洗锗镓发生器，将所得[68Ga]GaCl3的盐酸溶液加入前体的醋酸钠溶液中，均匀混合，50℃反应5min，冷却至常温，用带放射性检测器的高效液相色谱(radio-HPLC)测定其标记率，得放射化学产率>99％的[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4。
如图1所示，为本发明实施例1中制备的[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4的标记反应液的放射性HPLC图谱；
上述步骤中所述radio-HPLC测定中，第一流动相为0.1％三氟乙酸的水溶液，第二流动相为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件：0min，95％的第一流动相；0～15min，95％～0％的第一流动相；16～21min，95％的第一流动相；流动相的流速为1mL/min。
实施例2([68Ga]Ga-HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)的合成)
步骤1：68Ga标记的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记前体的合成
HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)，即N,N'-双[2-羟基-5-(羧乙基)-苄基]乙二胺-N,N'-二乙酸-双[N-乙基琥珀酰亚胺-(半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-亮氨酸-色氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-丝氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-甘氨酸-谷氨酸-甘氨酸-组氨酸)]的合成；
合成反应方程式：
Figure BDA0002987729900000101
合成方法：
将化合物3,3'-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-亚苯基))二丙酸(64毫克，0.1毫摩尔)溶于2mL无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中依次加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，57毫克，0.15毫摩尔)，1-羟基苯并三唑(HOBt，25.3毫克，0.15毫摩尔)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，41.3毫克，0.32毫摩尔)以及1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(28毫克，0.2毫摩尔)；室温下反应过夜后，向混合溶液中加入30mL乙酸乙酯，用水(10mL×2)以及饱和食盐水(10mL)洗涤；有机相用无水硫酸镁干燥，过滤除去固体杂质；利用旋转蒸发仪除去滤液中的有机相，用二氯甲烷/甲醇/氨水(v/v/v，90/9/1)过硅胶柱分离，收集组分，减压，除去溶剂，将得到的无色油状物溶于5毫升三氟乙酸中，室温下搅拌3小时，利用旋转蒸发仪减压，除去溶剂，用乙醇/乙醚重结晶；将得到的白色固体溶于DMSO溶液，经Semi-HPLC纯化(0.1％TFA水溶液/乙腈＝8/2)得到无色油状物HBED-CC-DiMAL 5mg(产率25％)；
化合物HBED-CC-DiMAL的确认：
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.24-7.12(m,4H),6.91-6.89(m,2H),6.80-6.78(m,2H),4.43-4.41(m,4H),3.95-3.93(s,4H),3.69-3.67(s,4H),3.55-3.53(s,4H),3.32-3.30(s,4H),2.76-2.74(m,4H),2.46-2.44(m,4H)；
将10毫克HBED-CC-DiMAL用100μL DMSO溶解后，取12μL(1.2毫克，1.5微摩尔)，加入3mL溶有Cys39-exendin-4(6毫克，1.4微摩尔)的PBS(×1，pH＝7.4)中，室温下反应过夜，反应液用Semi-HPLC纯化(0.1％TFA水溶液/0.1％TFA乙腈＝7/3)，得到2.65毫克的白色絮状固体HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)(产率38.5％)；产品经LC/MS鉴定为目标产物；
化合物HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)的确认：
HRMS(ESI)理论分子量C406H605N106O130S4[M+H]+9180.8；实测分子量1837.0732[M+5H+]5+,1531.2298[M+6H+]6+,1313.0638[M+7H+]7+,1148.5525[M+8H+]8+，1021.6145[M+9H+]9+,919.2516[M+10H+]10+,835.8633[M+11H+]11+,766.2967[M+12H+]12+；
步骤2
68Ga标记的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记
[68Ga]Ga-HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)，即[68Ga]Ga-N,N'-双[2-羟基-5-(羧乙基)-苄基]乙二胺-N,N'-二乙酸-双[N-乙基琥珀酰亚胺-(半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-亮氨酸-色氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-丝氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-甘氨酸-谷氨酸-甘氨酸-组氨酸)]的制备：
标记反应方程式：
Figure BDA0002987729900000121
标记方法：
将50微克的标记前体HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)溶于200μL 3N的醋酸钠缓冲液，用4mL高纯0.05N盐酸溶液淋洗锗镓发生器，将所得[68Ga]GaCl3的盐酸溶液加入前体的醋酸钠溶液中，均匀混合，50℃反应5min，冷却至常温，用radio-HPLC测定其标记率，得放射化学产率>99％的[68Ga]Ga-HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)；
