CN113004392A - S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
一种S‑腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,包括混合S‑腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂,发生缩合反应,得到第一中间体;混合第一中间体和树脂载体,发生酯化反应,获得第二中间体;去除第二中间体上的氨基保护基,得到第三中间体;混合第一中间体和第三中间体,发生聚合反应,得到第四中间体;去除第四中间体上的氨基保护基,得到第五中间体;剥离第五中间体上的树脂载体,得到第六中间体;及混合第六中间体和载体蛋白,第六中间体和载体蛋白偶联,得到S‑腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。本发明的S‑腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法所制得的S‑腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原具有免疫原性强和特异性佳的优点。
Description
技术领域
本发明涉及人工抗原技术领域,尤其涉及一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,由所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法所制得的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原,及该S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的应用。
背景技术
S-腺苷同型半胱氨酸属于半抗原,自身无免疫原性,需要与合适的载体蛋白偶联后,才能制备出S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。然而,由现有的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法所制得的S-腺苷同型半胱氨酸具有抗原不稳定的缺点,进而导致制得的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原具有免疫原性弱和特异性差的缺点。
发明内容
有鉴于此,有必要提供一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,以解决上述由现有的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法所制得的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原具有免疫原性弱和特异性差的缺点。
另,还有必要提供一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
另,还有必要提供一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的应用。
一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,包括以下步骤:
提供S-腺苷同型半胱氨酸、氨基保护剂、树脂载体、及载体蛋白;
混合所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂,所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂发生缩合反应,得到第一中间体;
混合所述第一中间体和树脂载体,所述第一中间体和树脂载体发生酯化反应,获得第二中间体;
去除所述第二中间体上的氨基保护基,得到第三中间体;
混合所述第一中间体和第三中间体,所述第一中间体和第三中间体发生聚合反应,得到第四中间体;
去除所述第四中间体上的氨基保护基,得到第五中间体;
剥离所述第五中间体上的树脂载体,得到第六中间体;及
混合所述第六中间体和载体蛋白,所述第六中间体和载体蛋白偶联,得到所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
进一步地,所述去除所述第四中间体上的氨基保护基之后,所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:
混合所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体,所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体发生聚合反应,去除氨基保护基,得到第五中间体;和/或
混合所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体,所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体发生聚合反应,去除氨基保护基,重复若干次所述聚合反应和去除产物上的氨基保护基的步骤,得到第五中间体。
进一步地,所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:
将偶联剂加入至第六中间体和载体蛋白的混合物中。
进一步地,所述偶联剂为氯甲酸异丁酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、及六氟磷酸酯或四甲基脲四氟硼酸酯中的至少一种。
