CN113018328A - 一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用 - Google Patents

一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用。所述复合菌剂包括多形拟杆菌菌粉、胆汁酸和多苞桉桉树精油，三者的质量比为2‑3:2‑3:1；所述多形拟杆菌菌粉是由保藏编号为CGMCC No.20818的多形拟杆菌GL‑02通过培养发酵干燥制得的。本发明所述的复合菌剂能够通过增加红细胞压积、红细胞和血小板数量来改善和预防宠物由于巴贝斯焦虫感染、营养不良或食物中毒等原因诱发的贫血，且使用安全，有利于宠物的生长发育和养殖。

Description

一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血 的制剂中的应用
技术领域
本发明属于宠物养殖技术领域，具体涉及一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用。
技术背景
宠物贫血是在宠物养殖的过程中经常出现的问题，但经常得不到宠物主人的重视。造成宠物贫血的原因有很多，比如营养不良、病虫感染、消化系统发育不完善、手术外伤、中毒等，均会造成不同程度的贫血。贫血的宠物主要表现为食欲不佳、身体消瘦，体质衰弱无力、精神萎靡、皮毛变得非常粗糙、牙龈和眼白苍白；后期表现为运动无力、摇晃、倒地后起立困难、直至卧地不起、全身衰竭等，有时还会因为贫血造成疾病，比如出现黄染现象。目前，对于宠物贫血的恢复治疗会采用输血、调配饮食、使用抗生素等方式，但现有的治疗改善贫血的方法效果慢、不科学、价格高或者会产生一定的副作用。因此，开发一种天然、高效、无害且科学配比的制剂用来改善或预防宠物贫血问题，具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用，所述复合菌剂安全可靠，能够提高宠物红细胞压积、红细胞和血小板数量等指标来改善贫血。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用。
进一步的，所述复合菌剂包括多形拟杆菌菌粉、胆汁酸和多苞桉桉树精油。
进一步的，所述复合菌剂中多形拟杆菌菌粉、胆汁酸和多苞桉桉树精油的质量比为2-3∶2-3∶1。
进一步的，所述多形拟杆菌菌粉是由保藏编号为CGMCC No.20818的多形拟杆菌GL-02通过培养发酵干燥制得的。
进一步的，所述多形拟杆菌菌粉的制备方法为：将多形拟杆菌GL-02挑取至GAM液体培养基中，35℃厌氧环境下活化48h，将得到的活化菌液取1mL再次接种到50mL GAM液体培养基中培养24-76h，将培养液10000rpm/min离心5min后，将菌株沉淀物用其质量10-12倍体积的无菌生理盐水重悬，再次10000rpm/min离心5min，使用其质量5倍体积的无菌生理盐水二次重悬；然后选择脱脂牛奶作为保护剂，并利用真空冷冻干燥法制备成多形拟杆菌GL-02菌粉。
进一步的，所述多形拟杆菌GL-02菌重悬液的菌含量不小于1×109CFU/mL。
进一步的，所述复合菌剂的菌含量不少于5×108CFU/g。
进一步的，在使用时，所述复合菌剂的用量为4-10g/d，连续使用5-25天。
进一步的，在使用时，10kg及以下的宠物的所述复合菌剂的用量为4-6g/d，当宠物的体重每增加10kg，所述复合菌剂的用量增加2-3g/d，连续使用5-25天。
优选的：在使用时，10kg及以下的宠物的所述复合菌剂的用量为4g/d，当宠物的体重每增加10kg，所述复合菌剂的用量增加2g/d，连续使用5-25天。
进一步的，所述复合菌剂能够通过增加红细胞压积、红细胞和血小板数量来改善宠物的贫血。
进一步的，所述贫血为巴贝斯焦虫感染、营养不良或食物中毒诱发的贫血。
