CN113016615A - 水稻地下茎的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多年生水稻地下茎的组织培养方法，包括：(1)获得多年生水稻的无菌苗：将多年生水稻种子进行消毒后置于灭菌的生根培养基上培养，种子萌芽生长，培养至3‑5叶期，得到无菌苗；(2)处理无菌苗：修剪无菌苗的部分根、叶，保留根3‑10mm，叶片2‑8cm，获得处理植株；(3)移栽处理植株：将处理后的植株插入透明的地下茎固体培养基中进行培养。本发明通过组织培养的方法培育和观察多年生水稻地下茎，充分发挥了组培在地下茎发育过程研究中的优势。能精确控制培养条件，可连续观察地下茎的生长发育，并且有利于研究环境、激素等对地下茎生长发育的影响，也方便收集根系和地下茎系统的代谢产物，对多年生水稻地下茎的深入研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及多年生水稻栽培技术领域，特别涉及一种多年生水稻地下茎的组织培养方法。
背景技术
地下茎是多年生水稻无性繁殖的器官，对水稻实现多年生至关重要。多年生水稻地下茎在地面以下生长，观察其生长发育非常困难，这也是目前对多年生水稻地下茎的生长发育缺乏深入研究的原因之一。目前对多年生水稻地下茎的观察主要采用两种方法：一是，从土壤中挖掘出整个植株或离体的地下茎，再进行观察。但是多年生水稻的地下茎发达，在地下呈网络状生长，挖掘会对整个植株，尤其是根系和地下茎系统，造成损伤。此外，该方法也无法对多年生水稻地下茎发育过程进行连续的动态观察；二是，利用水培的方法，将多年生水稻的地下系统浸泡在水培液中培养。该方法可以实现对地下茎发育的连续观察，但是水培过程中需要及时更新水培液，且还存在水培液中水分蒸发等问题，从而导致水稻地下系统生长环境不稳定，条件不可控，影响多年生水稻的生长和表型观察。此外，受限于水培装置，水培法无法在整个培养过程中将植株固定住，导致在植株生长过程中由于生长的不对称性，使得植株出现倾斜，会对多年生水稻腋芽的萌发和发育造成影响。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多年生水稻地下茎的组织培养方法，从而克服多年生生长过程中观察地下茎不便，水稻生长环境不稳定的缺点。
为实现上述目的，本发明提供了一种多年生水稻地下茎的组织培养方法，包括：
(1)获得多年生水稻的无菌苗：将多年生水稻种子进行消毒后置于灭菌的生根培养基上培养，种子萌芽生长，培养至3-5叶期，得到无菌苗；
(2)处理无菌苗：修剪无菌苗的部分根、叶，保留根3-10mm，叶片2-8cm，获得处理植株；
(3)移栽处理植株：将处理后的植株插入透明的地下茎固体培养基中进行培养。
优选地，上述技术方案中，步骤(1)多年生水稻种子消毒为将多年生水稻的种子剥除内外颖壳，再将种子置于浓度为0.5-3％的氯化汞溶液中振荡浸泡10-30min，完成种子消毒；
所述生根培养基的制备方法为：在基本培养基内添加15-25g/L蔗糖，制备得到生根培养基。
优选地，上述技术方案中，步骤(3)中培养的条件为：光照10-14h，黑暗10-14h，26-28℃光照培养箱中培养。
优选地，上述技术方案中，步骤(3)地下茎固体培养基包括蔗糖培养基、葡萄糖培养基、果糖培养基、蔗糖山梨醇培养基或蔗糖PEG培养基中的一种。
优选地，上述技术方案中，所述蔗糖培养基的制备方法为：按基本培养基的原料组分加入除凝固剂外的其他组分，再加入工作浓度为40-120g/L的蔗糖，调节pH值为5-6，用水定容后，再加入2.5-5g/L凝固剂，煮沸混匀后，110-121℃灭菌5-30min，待培养基凝固后使用。
