CN113005047A - 一株具有解重金属Pb2+作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌XJC‑Z‑9，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.19593。本发明的解淀粉芽孢杆菌XJC‑Z‑9对重金属铅具有一定的吸附作用，并通菌株吸附效率单因素影响的测定实验测定pH、吸附时间、铅初始浓度等对XJC‑Z‑9吸附重金属铅的影响，可通过优化pH、吸附时间、铅初始浓度等来提高对重金属铅的吸附性能，从而提高微生物在环境修复中效率，这对于最大程度发挥微生物在重金属铅污染治理中的作用具有重大意义。

Description

一株具有解重金属Pb2+作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种具有解重金属Pb²⁺作用的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

近年来，随着社会和科学技术的快速发展，重金属铅作为一种优良的材料被应用于工业、生活和考古学等方面，我们最熟悉的铅蓄电池就是重金属铅在我们生活中一个非常重要而且关键的应用。据了解，全世界每年的铅消耗量中，约 40％用于制造蓄电池，约25％以烷基铅的形式加入到汽油中作为防震防爆剂，其他主要用于建筑材料、电缆外套和制造弹药等方面，这其中只有约1/4被回收利用，其余大部分以各种形式排放到环境中造成污染。进入环境中的铅对于动植物特别是人体健康会产生重大影响，而且进入动植物体内的铅也及大部分通过各种途径被人体摄入，导致人体的神经系统，生殖系统和心脑血管等各方面的疾病，甚至致癌，对婴幼儿和孕妇影响更为严重，是目前医疗的一个重大难题。

自重金属导致的各种问题出现以来，各种相关的研究也逐渐开展，目前已取得正大进展。微生物吸附铅作为一种新兴的处理和解决重金属铅问题的方法，有着非常广阔的应用前景，尤其是微生物吸附法在处理含铅重金属废水时，比传统的重金属铅污染废水治理技术具有更多的优势。微生物吸附重金属铅包括两个过程，一个是被动吸附过程，无需消耗能量，是铅离子与微生物细胞壁表面的官能团相结合的过程；另一个是主动吸附过程，较缓慢，需要消耗能量，是铅离子通过微生物的细胞壁扩散进入细胞内的过程。但目前仍缺乏高效吸附铅的微生物吸附法。因此，弄清微生物对重金属铅的吸附机理，从而提高微生物在环境修复中的效率，这对于最大程度发挥微生物在重金属铅污染治理途径中的作用具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种具有解纤维素作用的南海芽孢杆菌及其应用。

本发明的第一个方面是提供一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌XJC-Z-9(Bacillus amyloliquefaciens XJC-Z-9)，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.19593。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述解淀粉芽孢杆菌在吸附 Pb²⁺中的应用。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的解淀粉芽孢杆菌在制备抗重金属微生物制剂中的应用，其中，所述重金属为铅。

其中，所述抗重金属微生物是指在含重金属的水体或土壤中，能对重金属产生抗性和对重金属产生吸附作用的微生物。

本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的解淀粉芽孢杆菌在修复铅污染中的应用。

本发明的第五个方面是提供一种吸附Pb²⁺的微生物方法，采用本发明第一个方面所述解淀粉芽孢杆菌吸附Pb²⁺。

优选地，控制吸附体系的pH为5-7，更优选pH为6。

优选地，控制吸附体系中解淀粉芽孢杆菌吸附时间≥8天，更优选为10天。

优选地，控制吸附体系中Pb²⁺初始浓度为≤200mg/L，更优选为100mg/L。

本发明从实验室提供的46株细菌中筛选出1株满足要求的菌株，能对重金属铅产生一定的吸附作用，菌株编号为XJC-Z-9，筛选实验时测得菌株XJC-Z-9 对重金属铅的吸附率为3.69％，通过生理生化实验和16s RNA生物分子学鉴定，可判定菌株菌株XJC-Z-9为解淀粉芽孢杆菌，并将这株菌作为能吸附重金属铅的代表，进行后续实验的深入研究。在菌株吸附效率单因素影响的测定实验中发现，菌株XJC-Z-9分别在PH＝6、吸附时间8天以上、Pb²⁺初始浓度为200mg/L 以下时，对重金属铅的吸附效率达到最大或达到最大值附近并趋于稳定，PH＝6 时的吸附效率为8.76％，吸附时间为10天时的吸附效率为4.52％，Pb²⁺初始浓度为100mg/L时吸附效率为11.54％。