进一步地,所述氨基保护剂为9-芴甲氧基羰基酰氯、及9-芴甲基琥珀酰亚氨基碳酸酯中的至少一种;和/或
所述树脂载体为Wang树脂、Sasrin树脂、PMA树脂、及HMPB树脂中的至少一种;和/或
所述载体蛋白包括牛血清蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白以及人血清蛋白中的至少一种;和/或
所述氨基保护剂的浓度为S-腺苷同型半胱氨酸的浓度的1.5~4倍;和/或
所述第一中间体和树脂载体的质量比为8~10:1~3;和/或
所述第六中间体和载体蛋白的质量比为1~3:2~4。
进一步地,所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:
将缩合剂和催化剂加入至所述第一中间体和第三中间体的混合物中。
进一步地,所述缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺、及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的至少一种;和/或
所述催化剂为二甲基氨基吡啶、4-(二甲氨基)吡啶-N-氧化物、及聚吡咯中的至少一种。
进一步地,所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:采用去氨基保护剂去除所述第二中间体和第四中间体上的氨基保护基;和/或
所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:采用剥离剂将树脂载体从所述第五中间体上剥离。
本发明还提供一种上述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法所制得的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
本发明还提供一种上述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原于抗体制备上的应用。
本发明所提供的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法中,所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂发生亲核反应,以保护所述S-腺苷同型半胱氨酸中的α-氨基抗原表位和嘌呤端的伯氨基,防止氨基在后续的步骤中被破坏。所述第一中间体和树脂载体发生酯化反应,获得第二中间体,以支撑第一中间体。去除所述第二中间体上的氨基保护基,得到第三中间体,以便所述第三中间体可通过氨基与第一中间体聚合。混合所述第一中间体和第三中间体,所述第一中间体和第三中间体发生聚合反应,得到第四中间体,从而可提高后续制得的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的分子量,并增加后续制得的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的关键基团的数量。去除所述第四中间体上的氨基保护基,得到第五中间体,以露出所述第五中间体上的氨基,便于后续的偶联反应。剥离所述第五中间体上的树脂载体,得到第六中间体。混合所述第六中间体和载体蛋白,所述第六中间体和载体蛋白偶联,得到所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。由于所述S-腺苷同型半胱氨酸上的氨基由氨基保护剂,并未受到破坏,且所述S-腺苷同型半胱氨酸经过聚合后分子量增大,关键抗原表位得以重复,使得所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原具有较强的特异性和免疫原性。
附图说明
图1是本发明实施例提供的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法的反应原理图。
图2是本发明实施例提供的第一中间体的结晶收率与pH的关系图。
图3是本发明实施例提供的S-腺苷同型半胱氨酸的傅里叶红外鉴定图谱。
图4是本发明实施例提供的第一中间体的傅里叶红外鉴定图谱。
图5是本发明实施例提供的第一中间体、第二中间体、第五中间体的反相高效液相色谱鉴定图谱。
图6是本发明实施例提供的第一中间体的激光共聚焦拉曼鉴定图谱。
图7是本发明实施例提供的第五中间体的激光共聚焦拉曼鉴定图谱。
图8是本发明实施例提供的由对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工抗原诱导的抗血清在与不同浓度的S-腺苷同型半胱氨酸进行ELISA竞争的检测图。
图9是本发明实施例提供的由实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原诱导的抗血清在与不同浓度的S-腺苷同型半胱氨酸进行ELISA竞争的检测图。
图10是本发明实施例提供的由实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原诱导的抗血清与S-腺苷同型半胱氨酸的亲和力的表面等离子共振鉴定图。
图11是本发明实施例提供的由对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工抗原诱导的抗血清与S-腺苷同型半胱氨酸的亲和力的表面等离子共振鉴定图。