优选地，上述技术方案中，所述葡萄糖培养基的制备方法为：按基本培养基的原料组分加入除凝固剂外的其他组分，再加入工作浓度为40-120g/L的葡萄糖，调节pH值为5-6，用水定容后，再加入2.5-5g/L凝固剂，煮沸混匀后，110-115℃灭菌5-20min，待培养基凝固后使用。
优选地，上述技术方案中，所述果糖培养基的制备方法为：按基本培养基的原料组分加入除凝固剂外的其他组分，再加入工作浓度为40-100g/L的果糖，调节pH值为5-6，用水定容后，再加入2.5-5g/L凝固剂，煮沸混匀后，110-115℃灭菌5-20min，待培养基凝固后使用。
优选地，上述技术方案中，所述蔗糖山梨醇培养基的制备方法为：按基本培养基的原料组分加入除凝固剂外的其他组分，再加入工作浓度为20-40g/L的蔗糖和工作浓度为20-120g/L的山梨醇，调节pH值为5-6，用水定容后，再加入2.5-5g/L凝固剂，煮沸混匀后，110-121℃灭菌5-20min，待培养基凝固后使用。
优选地，上述技术方案中，所述蔗糖PEG培养基的制备方法为：按基本培养基的原料组分加入除凝固剂外的其他组分，再加入工作浓度为20-40g/L的蔗糖和工作浓度为20-40g/L的PEG(聚乙二醇)，调节pH值为5-6，用水定容后，再加入2.5-5g/L凝固剂，煮沸混匀后，110-121℃灭菌5-30min，待培养基凝固后使用。
优选地，上述技术方案中，所述基本培养基包括以下组分：N6max储备液、Msmin储备液、Fe2+-EDTA储备液、Vitamin储备液和凝固剂；
凝固剂为Phytagel、琼脂糖、卡拉胶、魔芋胶、黄原胶、或其他透明度高且不毒害植物的凝固剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明多年生水稻地下茎的组织培养方法，将无菌培养的多年生水稻植株插入到人工配置的固体培养基中，使植株地下系统埋入培养基中生长。人工配置的固体培养基相对泥土而言透明度高，根系和地下茎的生长环境相对稳定，既便于地下茎发育的动态观察，又可以对培养条件进行精确控制。同时，植株在生长过程中产生的代谢产物会对周围环境产生影响，相对透明的固体培养基可以直观地观察代谢物对培养基造成的影响(如褐化、水化、软化等)，从而研究整个根系和地下茎的代谢环境，也方便代谢产物的收集。
(2)本发明通过组织培养的方法培育和观察多年生水稻地下茎，充分发挥了组培在地下茎发育过程研究中的优势。能精确控制培养条件，可连续观察地下茎的生长发育，并且有利于研究环境、激素等对地下茎生长发育的影响，也方便收集根系和地下茎系统的代谢产物，对多年生水稻地下茎的深入研究具有重要意义。
附图说明
图1是根据本发明方法剪根、剪叶处理后移栽幼苗在培养基中的图；
图2是根据实施例1方法组织培养多年生水稻的生长情况图；图中A为未修剪水稻叶片和根系的生长情况图；图2中B为修剪水稻叶片和根系的生长情况图；
图3是根据实施例2方法组织培养多年生水稻的生长情况图；
图4是根据实施例3方法组织培养多年生水稻的生长情况图；
图5是根据实施例4方法组织培养多年生水稻的生长情况图；
图6是根据实施例5方法组织培养多年生水稻的生长情况图；
图7是根据实施例6方法组织培养多年生水稻的生长情况图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
用于水稻地下茎组织培养的基本培养基配方如下：
1L的体系中添加的各组分及用量见下表1：
表1
| 组分 | 体积 |