本发明的解淀粉芽孢杆菌XJC-Z-9对重金属铅具有一定的吸附作用，并通菌株吸附效率单因素影响的测定实验测定pH、吸附时间、铅初始浓度等对XJC-Z-9吸附重金属铅的影响，可通过优化pH、吸附时间、铅初始浓度等来提高对重金属铅的吸附性能，从而提高微生物在环境修复中效率，这对于最大程度发挥微生物在重金属铅污染治理中的作用具有重大意义。

附图说明

图1为硝酸盐还原实验结果。

图2为淀粉水解实验结果。

图3为明胶液化实验结果。

图4为采用Neighbour-Joining法对菌株XJC-Z-9的16S rDNA序列构建的系统发育树。

图5为pH对菌株XJC-Z-9吸附率的影响结果。

图6为吸附时间对菌株XJC-Z-9吸附率的影响结果。

图7为重金属铅初始浓度对菌株XJC-Z-9吸附率的影响

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌XJC-Z-9(Bacillus amyloliquefaciens XJC-Z-9)，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏地址：中国北京，保藏编号为CGMCC No.19593，保藏日期为2020年04月 20日。

1实验材料

1.1实验菌种

实验所用各菌种均由中国热带农业科学院热带生物技术研究所香蕉产业技术研究组从海南省南海永新岛(112°20′22"E,16°49′53"N)软珊瑚中分离获得，并保藏于-20℃备用。

1.2实验试剂

重金属盐硝酸铅Pb(NO₃)₂、去离子水、铅标准溶液(1000μg/mL)、75％酒精、95％酒精。

1.3培养基

本实验均使用LB液体培养基，其配方如表1所示。含重金属铅的培养基在基础培养基中加入相应浓度的Pb(NO₃)₂即可。

表1培养基名称及配方

1.4仪器及设备

接种环、烧杯、玻璃棒、PH计、分析天平、50mL三角瓶、50mL容量瓶等。本实验所用大型仪器设备及其型号如表2所示。

表2仪器设备及型号

2实验方法和结果

2.1菌株筛选

(1)配置重金属培养基

首先配置好液体LB基础培养基，再用分析天平称取一定质量的Pb(NO₃)₂固体溶于基础培养基，使实验所用培养基中重金属铅的浓度为2mmoL/L (666.4514mg/L)，取30mL置于50mL的三角瓶中，用封口膜封口，配置若干瓶灭菌以备用。

(2)接种细菌

在实验室选取46株细菌，每株菌分别接种于灭菌后的重金属液体培养基中，同样封口后同相应的空白对照置于转速为200r/min的摇床上培养4～6天(空白对照为不接菌株的重金属液体培养基)。

(3)测定吸附率

将三角瓶从摇床取下，将长有细菌的重金属液体培养基中速过滤，取滤液稀释200倍后用原子吸收光谱法测定重金属铅的浓度，同时测定空白，计算每株菌的重金属铅的吸附率。选取对重金属铅有吸附作用的菌株进行优化实验。

测定稀释后的重金属浓度前，用铅标准溶液配制浓度为0μg/mL、 0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.5μg/mL和5μg/mL的标准液用于测定标准曲线。

(4)结果

筛选出编号为XJC-Z-9的1株菌有吸附重金属的效果，其余45株菌所接种的培养基中的重金属含量均无明显变化，故编号为XJC-Z-9的菌株为实验所需要的目标菌株，选取这株菌进行鉴定及后续实验，其吸附效率如表3所示。