图12是本发明实施例提供的由实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原诱导的抗血清与由对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工抗原诱导的抗血清分半与S-腺苷甲硫氨酸标准品进行交叉反应后的检测结果对比图。
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细描述。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式,而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的所有的和任意的组合。
在本发明的各实施例中,为了便于描述而非限制本发明,本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的术语"连接"并非限定于物理的或者机械的连接,不管是直接的还是间接的。"上"、"下"、"下方"、"左"、"右"等仅用于表示相对位置关系,当被描述对象的绝对位置改变后,则该相对位置关系也相应地改变。
请参阅图1,本发明实施例提供一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,包括以下步骤:
步骤S1:提供S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)、氨基保护剂(Fmoc)、树脂载体、及载体蛋白;
步骤S2:混合所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂,所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂发生亲核反应,得到第一中间体(缩写为Fmoc-SAH);
步骤S3:混合所述第一中间体和树脂载体,所述第一中间体和树脂载体发生酯化反应,获得第二中间体;
步骤S4:去除所述第二中间体上的氨基保护基,得到第三中间体;
步骤S5:混合所述第一中间体和第三中间体,所述第一中间体和第三中间体发生聚合反应,得到第四中间体;
步骤S6:去除所述第四中间体上的氨基保护基,得到第五中间体;
步骤S7:剥离所述第五中间体上的树脂载体,得到第六中间体;及
步骤S8:混合所述第六中间体和载体蛋白,所述第六中间体和载体蛋白偶联,得到所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
可以理解的,所述第六中间体为S-腺苷同型半胱氨酸聚合物。
在一实施例中,所述氨基保护剂为9-芴甲氧基羰基酰氯、及9-芴甲基琥珀酰亚氨基碳酸酯中的至少一种。所述氨基保护剂用于保护S-腺苷同型半胱氨酸的关键基团,如α-氨基抗原表位、嘌呤端的伯氨基、及羧基等。从而可避免S-腺苷同型半胱氨酸的非必要的交联,达到控制所述第六中间体的交联度和关键基团的数量的目的。
在一实施例中,所述树脂载体为Wang树脂、Sasrin树脂、PMA树脂、及HMPB树脂中的至少一种。
在一实施例中,可将所述树脂载体加入溶胀剂中20~40min后,再与所述第一中间体混合。所述溶胀剂可为二氯甲烷。
在一实施例中,所述载体蛋白包括牛血清蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白以及人血清蛋白中的至少一种。所述载体蛋白的表面具有氨基。
在一实施例中,采用含20wt%哌啶的二甲基甲酰胺溶液或二乙氨溶液去除所述第二中间体和第四中间体上的氨基保护基,以露出氨基。
在一实施例中,采用剥离剂将树脂载体从所述第五中间体上剥离。所述离剂含有三氟乙酸、水、及硼酸三异丙酯的剥离剂将树脂载体从所述第五中间体上剥离。其中,所述三氟乙酸、水、及硼酸三异丙酯的质量比为=80~100:1~5:1~5,例如为80:1:1、90:1:1、100:1:1、80:1:2、90:1:3、100:1:4、80:2:1、90:2:1、100:2:1、80:3:1、90:4:1、100:5:1、80:5:1、90:5:1、或100:5:1。
在另一实施例中,所述剥离剂含有0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液。
在一实施例中,可采用酸液将所述树脂载体与第五中间体分离,得到第六中间体,即S-腺苷同型半胱氨酸增强型聚合物。具体地,所述酸液可为含三氟乙酸的乙腈水溶液。其中,乙腈的体积百分比为50%,所述三氟乙酸的体积百分比为0.1%。
在一实施例中,获得的第四中间体可采用二氯甲烷冲洗若干次。
在一实施例中,可将所述S-腺苷同型半胱氨酸溶解于溶液中后,再与氨基保护剂混合。具体的,可将S-腺苷同型半胱氨酸加入至碱溶液中,再于冰浴环境下向所述碱溶液中滴加两亲性增溶剂(如四氢呋喃和二氧六环),于0℃下磁力搅拌15min,使所述S-腺苷同型半胱氨酸溶解。
在一实施例中,所述氨基保护剂的用量为S-腺苷同型半胱氨酸的1.5~4摩尔当量,例如为,1.5摩尔当量、2摩尔当量、2.5摩尔当量、3摩尔当量、3.5摩尔当量、或4摩尔当量。
在一实施例中,所述第一中间体和树脂载体的质量比为8~10:1~3,例如为,8:1、8:2、8:3、9:1、9:2、9:3、10:1、11:2、或12:3。
在一实施例中,所述第六中间体和载体蛋白的质量比为1~3:2~4,例如为,1:2、1:3、1:4、2:2、2:3、2:4、3:2、3:3、或3:4。
在一实施例中,所述亲核反应于-2~2℃的温度下反应20~40min后,升温至20~30℃于避光环境下反应10~14h。
在一实施例中,所述第一中间体可于4℃的温度下保存待用。