| N6<sub>max</sub>储备液(10×) | 100mL |
| MS<sub>min</sub>储备液(100×) | 10mL |
| Fe<sup>2+</sup>-EDTA储备液(100×) | 10mL |
| Vitamin储备液(100×) | 10mL |
| Phytagel | 3g |
培养基相关母液的配制：
1)N6max储备液(10×)
用蒸馏水定容至1L，室温保存。
2)MSmin储备液(100×)
NaMoO4需要单独溶解后再加入到混合液中，最后用蒸馏水定容至1L，室温保存。
3)Fe2+-EDTA储备液(100×)
2.78g FeSO4·7H2O溶入300mL蒸馏水中，将3.73g EDTA·2H2O溶入70℃的300mL整理水中，待两者全部溶化后，再混溶，70℃水浴中保温2h，用蒸馏水定容至1L，4℃储存备用。
4)Vitamin储备液(100×)
用蒸馏水定容至1000mL，4℃储存备用。
实施例1
一种多年生水稻地下茎的组织培养方法，包括：
(1)获得多年生水稻的无菌苗：剥除多年生水稻种子的颖壳，用质量浓度为1.5％氯化汞溶液浸种15min对种子消毒，期间振荡容器使种子与氯化汞接触。氯化汞回收后，用灭菌蒸馏水清洗种子，然后转移到生根培养基上，培养至3-4叶期；
其中，生根培养基的制备方法为：在基本培养基内添加20g/L蔗糖，制备得到生根培养基。
(2)配制地下茎培养基：按基本培养基的配方向800mL蒸馏水中依次加入除凝固剂(Phytagel)外的其他组分，再加入工作浓度为80g/L的蔗糖，加入蒸馏水溶解，用1N的KOH调节PH值为5.8后，加入3g/L phytagel。定容，微波炉煮沸后混匀，按250mL/瓶分装到500mL的三角瓶中，121℃高温灭菌20min，凝固备用，配制成蔗糖培养基。
(3)多年生水稻苗的处理：将所述步骤(1)中的幼苗从生根培养基中拔出，随机分为两组，一组剪去部分叶片和根系，保留叶片4cm，根5mm；另一组不修剪叶片和根系。
(4)移栽处理后的幼苗：将所述步骤(3)中处理好的多年生水稻幼苗插入到步骤(2)的培养基中(如图1所示)，常规培养；所述常规培养的培养条件为：光照培养箱温度设置为26-28℃，光照时长为12h光照、12h黑暗培养。
(5)观察地下茎的发育情况。
如图2所示，图2中箭头所指为多年生水稻地下茎。图2中A未修剪水稻叶片和根系的生长情况图；图2中B是修剪水稻叶片和根系的生长情况图。
结果表明，应用本发明方法通过剪根、剪叶处理后移栽多年生水稻，与不修剪相比，经过剪根剪叶移栽后，多年生水稻萌发出地下茎，而未经过修剪的植株没有地下茎形成。即经过剪根、剪叶的处理方法可以促进多年生水稻地下茎在培养基上的萌发及生长。
实施例2
一种多年生水稻地下茎的组织培养方法，包括：
(1)获得多年生水稻的无菌苗：剥除多年生水稻种子的颖壳，用质量浓度为1.5％氯化汞溶液浸种15min对种子消毒，期间振荡容器使种子与氯化汞接触。氯化汞回收后，用灭菌蒸馏水清洗种子，然后转移到生根培养基上，培养至3-4叶期；
其中，生根培养基的制备方法为：在基本培养基内添加20g/L蔗糖，制备得到生根培养基。
(2)配制不同工作浓度的地下茎培养基：按基本培养基的配方向800mL蒸馏水中依次加入除凝固剂(Phytagel)外的其他组分，再加入工作浓度分别为20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L，120g/L，140g/L的蔗糖，加入蒸馏水溶解，用1N的KOH调节PH值为5.8后，加入3g/L凝固剂。定容到1L，微波炉煮沸后混匀，按250mL/瓶分装到500mL的三角瓶中，121℃高温灭菌20min，凝固备用，配制成蔗糖培养基。