表3菌株XJC-Z-9的Pb²⁺吸附率

2.2生化理化特征

(1)碳源利用实验

碳源利用基础培养基：(HN₄)₂HPO₄ 2.64g，KH₂PO₄ 2.38g，K₂HPO₄ 5.65g，CuSO₄·5H₂O 0.0064g，MgSO₄·7H₂O 1g，ZnSO₄·7H₂O 0.0015g， MnCl₄·4H₂O 0.0079g，FeSO₄·7H₂O0.0011g，蒸馏水1000mL，琼脂20g， PH 7.2～7.4。不同碳源按照0.5％的浓度加入基础培养。碳源种类如下：肌醇、木聚糖、麦芽糖、甘露糖、松三糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、D-半乳糖、无水乳糖、山梨糖、α-乳糖、鼠李糖、蜜二糖、D-果糖、可溶性淀粉、D-甘露糖。将待测菌种接入培养基30℃恒温培养一周，观察并记录菌种的生长情况。结果见表4，菌株XJC-Z-9可以利用的碳源有麦芽糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、D-半乳糖、无水乳糖、α-乳糖、、D-果糖、可溶性淀粉、D-甘露糖，不可利用的碳源有肌醇、木聚糖、松三糖、木糖、山梨醇、鼠李糖、蜜二糖。

表4 XJC-Z-9的生化理化指标

“+”代表实验结果为阳性；“－”代表实验结果为阴性。

(2)氮源利用实验

氮源利用基础培养基：葡萄糖10.00g、MgS0₄·7H20 0.5g、NaCl 0.05g、FeS0₄·7H₂0 0.001g、K₂HP0₄ 0.01g、蒸馏水1000mL，琼脂20g， PH 7.2。不同氮源按照0.5％的浓度加入基础培养。氮源种类如下：天门冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸、氯化铵、硝酸铵、甲硫氨酸、硫酸铵、四水合钼酸铵、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、草酸铵、乙酸铵、甘氨酸。将待测菌种接入培养基30℃恒温培养一周，观察并记录菌种的生长情况。结果见表4，菌株XJC-Z-9可利用的氮源有天门冬酰胺、组氨酸、精氨酸、硝酸铵、甲硫氨酸、硫酸铵、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸，不可利用的氮源有丝氨酸、酪氨酸、氯化铵、四水合钼酸铵、草酸铵、乙酸铵。

(3)盐耐受实验

用Bennett琼脂培养基作为基础培养基，NaCl浓度分别为0、1％、3％、 5％、7％、9％、11％、13％、15％。Bennett琼脂培养基：葡萄糖10g，酶水解酪素2g，牛肉浸膏1g，酵母浸膏1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。PH 7.0。将待测菌种接入培养基30℃恒温培养一周，观察并记录菌种的生长情况。结果见表5，菌株XJC-Z-9耐盐性在9％以下。

表5盐耐受指标

“+”代表实验结果为阳性；“－”代表实验结果为阴性。

(4)PH实验

MB基础培养基：牛肉膏5g，蛋白胨15g，氯化钠5g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml。A液：KH₂P0₄ 27.218g，蒸馏水1000ml。B液：K₂HP0₄ 45.644g，蒸馏水1000ml。不同PH溶液配比如表6所示。将待测菌种接入培养基摇床培养一周，观察并记录菌种的生长情况。结果如表7所示，菌株XJC-Z-9适合在 PH值为5.0～10.0的范围内生长。

表6 PH实验不同浓度配比

表7 PH适应指标

“+”代表实验结果为阳性；“－”代表实验结果为阴性。

(5)硝酸盐还原实验

硝酸盐还原培养基：KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，NaCl 0.5 g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml，PH7.2。将待测菌种接入硝酸盐培养基中培养一周后，测定硝酸盐还原情况。有些细菌可以使硝酸盐还原成亚硝酸盐、氨和氮等，当在接种细菌的培养液中加入格里氏试剂时，溶液会呈现粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等。结果如图1所示，菌株XJC-Z-9可以使硝酸盐还原。

(6)H₂S产生实验

柴斯纳培养基：蛋白胨10g，柠檬酸铁0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。 PH 7.0。将待测菌种接入柴斯纳培养基中培养一周后，如果培养基产生黑色素，则证明有H₂S的产生。由于H₂S和柠檬酸铁反应会产生FeS，所以培养基会变成黑色。结果显示，菌株XJC-Z-9不能产生硫化氢。