本发明所提供的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法中,所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂发生亲核反应,以保护所述S-腺苷同型半胱氨酸中的α-氨基抗原表位和嘌呤端的伯氨基,防止氨基在后续的步骤中被破坏。所述第一中间体和树脂载体发生酯化反应,获得第二中间体,以支撑司仪中间体。去除所述第二中间体上的氨基保护基,得到第三中间体,以便所述第三中间体可通过氨基与第一中间体聚合。混合所述第一中间体和第三中间体,所述第一中间体和第三中间体发生聚合反应,得到第四中间体,从而可提高后续制得的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的分子量,并增加后续制得的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的关键基团的数量。去除所述第四中间体上的氨基保护基,得到第五中间体,以露出所述第五中间体上的氨基,便于后续的偶联反应。剥离所述第五中间体上的树脂载体,得到第六中间体。混合所述第六中间体和载体蛋白,所述第六中间体和载体蛋白偶联,得到所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。由于所述S-腺苷同型半胱氨酸上的氨基由氨基保护剂,并未受到破坏,且所述S-腺苷同型半胱氨酸经过聚合后分子量增大,关键抗原表位得以重复,使得所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原具有较强的特异性和免疫原性,生物甲基化快速检测试剂等的制备和开发奠定了坚实基础。
所述去除所述第四中间体上的氨基保护基之后,所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:
混合所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体,所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体发生聚合反应,去除氨基保护基,得到第五中间体。
在一实施例中,重复若干次所述聚合反应和去除产物上的氨基保护基的步骤,得到第五中间体。
在一实施例中,在所述去除氨基保护基的过程中,可对载体树脂加载S-腺苷同型半胱氨酸的替换率进行计算,以确定重复所述聚合反应和去除产物上的氨基保护基的步骤的次数。具体地,将5mg第二中间体/第四中间体加入至2ml的N,N二甲基甲酰胺溶液中,反应30min后,取上清液于N,N二甲基甲酰胺背景调零的紫外-可见光分光光度计中以301nm测吸光值,再通过公式以下计算:替换率=[(101×abs)÷(7.8×m)]×100%,其中,abs为吸光度,m为载体树脂的质量。
本发明技术方案中,混合所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体,所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体发生聚合反应,去除氨基保护基,得到第五中间体,可增加所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的关键基团(如氨基、羧基等),以增强所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的特异性和免疫原性。
所述步骤S2包括以下步骤:
步骤S21:在冰浴环境下,将两亲性增溶剂加入至所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂的混合物中。
在一实施例中,所述两亲性增溶剂可为体积比为1:1的四氢呋喃和二氧六环。
在一实施例中,还可将碱(如质量百分比含量为10%的碳酸钠、或质量百分比含量为10%的碳酸钾等)加入至所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂的混合物中,从而为所述亲核反应提供碱性环境,以促进S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂的缩合。
在一实施例中,可对S-腺苷同型半胱氨酸、第一缩合剂、催化剂、两亲性增溶剂的混合物于0℃的温度下搅拌10~20min,待S-腺苷同型半胱氨酸溶解完全,再加入所述氨基保护剂至所述混合物中,继续于0℃的温度下反应20~40min后,加热至20~40℃,于避光环境下反应10~15h。
在一实施例中,待所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂反应完全后,可采用乙醚萃取至少一次,分离水相后于调节pH为2.5~3,静置2~4min后,过滤析出的结晶,回收结晶,得到所述第一中间体。
请参阅图2,在pH为2.5~3的范围内析出的结晶最多。
请参阅图3,所述S-腺苷同型半胱氨酸在3324cm-1(νNH2 s)、3132cm-1(νNH2 s)处有明显强烈的氨基伸缩振动特征峰,在1602cm-1(δNH2 s)处有强烈的氨基弯曲振动特征峰,1675cm-1(νC-N s)、1205cm-1(νasC-O-C vs)、1015cm-1(νC-O s)、613cm-1(νC-S s)均为S-腺苷同型半胱氨酸分子骨架上的特征基团伸缩振动峰。