进一步的，所述复合菌剂能够单独使用，或与药物联合使用，或与载体复配混合后使用。
进一步的，所述药物包括消炎药阿奇霉素、克林霉素。
进一步的，所述宠物包括宠物犬和宠物猫。
进一步的，所述宠物犬包括苏格兰牧羊犬和比熊犬。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明分离出一株多形拟杆菌GL-02，该菌不会对动物人体造成伤害，也不会影响环境；本发明利用多形拟杆菌GL-02菌粉与胆汁酸、多苞桉桉树精油制备成一种全新的复合菌剂，该复合菌剂能够通过促进营养物质的消化吸收、促进胆汁的分泌来促进宠物肠道的蠕动，帮助其恢复食欲，提高体力，同时提高宠物的免疫力，恢复血液中红细胞、胆红素的正常水平和代谢，进而改善和预防宠物由于巴贝斯焦虫感染、营养不良或食物中毒等原因诱发的贫血、黄染等问题，且使用安全、效果好，有利于宠物的生长和发育，以及保持日常健康。
附图说明
图1为所述多形拟杆菌GL-02的菌落图片。
图2为苏格兰牧羊犬使用所述复合菌剂前后的对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：
1、多形拟杆菌GL-02的筛选
取10g健康猪粪便和100mL无菌水混匀，过滤去除杂质后制成粪便稀释液，然后继续向稀释液中添加无菌水，制备成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释液；再分别取10-2、10-3、10-4、10-5稀释液涂布至GAM琼脂培养基中，在含有80％N2、10％CO2和10％H2的厌氧环境下，35℃培养48h，选取明显的菌落进行多次纯化后得到单菌落，将得到的单菌落命名为GL-02，冷冻保藏。其中，GAM琼脂培养基配方为：10.0g蛋白胨，3.0g大豆胨，10.0g月示胨，13.5g血清消化粉，2.2g牛肉浸粉，5.0g酵母浸粉，1.2g牛肝浸粉，3.0g葡萄糖，3.0g氯化钠，2.5g磷酸二氢钾，5.0g可溶性淀粉，0.3g L-半胱氨酸，0.15g硫乙醇酸钠，15.0g琼脂，1mL 0.1％维生素K1溶液，3mL氯化血红素溶液，100mg卡那霉素，1000mL蒸馏水，pH 7.1。
如图1所示，所述菌株GL-02在GAM琼脂培养基上的菌落呈圆形或类圆形，黄色，直径0.5-2.5mm，表面光滑无光泽，中间微凸，不透明，边缘较整齐。
2、多形拟杆菌GL-02的鉴定
提取所述菌株GL-02的基因组DNA，并以此为模板，使用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，获得16S rRNA扩增序列后测序，然后将该序列进行Blast比对，结果显示菌株GL-02与GenBank基因库中的多形拟杆菌Bacteroides thetaiotaomicron同源性最高，因此判定菌株GL-02为多形拟杆菌。
将筛选到的多形拟杆菌GL-02进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年09月25日；多形拟杆菌Bacteroides thetaiotaomicron的保藏编号为CGMCC No.20818。
3、多形拟杆菌GL-02菌粉的制备
将保存的多形拟杆菌GL-02挑取至GAM液体培养基(在GAM琼脂培养基配方上减少琼脂即可)，35℃厌氧环境下活化48h，将得到的活化菌液取1mL再次接种到50mL GAM液体培养基中培养24-76h，将培养液10000rpm/min离心5min后，将菌株沉淀物用其质量10-12倍体积的无菌生理盐水重悬，再次10000rpm/min离心5min，使用其质量5倍体积的无菌生理盐水二次重悬，此时要确保重悬液中多形拟杆菌GL-02的菌含量不小于1×109CFU/mL；然后选择脱脂牛奶作为保护剂，并利用真空冷冻干燥法制备成多形拟杆菌GL-02菌粉。
实施例2：复合菌剂的制备