(7)淀粉水解实验

淀粉水解培养基：可溶性淀粉10g，MgCO₃1g，K₂HPO₄ 0.3g，KNO₃ 1g， NaCl 0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，PH 7.0。碘液的制备：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水1000ml，PH7.2～7.4。将待测菌株用点接法接种于淀粉水解琼脂平板上，接种直径不超过5mm。30℃恒温培养一周后，在培养基上喷加碘液。如菌落产生淀粉酶，则菌落周围会产生透明圈。结果如图2所示，菌株XJC-Z-9 不能使淀粉水解。

(8)明胶液化实验

明胶液化培养基：蛋白胨5g，葡萄糖20g，明胶200g，蒸馏水1L，PH 7.2～ 7.4。将待测菌种接入明胶液化培养基中培养一周后，观察培养基情况。此实验主要测定菌株是否可以产生蛋白酶。因为30℃下的明胶呈现液态，20℃以下明胶呈现固态。如果菌株可以产生明胶酶，则可以使明胶培养基在20℃以下也呈现液态。结果如图3所示，菌株XJC-Z-9可以使明胶液化。

(9)脂酶实验

脂酶基础培养基：蛋白胨1g，CaCl₂·7H₂0 0.1g，NaCl 5g琼脂20g，蒸馏水100ml。PH7.4。底物分别加入1g的吐温-20，吐温-40，吐温-80。将待测菌株用点接法接种于培养基平板上。30℃恒温培养一周后，观察菌落周围是否产生模糊透明圈，有模糊圈产生则为阳性，无模糊圈产生则实验为阴性。结果显示，菌株XJC-Z-9不能产生脂酶。

(10)脲酶实验

脲酶培养基：蛋白胨1g，葡萄糖1g，KH₂PO₄ 2g，酚红0.012g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。PH6.8～6.9(微黄)，30g的尿素使用乙醚和培养基分开消毒。当高温灭菌后的培养基冷却至55℃后再将无菌尿素加入培养基。此实验是检测菌株是否具有产生尿素酶的能力。结果显示，菌株XJC-Z-9不能产生尿素酶。

(11)V-P实验

V-P培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K₂HPO₄ 5g，蒸馏水1000ml。V-P试剂：肌酸0.3g，蒸馏水100ml。氢氧化钠溶液：氢氧化钠40g,蒸馏水100ml。将待测菌株接种于V-P培养基中，摇床培养一周。取3ml培养液加入3ml氢氧化钠溶液，再加入一滴肌酸，10min后若溶呈现红色，则证明实验为阳性反应。反之为阴性反应。有些菌株分解葡萄糖产生的丙酮酸，可以进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性下氧化形成二乙酰，可以与蛋白胨里的精氨酸反应，生成红色化合物，即可显示V-P试验为阳性。结果显示，菌株XJC-Z-9V-P 反应呈现阴性。

(12)MR(甲基红)实验

MR培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K₂HPO₄ 5g，蒸馏水1000ml。甲基红试剂：甲基红0.1g，95％乙醇200ml，蒸馏水200ml。将待测菌株接种于MR 培养基中，摇床培养一周，然后在培养基中加入一滴甲基红试剂，如果培养基呈现红色则为阳性反应，呈现黄色为阴性反应。细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，再进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸，使培养基PH降低至4.5以下，甲基红试剂会呈现红色。若细菌分解葡萄糖产生醛、酮、水等，则培养基PH会在5.4 以上，甲基红试剂会呈现橘黄色。结果显示，菌株MR反应呈现阴性。

2.3分子生物学16S rDNA鉴定

选用细菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′) 和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)建立PCR扩增体系进行扩增，如表4。产物经纯化后测定基因序列；采用EzTaxon与GenBank搜索序列相似性，选取相似性较高的模式菌株序列，用MEGA5.05中Neighbor-Joining法比较同源性，构建系统发育树(图4)。结果显示，菌株XJC-Z-9与芽孢杆菌属 (Bacillus)的同源性均较高，大多数的序列聚集在同一节点处，并且具有较近的遗传距离，XJC-Z-9和Bacillus amyloliquefaciens序列在同一节点进行聚集，并且具有较近的遗传距离，表明这些序列为同一个属的，与此同时和其他属遗传距离则较远，进化树所得出的结果与序列比对的种属关系所得出的结果相一致，并将生理生化等方面与其模式菌进行对比后，可将XJC-Z-9鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

