CN112999209A - 海参甾醇脂质体在提高人体顺式虾青素含量制品中的应用 - Google Patents
海参甾醇脂质体在提高人体顺式虾青素含量制品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药领域的药物/保健品(功能性食品)的应用技术领域，具体涉及海参甾醇脂质体在提高人体顺式虾青素含量制品中的应用。通过海参甾醇制备的包埋虾青素脂质体，可以提高虾青素的生物利用率，避免具有多不饱和结构的虾青素降解，同时激活体内类胡萝卜素异构酶RPE65，使全反式虾青素发生异构化反应变为顺式虾青素，从而提高人体内的顺式虾青素含量。本发明首次发现海参甾醇制备脂质体可以明显升高血清中虾青素的含量，且顺式虾青素比例更高，且与现常见胆固醇脂质体相比，其具有良好的安全性，具有较好的应用前景。
Description
技术领域：
本发明属于医药领域的药物/保健品(功能性食品)的应用技术领域，具体涉及海参甾醇脂质体在提高人体顺式虾青素含量制品中的应用。
背景技术：
虾青素(Astaxanthin)是一种脂溶性的天然类胡萝卜素，具有抗氧化、增强免疫力、抗炎活性、预防心血管疾病等生物活性。特别的，人体不能合成虾青素和虾青素酯，只能从食物中摄取，而且动物体内虾青素的吸收、转化和蓄积具有很强的选择性。
自然界中，游离态虾青素多是以全反式虾青素存在，是虾青素热力学中最稳定的形式。虾青素为长链不饱和双键结构体系，因此其性质不稳定，易于被氧化和异构化。虾青素对温度、光线、氧气均敏感，9-顺式虾青素和13-顺式虾青素都是主要的虾青素异构体，并且顺反异构体之间是可以互相转化的。研究显示，不同的虾青素异构体所表现出的生物学功能活性具有差异性，体外模拟试验证明，与全反式虾青素相比，9-顺式虾青素和13-顺式虾青素在多模拟体系中具有更高的抗氧化活性。因此，提高人摄取虾青素后的顺式虾青素比例，能更好的发挥虾青素生物功效。
虾青素在摄取后能否发挥生物活性不仅仅在于其本身的结构，也与其吸收利用或储存在人体中的浓度密切相关。目前对于虾青素在体内吸收代谢过程的研究相对较少，根据其脂溶性特质，在饮食中添加油脂，可以有效提高虾青素生物利用度。虾青素的多不饱和结构使其极易发生降解，导致其产品品质和生理活性下降。研究显示，不同运载体中虾青素的稳定性也不同，运载体系可以在加工和贮藏过程中提供保护作用，可在一定程度上改善虾青素的稳定性。通过设计运载体系可以提高虾青素水相介质的分散性，扩大其应用范围，同时改善虾青素的口服生物利用度。因此，制备新型的虾青素运载体，更有利于人体虾青素的吸收。
脂质体(Liposome)是目前常用的运载体系，由双亲性物质磷脂分散在水相层，经自聚集形成的具有类似生物膜结构的超微球状粒子，可以包裹亲水、亲脂和两亲性的物质，提高功能性因子的生物利用度。制备脂质体过程中需要加入胆固醇提高其稳定性，而血清胆固醇过高存在引起冠心病的风险。
海参甾醇(Sea cucumber sterol)是海参中含有的一类特殊结构的甾类化合物，在改善机体糖脂代谢紊乱以及炎症方面发挥显著功效。海参甾醇结构与胆固醇类似，它们都是环戊烷多氢菲结构，且C-17上含有一个碳氢侧链，并具有一个或多个双键。两者结构不同的是，胆固醇C-3上为羟基，而海参甾醇C-3上为硫酸基团，硫酸基团属阴离子表面活性剂，具有很强的亲水性，与卵磷脂的亲水性头基结合得更加紧密，可以抑制磷脂不饱和链的暴露，从而使得磷脂不易氧化，以此获得更好的氧化稳定性。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是：与全反式虾青素相比，9-顺式虾青素和13-顺式虾青素在多模拟体系中具有更高的抗氧化活性。因此，如何提高人摄取虾青素后的顺式虾青素比例，更好的发挥虾青素生物功效是急需解决的问题。