请参阅图4,所述第一中间体的氨基伸缩振动和弯曲振动的特征峰消失,1142cm-1(νasC-O-C vs)、684cm-1(νC-S s)、及598cm-1(δN-C=O s)处的S-腺苷同型半胱氨酸骨架特征峰依然存在。此外,在1748cm-1(νC=O vs)处出现了因为引入氨基保护基后产生的α-酮酯的特征峰。
本发明技术方案中,还可在冰浴环境下将两亲性增溶剂加入至所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂的混合物中,以增加所述S-腺苷同型半胱氨酸的溶解度。
所述步骤S3包括以下步骤:
步骤S31:将15~25mg树脂载体分散于二氯甲烷等溶剂中,溶胀20~40min;
步骤S32:将50~55μmol第一中间体溶液加入至含有树脂载体的溶剂中,再加入4~6倍摩尔当量的第一缩合剂,在-2~2℃的温度下下搅拌10~20min后,再加入1~2倍摩尔当量的催化剂,反应50~70min后,再加入4~6倍摩尔当量的乙酰化试剂继续反应20~40min,反应结束后过滤出颗粒,用N,N二甲基甲酰胺溶液冲洗三遍,二氯甲烷冲洗三遍,获得第二中间体。
在一实施例中,所述第一缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺、及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的至少一种。
在一实施例中,所述催化剂为二甲基氨基吡啶、4-(二甲氨基)吡啶-N-氧化物、及聚吡咯中的至少一种。
在一实施例中,所述乙酰化试剂为乙酸酐、及乙酰氯中的至少一种。
所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:
将偶联剂加入至第六中间体和载体蛋白的混合物中。
在一实施例中,所述偶联剂为氯甲酸异丁酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、及六氟磷酸酯或四甲基脲四氟硼酸酯中的至少一种。
在一实施例中,可先将5~15mg第六中间体溶解于2~4mL N,N-二甲基甲酰胺中,冷却至-2~2℃,平衡10~20min后,加入10~20μL氯甲酸异丁酯和15~25μL三乙胺,避光反应50~70min后,逐滴加入至含20~25mg载体蛋白的硼酸缓冲液,升温至室温下继续反应14~18h,再进行浓缩离心和透析,获得S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。其中,硼酸缓冲液的体积为2~6mL,浓度为0.1~0.2M。
本发明技术方案中,将偶联剂加入至第六中间体和载体蛋白的混合物中,以促进所述第六中间体与载体蛋白之间的偶联反应。
请参阅图5,以50%的乙腈水溶液为流动相,对第一中间体、第二中间体、及第五中间体进行反相高效液相色谱分析。分析结果为:第五中间体的保留时间为5.40min,第一中间体的保留时间为4.83min,第二中间体具有第一中间体和第五中间体所对应的特征保留时间。
请参阅图6,所述第一中间体在684cm-1和705cm-1处的峰为碳硫键特征峰。
请参阅图7,所述第五中间体在684cm-1和705cm-1处的碳硫键特征峰较强,在1290cm-1处出现了聚合后特有的仲胺特征峰。表明所述第五中间体为S-腺苷同型半胱氨酸聚合物。
所述步骤S5包括:
将第二缩合剂和缚酸剂加入至所述第一中间体和第三中间体的混合物中。
在一实施例中,所述第二缩合剂为六氟磷酸酯、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基、及三吡咯烷基溴化磷六氟磷酸盐中的至少一种。
在一实施例中,所述缚酸剂为二异丙基乙胺、三乙胺、三乙胺与氯化镁的混合物、及三乙胺与溴化锂的混合物中的至少一种。
在所述聚合反应过程中,可采用Kaiser试剂检测游离氨基酸的含量,从而监控聚合反应是否进行彻底。若聚合反应不彻底,需重复该聚合反应。此外,可以通过控制该聚合反应的循环次数来有目的地增加第六中间体的分子量。
本发明技术方案中,将第二缩合剂和缚酸剂加入至所述第一中间体和第三中间体的混合物中,以实现所述第三中间体与第一中间体的定向聚合。
本发明实施例还提供一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原由上述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法制得。
由于该S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原由上述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法制得,因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果,在此不再一一赘述。
本发明实施例还提供一种所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原于抗体制备上的应用。
下面通过具体的实施例来对本发明进行具体说明。
实施例一
将1mg碳酸钠溶于10mL去离子水中,碳酸钠完全溶解后加入0.26mmol S-腺苷同型半胱氨酸,在冰浴环境下缓慢滴加2.5mL四氢呋喃和2.5mL二氧六环,滴加完毕后于0℃下磁力搅拌15min,待S-腺苷同型半胱氨酸溶解完全后,加入2.5倍摩尔当量的9-芴甲氧基羰基酰氯,于0℃下继续反应30分钟后,升温至25℃于避光环境下反应12小时。反应结束后加入10mL乙醚萃取三遍,分离水相后于调节pH为3,静置3分钟后过滤析出的结晶,通过冻干机冷冻干燥回收结晶,得到第一中间体;
将20mg Wang树脂加入10mL二氯甲烷中浸泡溶胀30分钟后,过滤干燥回收待用;