(3)多年生水稻苗的处理：将所述步骤(1)中的幼苗从生根培养基中拔出，随机分为两组，一组剪去部分叶片和根系，保留叶片4cm，根5mm；另一组不修剪叶片和根系。
(4)移栽处理后的幼苗：将所述步骤(3)中处理好的多年生水稻幼苗插入到步骤(2)的培养基中，常规培养；所述常规培养的培养条件为：光照培养箱温度设置为26-28℃，光照时长为12h光照、12h黑暗培养。
(5)观察地下茎的发育情况。
如图3所示，图3中箭头所指为多年生水稻地下茎。不同工作浓度的蔗糖培养基培养多年生水稻，蔗糖工作浓度在60-120g/L时，有地下茎发育，并能生长良好。
实施例3
一种水稻地下茎的组织培养方法，包括：
(1)获得多年生水稻的无菌苗：剥除多年生水稻种子的颖壳，用质量浓度为1.5％氯化汞溶液浸种15min对种子消毒，期间振荡容器使种子与氯化汞接触。氯化汞回收后，用灭菌蒸馏水清洗种子，然后转移到生根培养基上，培养至3-4叶期；
其中，生根培养基的制备方法为：在基本培养基内添加20g/L蔗糖，制备得到生根培养基。
(2)配制不同工作浓度的地下茎培养基：按基本培养基的配方向800mL蒸馏水中依次加入除凝固剂(Phytagel)外的其他组分，再加入工作浓度为40g/L和80g/L的葡萄糖，加入蒸馏水溶解，用1N的KOH调节PH值为5.8后，加入3g/L凝固剂。定容，微波炉煮沸后混匀，按250mL/瓶分装到500mL的三角瓶中，115℃高温灭菌8min，凝固备用，配制成葡萄糖培养基。
(3)多年生水稻苗的处理：将所述步骤(1)中的幼苗从生根培养基中拔出，随机分为两组，一组剪去部分叶片和根系，保留叶片4cm，根5mm；另一组不修剪叶片和根系。
(4)移栽处理后的幼苗：将所述步骤(3)中处理好的多年生水稻幼苗插入到步骤(2)的培养基中，常规培养；所述常规培养的培养条件为：光照培养箱温度设置为26-28℃，光照时长为12h光照、12h黑暗培养。
(5)观察地下茎的发育情况。
如图4所示，图4中箭头所指为多年生水稻地下茎。多年生水稻在40g/L和80g/L的葡萄糖培养基中有地下茎，并生长良好。
实施例4
一种多年生水稻地下茎的组织培养方法，包括：
(1)获得多年生水稻的无菌苗：剥除多年生水稻种子的颖壳，用质量浓度为1.5％氯化汞溶液浸种15min对种子消毒，期间振荡容器使种子与氯化汞接触。氯化汞回收后，用灭菌蒸馏水清洗种子，然后转移到生根培养基上，培养至3-4叶期；
其中，生根培养基的制备方法为：在基本培养基内添加20g/L蔗糖，制备得到生根培养基。
(2)配制不同工作浓度的地下茎培养基：按基本培养基的配方向800mL蒸馏水中依次加入除凝固剂(Phytagel)外的其他组分，再加入工作浓度为40g/L和80g/L的果糖，加入蒸馏水溶解，用1N的KOH调节PH值为5.8后，加入3g/L凝固剂。定容，微波炉煮沸后混匀，按250mL/瓶分装到500mL的三角瓶中，115℃高温灭菌8min，凝固备用，配制成果糖培养基。
(3)多年生水稻苗的处理：将所述步骤(1)中的幼苗从生根培养基中拔出，随机分为两组，一组剪去部分叶片和根系，保留叶片4cm，根5mm；另一组不修剪叶片和根系。
(4)移栽处理后的幼苗：将所述步骤(3)中处理好的多年生水稻幼苗插入到步骤(2)的培养基中，常规培养；所述常规培养的培养条件为：光照培养箱温度设置为26-28℃，光照时长为12h光照、12h黑暗培养。
(5)观察地下茎的发育情况。
如图5所示，图5中箭头所指为水稻地下茎。多年生水稻在40g/L和80g/L的果糖培养基中有地下茎，并生长良好。