如图2所示，为本发明实施例2中制备的[68Ga]Ga-HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)的标记反应液的放射性HPLC图谱；
上述步骤中所述radio-HPLC测定中，第一流动相为0.1％三氟乙酸的水溶液，第二流动相为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，梯度洗脱条件：0min，95％的第一流动相；0～15min，95％～0％的第一流动相；16～21min，95％的第一流动相；流动相的流速为1mL/min。
应用实施例1
[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4在正常大鼠和糖尿病大鼠的生物分布
(1)糖尿病动物模型的建立：将体重为130-150g的SD大鼠禁食12h，将一定量(180mg/kg体重)的四氧嘧啶，用生理盐水配成溶液，腹腔注射后，48h内血糖>25mmol/L者，成模；
(2)标记结束后的[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4溶液加入水稀释，将大鼠(正常、模型，n＝4)禁食12h后，经尾静脉注射30μCi药液，5、15、30、60、90、120min后，断颈处死，取感兴趣组织，测量放射性计数；
Blocking实验：将Cys39-exendin-4肽(10mg/kg体重)与[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4药液(30μCi)混合后，经尾静脉注射，15min后，microPET/CT显像，取感兴趣组织，测量放射性计数；
(3)由生物分布实验结果可知：[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4在大鼠胰腺中有特异性摄取，在15min时摄取达到最高，且正常鼠与糖尿病模型鼠的胰腺摄取有显著性差异；
如图3所示，为本发明应用实施例1中生物分布实验分析[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4在正常大鼠和糖尿病模型大鼠胰腺的分布图；**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001,n＝4；
如图4所示，为本发明应用实施例1中生物分布实验分析[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4与大鼠胰腺β细胞中胰高血糖素样肽-1受体的特异性结合图；****p<0.0001,n＝4，正常大鼠与blocking大鼠胰腺摄取的显著性差异显示：[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4与大鼠胰腺β细胞中胰高血糖素样肽-1受体的特异性结合；
应用实施例2
[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4在荷瘤鼠体内microPET/CT显像
(1)肿瘤动物模型的建立：取对数生长期的胰高血糖素样肽-1受体表达阳性的INS-1细胞消化并制成PBS悬液，调整细胞密度为5×107/mL，将细胞悬液注入8～10周的雄性NOD/SCID小鼠右侧腋下，培养观察10～21天，肿瘤直径5mm；
(2)将标记结束后的溶液加入水稀释后，将肿瘤模型鼠禁食12h后，注射器取150μCi药液经尾静脉注射，15min后，microPET/CT显像；
Blocking实验：将Cys39-exendin-4肽(10mg/kg体重)与[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4药液(150μCi)混合后，经肿瘤模型鼠尾静脉注射，15min后，microPET/CT显像；
(3)由microPET/CT显像实验结果可知：[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4在胰岛素瘤中有较高的特异性摄取；
如图5所示，为本发明应用实施例2中[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4在荷瘤鼠体内microPET/CT显像结果图；其中，K-肾，T-肿瘤，R-右，L-左，荷瘤鼠与blocking荷瘤鼠肿瘤摄取的显著性差异显示[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4与胰岛素瘤细胞中胰高血糖素样肽-1受体的特异性结合。
本发明的68Ga标记的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针，68Ga是金属核素，通过一个既能连接活性分子又可与金属配位的双功能连接剂，将其与靶向基团相连，经过实验，本发明人发现：N,N'-双[2-羟基-5-(羧乙基)-苄基]乙二胺-N,N'-二乙酸(HBED-CC)是绝佳的Ga3+双功能连接剂，其热力学稳定常数远高于其他常用的连接剂(logKML：HBED-CC：38.5；DOTA：21.3；NOTA：31.0；AAZTA：22.18)；HBED-CC与Ga3+配位所需能量相对其他双功能连接剂较低，因此，[68Ga]Ga-HBED-CC标记所需温度较低，时间较短。本发明人发现：HBED-CC并不仅仅具有双功能连接剂的作用，它还能为药物提供额外的靶向基团，增加正电子药物与靶点的亲和性；与DOTA相比，含HBED-CC放射性探针的肿瘤细胞摄取值更好，肿瘤小鼠PET显像表明HBED-CC具有更好的肿瘤摄取值以及靶/非靶比值。
因此，当将HBED-CC和exendin-4结合起来作为放射性探针研究时，可能使68Ga标记反应条件更为温和，效率更高，同时获得更适宜的体内药代动力学性质，有望满足今后临床糖尿病和胰岛素瘤早期诊断及脑显像的需求。
本发明的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针制备方便，具有良好的胰高血糖素样肽-1受体亲和性，预期[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4和[68Ga]Ga-HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)对胰高血糖素样肽-1受体亲和性较好；因此，本发明的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针可用于β细胞质量测量、胰岛素瘤显像和脑显像。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (5)