将54.5μmol的第一中间体溶解于分散有Wang树脂的二氯甲烷中,加入5倍摩尔当量的N,N-二异丙基碳二亚胺在0℃下搅拌15分钟后,加入1倍摩尔当量的二甲基氨基吡啶反应1小时,之后加入5倍摩尔当量的乙酸酐继续反应30分钟,反应结束后过滤出颗粒,用N,N二甲基甲酰胺溶液N,N-二甲基甲酰胺冲洗三遍,二氯甲烷冲洗三遍,获得第二中间体;
将所述第二中间体加入至5mL的含20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中反应30分钟,得到第三中间体;
向所述第三中间体中加入第一中间体、4倍摩尔当量的二异丙基乙二胺、和3倍摩尔当量的六氟磷酸酯反应30分钟,反应结束后顺序用N,N-二甲基甲酰胺冲洗三遍,二氯甲烷冲洗三遍,得到第四中间体;
将所述第四中间体加入至5mL的含20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中反应30min,得到第五中间体;
将所述第五中间体加入5mL含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液,去除载体树脂,得到第六中间体;及
混合10mg第六中间体溶解于3mL N,N-二甲基甲酰胺中,冷却至0℃,平衡15min后,加入16μL氯甲酸异丁酯和20μL三乙胺,避光反应1小时后,逐滴加入至4mL含25mg卵清蛋白的0.1M硼酸缓冲液中,升温至室温继续反应16小时,对产物进行浓缩离心和透析处理,获得实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原,于4℃的温度下保存该实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
对比例一
对比例一与实施例一的区别为:未向所述第三中间体中加入第一中间体、4倍摩尔当量的二异丙基乙二胺、和3倍摩尔当量的六氟磷酸酯,并反应30分钟,而是直接对第三中间体进行了除氨基保护基的处理、去除载体树脂的处理、及与卵清蛋白偶联的处理,获得对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工抗原。
其他步骤与实施例一的步骤相同,在此不再赘述。
采用0.9%生理盐水稀释实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原,直至实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的浓度到达1mg/mL,获得实施例一的测试液。将50μL实施例一的测试液与50μL佐剂进行配伍后,注射至8周龄的BALB/C小鼠的大腿肌肉处。第两周后进行第二次免疫。第三周后取鼠尾血进行第一次小分子酶联免疫吸附(ELISA)竞争实验。
采用0.9%生理盐水稀释对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工抗原,直至对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的浓度到达1mg/mL,获得对比例一的测试液。将50μL对比例一的测试液与50μL佐剂进行配伍后,注射至8周龄的BALB/C小鼠的大腿肌肉处。第两周后进行第二次免疫。第三周后取鼠尾血进行第二次小分子酶联免疫吸附(ELISA)竞争实验。
所述第一次小分子酶联免疫吸附(ELISA)竞争实验包括以下步骤:
将浓度为0.05M pH为9.6的碳酸缓冲液加入至实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原中,得到浓度为1μg/mL的溶液,以该溶液包被ELISA 96孔板并于4℃的温度下孵育过夜,之后倒掉包被液,用含0.05%Tween20的浓度为0.02M磷酸盐吐温缓冲液洗涤三次后在吸水纸上拍干,再加入含1%牛血清蛋白的磷酸盐吐温缓冲液,于37℃的温度下封闭2小时,将S-腺苷同型半胱氨酸配制成系列浓度(10mg/mL、1mg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL)分别与稀释1000倍的实施例一的鼠尾血按照1:1混匀后,按浓度梯度加入96孔板中,于37℃的温度下孵育一小时,并设一个空白对照孔。之后用PBST洗板3次后加入1:4000稀释的酶标二抗,于37℃的温度下孵育1小时,之后再用磷酸盐吐温洗板3次后,加入含邻苯二胺(OPD)的显色液,显色15min后,用硫酸终止液终止反应,立即用酶标仪检测OD值。
所述第二次小分子酶联免疫吸附(ELISA)竞争实验与所述第一次小分子酶联免疫吸附(ELISA)竞争实验类似,区别在于,所述第二次小分子酶联免疫吸附(ELISA)竞争实验采用了对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工抗原和对比例一的鼠尾血。
参图8和图9,S-腺苷同型半胱氨酸分子与包被的S-腺苷同型半胱氨酸抗原都与实施例一的鼠尾血中的抗体和对比例一的鼠尾血中的抗体发生了竞争性结合,其OD值依照S-腺苷同型半胱氨酸的浓度梯度呈现出了明显的负相关。图9中的拟合曲线的R2值相比图8中拟合曲线的R2值更大,即,0.97152>0.92569。这表明,实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原有效地刺激了小鼠免疫B淋巴细胞产生出多克隆抗体。相较于对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工抗原,实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原可刺激小鼠免疫B淋巴细胞产生出更多的多克隆抗体。这表明,实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原具有更好的免疫原性和免疫特异性。