实施例5
一种多年生水稻地下茎的组织培养方法，包括：
(1)获得多年生水稻的无菌苗：剥除多年生水稻种子的颖壳，用质量浓度为1.5％氯化汞溶液浸种15min对种子消毒，期间振荡容器使种子与氯化汞接触。氯化汞回收后，用灭菌蒸馏水清洗种子，然后转移到生根培养基上，培养至3-4叶期；
其中，生根培养基的制备方法为：在基本培养基内添加20g/L蔗糖，制备得到生根培养基。
(2)配制不同工作浓度的地下茎培养基：按基本培养基的配方向800mL蒸馏水中依次加入除凝固剂(Phytagel)外的其他组分，再加入工作浓度为20-40g/L的蔗糖和工作浓度分别为20g/L，40g/L，60g/L，80g/L，100g/L的山梨醇，加入蒸馏水溶解，用1N的KOH调节PH值为5.8后，加入3g/L凝固剂。定容，微波炉煮沸后混匀，按250mL/瓶分装到500mL的三角瓶中，121℃高温灭菌20min，凝固备用，配制成蔗糖山梨醇培养基。
(3)多年生水稻苗的处理：将所述步骤(1)中的幼苗从生根培养基中拔出，随机分为两组，一组剪去部分叶片和根系，保留叶片4cm，根5mm；另一组不修剪叶片和根系。
(4)移栽处理后的幼苗：将所述步骤(3)中处理好的多年生水稻幼苗插入到步骤(2)的培养基中，常规培养；所述常规培养的培养条件为：光照培养箱温度设置为26-28℃，光照时长为12h光照、12h黑暗培养。
(5)观察地下茎的发育情况。
如图6所示，图6中箭头所指为多年生水稻地下茎。多年生水稻在20-40g/L蔗糖的培养基中，加入不同工作浓度的山梨醇培养地下茎。20g/L蔗糖+工作浓度为20g/L、40g/L和60g/L的山梨醇，多年生水稻地下茎能够萌发，并生长良好。40g/L蔗糖+工作浓度在20-100g/L的山梨醇均有地下茎生长。
实施例6
一种多年生水稻地下茎的组织培养方法，包括：
(1)获得多年生水稻的无菌苗：剥除多年生水稻种子的颖壳，用质量浓度为1.5％氯化汞溶液浸种15min对种子消毒，期间振荡容器使种子与氯化汞接触。氯化汞回收后，用灭菌蒸馏水清洗种子，然后转移到生根培养基上，培养至3-4叶期；
其中，生根培养基的制备方法为：在基本培养基内添加20g/L蔗糖，制备得到生根培养基。
(2)配制不同工作浓度的地下茎培养基：按基本培养基的配方向800mL蒸馏水中依次加入除凝固剂(Phytagel)外的其他组分，再加入20g/L的蔗糖和工作浓度分别为20g/L和40g/L的PEG 4000，加入蒸馏水溶解，用1N的KOH调节PH值为5.8后，加入3g/L凝固剂。定容，微波炉煮沸后混匀，按250mL/瓶分装到500mL的三角瓶中，121℃高温灭菌20min，凝固备用，配制成蔗糖山梨醇培养基。
(3)多年生水稻苗的处理：将所述步骤(1)中的幼苗从生根培养基中拔出，随机分为两组，一组剪去部分叶片和根系，保留叶片4cm，根5mm；另一组不修剪叶片和根系。
(4)移栽处理后的幼苗：将所述步骤(3)中处理好的多年生水稻幼苗插入到步骤(2)的培养基中，常规培养；所述常规培养的培养条件为：光照培养箱温度设置为26-28℃，光照时长为12h光照、12h黑暗培养。
(5)观察地下茎的发育情况。
如图7所示，图7中箭头所指为多年生水稻地下茎。多年生水稻在20g/L蔗糖的培养基中，加入工作浓度为20g/L和40g/L的PEG 4000有利于多年生水稻地下茎的形成和发育。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种水稻地下茎的组织培养方法，其特征在于，包括：