1、胆汁酸的制备
所述胆汁酸的制备工艺步骤如下：
(1)皂化：将粉碎过40目筛的1kg猪胆粉加入反应釜中，再加入质量浓度为10％的氢氧化钠溶液10L，加热搅拌至沸腾，并保持沸腾状态搅拌14h，然后将反应生成的皂化液冷却至固液分层，去除上清液，剩余固体即为胆汁酸皂化品；
(2)脱色：向胆汁酸皂化品中加6L水，加热至80℃使胆汁酸皂化品完全溶解，然后将其打入脱色罐中，加入300mL双氧水搅拌均匀后，常温反应24h，然后将反应溶液过滤至酸化槽中，得到滤液；
(3)酸化：将滤液冷却至室温，缓慢加入10％盐酸溶液，边加入边搅拌，待溶液pH值在3时停止加酸，离心过滤得到白色固形物；
(4)纯化：将白色固形物不断加水冲洗，将附着在白色固形物表面的水溶性杂质去除，待滤出的水检测呈中性后结束水洗；将离心过滤后的白色固形物放入烘箱中，100℃干燥至水分少于10％，得胆汁酸粗品；
(5)重结晶：将胆汁酸粗品投入萃取罐中，加入胆汁酸粗品重量10倍体积的乙酸乙酯搅拌至完全溶解，再加入0.08g无水硫酸钠脱水，过滤收集过滤液，将过滤液进行减压浓缩并回收乙酸乙酯，得到液体胆汁酸；
(6)干燥：将液体胆汁酸放入烘箱，在100℃下干燥至水分不超过1％时，得到成品胆汁酸。
成品胆汁酸中包含了78.6％的猪胆酸和猪去氧胆酸以及20.0％的鹅去氧胆酸。
2、多苞桉桉树精油的制备
将澳大利亚多苞桉桉树叶放入水洗塔清洗后，放到烘干机中烘干，再于粉碎机中粉碎后分别进入水蒸气蒸馏釜、冷凝器和油水分层器中分离油相和水相，其中水相进入乙醚萃取器分离出废水，含有乙醚的液体进入乙醚回收塔中回收乙醚，将回收的乙醚和油相液体添加到固体床吸附干燥器进一步去除油相中的水分，最后将油相液体加入到减压精馏塔中精馏以此去除杂质油后便得到多苞桉桉树精油。制备出的多苞桉桉树精油保存在密封、不透光的容器中并避光放置。
将制备出的多苞桉桉树精油保存在密封、不透光的容器中并避光放置。对多苞桉桉树精油进行色谱分析，在多苞桉桉树精油中包含1，8-桉树脑(83.8％)、β-甲基异丙基苯(3.43％)、柠檬烯(2.5％)、α-蒎烯(1.8％)、别香橙烯(1.08％)、松油烯-4-醇(0.88％)、α-松油醇(0.58％)、蓝桉烯(0.54％)、P-甲基异丙基苯(0.51％)等。
3、复合菌剂的制备
将上述制备的胆汁酸、多苞桉桉树精油与多形拟杆菌GL-02菌粉以2∶1∶2的质量比均匀混合，即可得到复合菌剂；复合菌剂中的菌含量不少于5×108CFU/g。
实施例3
郑州某兽医诊所于2020年6月收治了一只2岁龄的雄性比熊犬，体重8.6kg。比熊犬出现精神不好、嗜睡、食欲差、消瘦虚弱的问题，且临床检查还发现比熊犬牙龈微微泛黄，存在黄染现象，再经进一步血常规检查后还发现该比熊犬严重贫血，另外比熊犬还具有蜱虫叮咬史，因此兽医判断该比熊犬为巴贝斯焦虫感染。
在比熊犬确诊后，于每天早晚两次给比熊犬服用阿奇霉素和实施例2制备的复合菌剂，其中阿奇霉素的剂量为8mg/kg，复合菌剂的使用量为4g/次；连续服用7天后比熊犬进行初次复查，身体恢复较好，食欲有所增加，各项指标有所恢复。此时，将比熊犬用药进行调整，只于早晚以4g/次的使用量每天服用复合菌剂2次，连续服用7天后，再只于早上以4g/次的使用量每天服用复合菌剂一次，在初次复查14天后，比熊犬食欲恢复正常，黄疸消退，牙齿颜色正常，血常规检查结果如表1所示，可以看出与使用复合菌剂前的指标相比，比熊犬体内炎症消退，血液相关参数，尤其是WBC、MCV、RBC、PLT等均恢复正常，贫血问题基本解决。
表1比熊犬使用复合菌剂前后血液指标对比
Figure BDA0002930675490000051
Figure BDA0002930675490000061