将实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原免疫得到的抗血清稀释1000倍后通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC-NHS)固定于CM5芯片的第二泳道。与此同时,将对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工抗原免疫得到的抗血清稀释1000倍后通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC-NHS)固定于CM5芯片的第四泳道。将S-腺苷同型半胱氨酸配制成系列浓度的溶液(1μg/mL、200ng/mL、40ng/mL、8ng/mL、1.6ng/mL、0.32ng/mL)作为流动相,设置流速为10μL/min,接触时间和洗脱时间均为120秒,分别流经第二和第四泳道,进行表面等离子共振,检测不同抗原免疫所得抗体对S-腺苷同型半胱氨酸小分子的亲和常数。
参图10,对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工抗原免疫得到的抗血清的亲和常数KD=1.72×10-6。参图11,实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原由免疫得到的抗血清的亲和常数KD=2.99×10-8。亲和常数越小,亲和力越强。这表明,实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原具有更好的免疫原性和免疫特异性,可诱导产生对S-腺苷同型半胱氨酸小分子具有更强亲和力的抗体。
将浓度为0.05M,pH为9.6的碳酸缓冲液加入至实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原中,得到浓度为1μg/mL的溶液,以该溶液包被ELISA 96孔板并于4℃孵育过夜,之后倒掉包被液,用含0.05%Tween20的浓度为0.02M磷酸盐吐温缓冲液洗涤三次后在吸水纸上拍干,再加入含1%牛血清蛋白的磷酸盐吐温缓冲液于37℃的温度下封闭2小时。将S-腺苷同型半胱氨酸配制成系列浓度(10mg/mL、1mg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL)后,分别与以实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原为抗原免疫得到的已稀释1000倍的抗血清按照1:1混匀后,按浓度梯度加入到96孔板中,于37℃的温度下孵育1小时,并设一个空白对照孔。同样的,将S-腺苷同型半胱氨酸配制成系列浓度(10mg/mL、1mg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL)后,分别与以对比例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工抗原为抗原免疫得到的已稀释1000倍的抗血清按照1:1混匀后,按浓度梯度加入到96孔板中,于37℃的温度下孵育1小时,并设一个空白对照孔。之后均用磷酸盐吐温缓冲液洗板3次后,加入1:4000稀释的酶标二抗,于37℃的温度下孵育1h,之后再用磷酸盐吐温缓冲液洗板3次后,加入含邻苯二胺(OPD)的显色液,显色15分钟后用硫酸终止液终止反应,立即用酶标仪检测OD值。
参图12,实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原免疫后得到的多克隆抗体与S-腺苷基甲硫氨酸标准品的交叉反应的程度更小。这表明,实施例一的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原具有较佳的特异性。
在一实施例中,磷酸盐(PBS)缓冲液的制备方法包括:
将2.3g Na2HPO4、0.524g NaH2PO4·H2O、以及8.77g NaCl溶于纯水中,用去离子水定容至1L,调节pH至7.4,得到浓度为0.02M的磷酸盐缓冲液。
在一实施例中,用于透析的透析液的制备方法包括:
将磷酸盐缓冲液稀释2倍即可。
在一实施例中,磷酸盐吐温(PBST)缓冲液的制备方法包括:
向所述浓度为0.02M的磷酸盐缓冲液中加入Tween20,溶解完全即可。所述Tween20的体积为磷酸盐缓冲液的体积的0.05%。
所述Tween20为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物。
在一实施例中,封闭液的制备方法包括:
向磷酸盐吐温缓冲液中加入牛血清白蛋白,溶解完全即可。所述BSA的体积为磷酸盐吐温缓冲液的体积的1%。
在一实施例中,碳酸盐(CBS)缓冲液的制备方法包括:
将1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3溶于去离子水中,定容至100ml,调节pH至9.6,得到浓度为0.5M的碳酸盐缓冲液。
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照以上较佳实施方式对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