(1)获得多年生水稻的无菌苗：将水稻种子进行消毒后置于灭菌的生根培养基上培养，种子萌芽生长，培养至3-5叶期，得到无菌苗；
(2)处理无菌苗：修剪无菌苗的部分根、叶，保留根3-10mm，叶片2-8cm，获得处理植株；
(3)移栽处理植株：将处理后的植株插入透明的地下茎固体培养基中进行培养。
2.根据权利要求1所述的多年生水稻地下茎的组织培养方法，其特征在于，步骤(1)多年生水稻种子消毒为将多年生水稻的种子剥除内外颖壳，再将种子置于浓度为0.5-3％的氯化汞溶液中振荡浸泡10-30min，完成种子消毒；
所述生根培养基的制备方法为：在基本培养基内添加15-25g/L蔗糖，制备得到生根培养基。
3.根据权利要求1所述的多年生水稻地下茎的组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中培养的条件为：光照10-14h，黑暗10-14h，26-28℃光照培养箱中培养。
4.根据权利要求1所述的水稻地下茎的组织培养方法，其特征在于，步骤(3)地下茎固体培养基包括蔗糖培养基、葡萄糖培养基、果糖培养基、蔗糖山梨醇培养基或蔗糖PEG培养基中的一种。
5.根据权利要求4所述的多年生水稻地下茎的组织培养方法，其特征在于，所述蔗糖培养基的制备方法为：按基本培养基的原料组分加入除凝固剂外的其他组分，再加入工作浓度为40-120g/L的蔗糖，调节pH值为5-6，用水定容后，再加入2.5-5g/L凝固剂，煮沸混匀后，110-121℃灭菌5-30min，待培养基凝固后使用。
6.根据权利要求4所述的多年生水稻地下茎的组织培养方法，其特征在于，所述葡萄糖培养基的制备方法为：按基本培养基的原料组分加入除凝固剂外的其他组分，再加入工作浓度为40-120g/L的葡萄糖，调节pH值为5-6，用水定容后，再加入2.5-5g/L凝固剂，煮沸混匀后，110-115℃灭菌5-20min，待培养基凝固后使用。
7.根据权利要求4所述的多年生水稻地下茎的组织培养方法，其特征在于，所述果糖培养基的制备方法为：按基本培养基的原料组分加入除凝固剂外的其他组分，再加入工作浓度为40-120g/L的果糖，调节pH值为5-6，用水定容后，再加入2.5-5g/L凝固剂，煮沸混匀后，110-115℃灭菌5-20min，待培养基凝固后使用。
8.根据权利要求4所述的多年生水稻地下茎的组织培养方法，其特征在于，所述蔗糖山梨醇培养基的制备方法为：按基本培养基的原料组分加入除凝固剂外的其他组分，再加入工作浓度为20-40g/L的蔗糖和工作浓度为20-100g/L的山梨醇，调节pH值为5-6，用水定容后，再加入2.5-5g/L凝固剂，煮沸混匀后，110-121℃灭菌5-30min，待培养基凝固后使用。
9.根据权利要求4所述的多年生水稻地下茎的组织培养方法，其特征在于，所述蔗糖PEG培养基的制备方法为：按基本培养基的原料组分加入除凝固剂外的其他组分，再加入工作浓度为20-40g/L的蔗糖和工作浓度为20-40g/L的PEG，调节pH值为5-6，用水定容后，再加入2.5-5g/L凝固剂，煮沸混匀后，110-121℃灭菌8-30min，待培养基凝固后使用。
10.根据权利要求2、5-9中任一所述的多年生水稻地下茎的组织培养方法，其特征在于，所述基本培养基包括以下组分：N6max储备液、Msmin储备液、Fe2+-EDTA储备液、Vitamin储备液和凝固剂；
所述凝固剂包括Phytagel、琼脂糖、卡拉胶、魔芋胶、黄原胶、或其他透明度高且不毒害植物的凝固剂。
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