巴贝斯焦虫在红细胞内大量繁殖，破坏红细胞，造成患犬贫血、消瘦、黄疸等问题，而本发明的复合菌剂对宠物犬感染的巴贝斯焦虫产生一定的驱除作用，提高宠物犬体内的血小板、红细胞数、血红蛋白的数量，避免血红蛋白随尿液排出，促进胆汁分泌排泄，恢复胆红素正常代谢，进而改善和解决宠物犬因巴贝斯焦虫感染造成的贫血和黄染问题，同时该复合菌剂还能够促进宠物犬对维生素、矿物质、脂质等营养物质的合成、消化吸收，进而提高营养物质的利用，加快患犬的痊愈速度、帮助恢复食欲。
实施例4
德州某宠物院收治一只8岁龄的雄性苏格兰牧羊犬，体重约为20公斤。苏格兰牧羊犬出现没有精神、不吃不喝、无力、站不起来的症状(图2A)，经血常规、血气、生化检查后，结果显示该犬体内炎症指标上升，且红细胞压积HCT达到14.6，为严重贫血，还同时伴有黄染现象等，医生初步诊断是由于患犬在长期饲养中，只吃剩菜剩饭造成的营养不良以及食用过多盐分和食物不洁导致的食物中毒，进而引发的严重贫血。
确诊后，于每日上午给苏格兰牧羊犬使用盐酸克林霉素注射液进行输液消炎，并同时将8g实施例2制备的复合菌剂溶于患犬饮用水中给其饮用，每日一次，连续治疗3天后，停止输液，继续每日将6g复合菌剂溶于患犬饮用水中让其饮用，再连续服用4天后，苏格兰牧羊犬精神状态明显好转，可以自行站立并且能够自主进食了，且红细胞压积升至33.7，贫血问题得以改善，黄染现象也有所缓解，说明本发明的复合菌剂能够改善动物因营养不良或食物中毒引发的贫血，复合菌剂通过促进营养物质的消化吸收、促进胆汁的分泌来促进宠物犬肠道的蠕动，帮助其恢复食欲，提高体力，同时提高宠物的免疫力，恢复血液中红细胞、胆红素的正常水平和代谢，进而改善贫血、黄染的问题。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用，其特征在于，所述复合菌剂包括多形拟杆菌菌粉、胆汁酸和多苞桉桉树精油。
3.根据权利要求2所述的含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用，其特征在于，所述复合菌剂中多形拟杆菌菌粉、胆汁酸和多苞桉桉树精油的质量比为2-3:2-3:1。
4.根据权利要求2所述的含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用，其特征在于，所述多形拟杆菌菌粉是由保藏编号为CGMCC No. 20818的多形拟杆菌GL-02通过培养发酵干燥制得的。
5.根据权利要求2所述的含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用，其特征在于，所述复合菌剂的菌含量不少于5×108 CFU/g。
6.根据权利要求2所述的含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用，其特征在于，在使用时，所述复合菌剂的用量为4-10 g/d，连续使用5-25天。
7.根据权利要求2所述的含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用，其特征在于，在使用时，10 kg及以下的宠物的所述复合菌剂的用量为4-6 g/d，当宠物的体重每增加10kg，所述复合菌剂的用量增加2-3g/d，连续使用5-25天。
8.根据权利要求2所述的含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用，其特征在于，所述复合菌剂能够通过增加红细胞压积、红细胞和血小板数量来改善宠物贫血。
9.根据权利要求1所述的含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用，其特征在于，所述贫血为巴贝斯焦虫感染、营养不良或食物中毒诱发的贫血。
10.根据权利要求1所述的含有胆汁酸的复合菌剂在用于制备改善或预防宠物贫血的制剂中的应用，其特征在于，所述复合菌剂能够单独使用，或与药物联合使用，或与载体复配混合后使用。
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