提供S-腺苷同型半胱氨酸、氨基保护剂、树脂载体、及载体蛋白;
混合所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂,所述S-腺苷同型半胱氨酸和氨基保护剂发生缩合反应,得到第一中间体;
混合所述第一中间体和树脂载体,所述第一中间体和树脂载体发生酯化反应,获得第二中间体;
去除所述第二中间体上的氨基保护基,得到第三中间体;
混合所述第一中间体和第三中间体,所述第一中间体和第三中间体发生聚合反应,得到第四中间体;
去除所述第四中间体上的氨基保护基,得到第五中间体;
剥离所述第五中间体上的树脂载体,得到第六中间体;及
混合所述第六中间体和载体蛋白,所述第六中间体和载体蛋白偶联,得到所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
2.根据权利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,其特征在于,所述去除所述第四中间体上的氨基保护基之后,所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:
混合所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体,所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体发生聚合反应,去除氨基保护基,得到第五中间体;和/或
混合所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体,所述第一中间体和所述去除氨基保护基的第四中间体发生聚合反应,去除氨基保护基,重复若干次所述聚合反应和去除产物上的氨基保护基的步骤,得到第五中间体。
3.根据权利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,其特征在于,所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:
将偶联剂加入至第六中间体和载体蛋白的混合物中。
4.根据权利要求3所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,其特征在于,所述偶联剂为氯甲酸异丁酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺、及六氟磷酸酯或四甲基脲四氟硼酸酯中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,其特征在于,所述氨基保护剂为9-芴甲氧基羰基酰氯、及9-芴甲基琥珀酰亚氨基碳酸酯中的至少一种;和/或
所述树脂载体为Wang树脂、Sasrin树脂、PMA树脂、及HMPB树脂中的至少一种;和/或
所述载体蛋白包括牛血清蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白以及人血清蛋白中的至少一种;和/或
所述氨基保护剂的浓度为S-腺苷同型半胱氨酸的浓度的1.5~4倍;和/或
所述第一中间体和树脂载体的质量比为8~10:1~3;和/或
所述第六中间体和载体蛋白的质量比为1~3:2~4。
6.根据权利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,其特征在于,所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:
将缩合剂和催化剂加入至所述第一中间体和第三中间体的混合物中。
7.根据权利要求6所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,其特征在于,所述缩合剂为N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N-二环己基碳二亚胺、及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的至少一种;和/或
所述催化剂为二甲基氨基吡啶、4-(二甲氨基)吡啶-N-氧化物、及聚吡咯中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法,其特征在于,所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:采用去氨基保护剂去除所述第二中间体和第四中间体上的氨基保护基;和/或
所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法还包括:采用剥离剂将树脂载体从所述第五中间体上剥离。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原的制备方法所制得的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
10.一种S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原于抗体制备上的应用,其特征在于,所述S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原为权利要求9所述的S-腺苷同型半胱氨酸人工完全抗原。
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