1.靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针，分别是：[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4和[68Ga]Ga-HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)，结构式分别如下：
Figure FDA0002987729890000011
2.靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的制备方法，其步骤如下：在碱和缩合剂的存在下，使双功能连接剂HBED-CC和马来酰亚胺进行缩合反应，用酸脱去保护基团后，与Cys39-exendin-4连接，将所得产物溶解在醋酸钠缓冲液中，加入[68Ga]GaCl3溶液，混合均匀，加热，得到68Ga标记的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针。
3.根据权利要求2所述的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤1：靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记前体的合成：
将化合物3,3'-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-亚苯基))二丙酸溶于无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中依次加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺以及1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；室温下反应，过夜后，向混合溶液中加入乙酸乙酯，用水以及饱和食盐水洗涤；有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，除去固体杂质；利用旋转蒸发仪除去滤液中的有机相，用二氯甲烷、甲醇和氨水混合液过硅胶柱分离，收集组分，减压，除去溶剂，将得到的无色油状物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌，利用旋转蒸发仪减压，除去溶剂，用乙醇/乙醚重结晶；将得到的白色固体溶于DMSO溶液，经Semi-HPLC纯化(0.1％TFA水溶液/乙腈＝8/2)得到无色油状物HBED-CC-MAL；将HBED-CC-MAL用DMSO溶解后，加入溶有Cys39-exendin-4的PBS中，室温下反应过夜，反应液用Semi-HPLC纯化，得到白色絮状固体HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4；
步骤2：靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记
将标记前体HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4溶于醋酸钠缓冲液，得标记前体的醋酸钠溶液，用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器，将所得[68Ga]GaCl3的盐酸溶液加入标记前体的醋酸钠溶液中，均匀混合，50℃反应，冷却至常温，用radio-HPLC测定其标记率，得放射化学产率>99％的[68Ga]Ga-HBED-CC-MAL-Cys39-exendin-4。
4.根据权利要求2所述的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤1：靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记前体的合成：
将化合物3,3'-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-亚苯基))二丙酸溶于无水二甲基甲酰胺，向混合溶液中依次加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基乙胺以及1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；室温下反应过夜后，向混合溶液中加入乙酸乙酯，用水以及饱和食盐水洗涤；有机相用无水硫酸镁干燥，过滤除去固体杂质；利用旋转蒸发仪除去滤液中的有机相，用二氯甲烷、甲醇和氨水的混合液过硅胶柱分离，收集组分，减压，除去溶剂，将得到的无色油状物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌，利用旋转蒸发仪减压，除去溶剂，用乙醇/乙醚重结晶；将得到的白色固体溶于DMSO中，经Semi-HPLC纯化，得到无色油状物HBED-CC-DiMAL；将HBED-CC-DiMAL用DMSO溶解后，加入溶有Cys39-exendin-4的PBS中，室温下反应过夜，反应液用Semi-HPLC纯化，得到白色絮状固体HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)；
步骤2：靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的标记
将标记前体HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)溶于醋酸钠缓冲液，得标记前体的醋酸钠溶液，用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器，将所得[68Ga]GaCl3的盐酸溶液加入标记前体的醋酸钠溶液中，均匀混合，50℃反应，冷却至常温，用带radio-HPLC测定其标记率，得放射化学产率>99％的[68Ga]Ga-HBED-CC-Di(MAL-Cys39-exendin-4)。
5.根据权利要求3或4所述的靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述二氯甲烷、甲醇和氨水混合液的体积比为90：9：1。
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