表8 PCR反应条件

2.4菌株吸附效率单因素的测定

(1)PH的因素

配置与筛选菌株时相同的重金属液体培养基，但分别调其PH值为3、4、5、 6、7、8、9，分装后灭菌备用。分别将筛选出的菌株接种于PH值不同的重金属液体培养基中，同时设置相应空白对照，全部放在转速为200r/min的摇床上培养4天后过滤、稀释和测定每株菌对重金属铅的吸附率，稀释倍数为10倍。(空白对照为每个PH值对应的不接菌株的重金属液体培养基)

结果如图5所示。每株菌都有最适合生长的PH条件，不同PH条件下，菌株的生长状况不同，导致其对Pb²⁺的吸附效率也不相同，而且Pb²⁺在不同的PH 条件下的存在形式也不相同，经查资料发现在碱性条件下，Pb²⁺会生成Pb(OH)₂沉淀，故PH＝8时的数据不可信。因此，从图5的折线趋势可以发现，菌株XJC-Z-9 在酸性条件下随PH的升高，其吸附率先增大后减小，在PH＝6时最大，为8.76％。

(2)时间的因素

配置与筛选菌株时相同的重金属液体培养基，分装后灭菌备用。分别将筛选出的菌株接种在灭菌后的重金属液体培养基中，同时设置相应的空白对照，全部放在转速为200r/min的摇床上分别培养1、2、4、6、8、10天后取下，过滤、稀释和测定每株菌对重金属铅的吸附率，稀释倍数为10倍。(空白对照为不接菌株的重金属液体培养基)

结果如图6所示。随时间的增加，菌株的数量会逐渐增多，直至培养基中的营养消耗殆尽，其数量才会逐渐趋于稳定，而菌株数量的增加也会导致菌株在吸附的各个阶段的吸附效果不同。从图6中可以看出，菌株XJC-Z-9在前8天对 Pb²⁺的吸附率逐渐增大，第8天后基本趋于稳定，最大为第10天时，吸附率为 4.52％。

(3)浓度的因素

配置与筛选菌株时相同的重金属液体培养基，但分别设置重金属铅的浓度为100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L、1000mg/L，分装后灭菌备用。分别将筛选出的菌株接种在灭菌后的重金属液体培养基中，同时设置相应的空白对照，全部放在转速为200r/min的摇床上培养4天后过滤、稀释和测定每株菌对重金属铅的吸附率，其中浓度为100mg/L、200mg/L、400mg/L、 600mg/L的重金属液体培养基过滤后稀释倍数为10倍，浓度为800mg/L、 1000mg/L重金属液体培养基过滤后稀释倍数为20倍。(空白对照为每个浓度对应的不接菌株的重金属液体培养基)

或

结果如图7所示。由于铅是重金属元素，Pb²⁺在一定程度上会对菌株的生长产生毒性作用，因此不同浓度的Pb²⁺条件下，菌株的生长状况也不相同，导致其对Pb²⁺的吸附率以不一样。从图7中可以看出，菌株XJC-Z-9随Pb²⁺浓度的升高，对Pb²⁺的吸附率逐渐降低，特别是在Pb²⁺浓度大于200mg/L后，菌株 XJC-Z-9对Pb²⁺的吸附率显著降低，实验所测定的菌株XJC-Z-9在Pb²⁺浓度为 100mg/L时的吸附率最大，为11.54％。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌XJC-Z-9，在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏编号为CGMCC NO：19593。

2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在吸附Pb²⁺中的应用。

3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备抗重金属微生物制剂中的应用，其中，所述重金属为铅。

4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在修复铅污染中的应用。

5.一种吸附Pb²⁺的微生物方法，其特征在于，采用权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌吸附Pb²⁺。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，控制吸附体系的pH为5-7，优选pH为6。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，控制吸附体系中解淀粉芽孢杆菌吸附时间≥8天，优选为10天。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，控制吸附体系中Pb²⁺初始浓度为≤200mg/L，优选为100mg/L。

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