为解决上述问题，本发明提供了海参甾醇脂质体在提高人体顺式虾青素含量制品中的应用，利用海参甾醇脂质体包埋虾青素，可以提高虾青素的生物利用率，避免具有多不饱和结构的虾青素降解，同时激活体内类胡萝卜素异构酶RPE65，使全反式虾青素发生异构化反应变为顺式虾青素，从而提高人体内的顺式虾青素含量。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现，海参甾醇脂质体在提高人体顺式虾青素含量制品中的应用。海参甾醇制备脂质体包埋虾青素时，富含海参甾醇的脂质体外壁在通过肠壁，进入细胞器时，激活体内类胡萝卜素异构酶RPE65，使全反式虾青素发生异构化反应变为顺式虾青素，从而对虾青素起到促进异构作用。
进一步的，所述海参甾醇为单一种类的海参甾醇或不同种类海参甾醇的组合；所述虾青素为单一种类的虾青素或顺式和反式虾青素的混合物。
进一步的，所述海参甾醇脂质体指脂质体膜材料中含有海参甾醇，其中所述脂质体的膜材料组分及其重量百分比为：磷脂类物质66.7％-90％，海参甾醇10％-33.3％，虾青素包埋量达到17％以上，不含胆固醇；平均粒度为100-200nm，分散性好，包封虾青素时包封率为90％以上。
进一步的，所述海参甾醇脂质体为包埋虾青素的脂质体。人体膳食中的虾青素含量有限，在海参甾醇脂质体中包埋虾青素，能够在加工和贮藏过程中改善虾青素的稳定性，提高虾青素水相介质的分散性，扩大其应用范围，同时改善虾青素的口服生物利用度。
进一步的，所述虾青素为单一种类的虾青素或不同种类虾青素的组合。
进一步的，上述制品为药品、食品、功能性食品或膳食补充剂。所述药物的使用方法为口服；所述功能性食品包括牛乳、饮料或焙烤类食品等。
一种提高人体顺式虾青素含量的制品，包括包埋虾青素的海参甾醇脂质体。
进一步的，所述制品为乳剂或粉剂。
本发明的有益效果在于：
(1)海参甾醇脂质体在提高人体顺式虾青素含量制品中的应用。
(2)给出了一种提高人体顺式虾青素含量的方法，提高了虾青素的生物利用率。
(3)给出了一种新型的提高人体顺式虾青素含量的制品。
(4)首次发现海参甾醇制备脂质体可以明显升高血清中虾青素的含量，且顺式虾青素比例更高，且与现常见胆固醇脂质体相比，其具有良好的安全性，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为小鼠灌胃100mg/kg BW虾青素灌胃剂后血清中虾青素的浓度变化；
其中，A是游离虾青素组，LSA是海参甾醇虾青素脂质体组，LCA是胆固醇虾青素脂质体组，S+A是海参甾醇虾青素简单混合组，C+A是胆固醇虾青素简单混合组。
图2为小鼠灌胃100mg/kg BW虾青素灌胃剂后血清虾青素异构体的浓度；
其中，A是游离虾青素组，LSA是海参甾醇虾青素脂质体组，LCA是胆固醇虾青素脂质体组，S+A是海参甾醇虾青素简单混合组，C+A是胆固醇虾青素简单混合组。
图3为小鼠灌胃50mg/kg BW虾青素灌胃剂后血清中虾青素的浓度变化；
其中，A是游离虾青素组，LSA是海参甾醇虾青素脂质体组，LCA是胆固醇虾青素脂质体组，S+A是海参甾醇虾青素简单混合组，C+A是胆固醇虾青素简单混合组。
图4为小鼠灌胃50mg/kg BW虾青素灌胃剂后血清虾青素异构体的浓度；
其中，A是游离虾青素组，LSA是海参甾醇虾青素脂质体组，LCA是胆固醇虾青素脂质体组，S+A是海参甾醇虾青素简单混合组，C+A是胆固醇虾青素简单混合组。
具体实施方式：
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：海参甾醇为原料制备脂质体包埋虾青素的药物和保健品(功能性食品)的小鼠消化吸收试验
为了观察以海参甾醇为原料制备的脂质体在虾青素消化吸收中的作用效果，本试验通过利用不同的原料制备脂质体，或直接混合的方法，给予模型小鼠灌胃虾青素不同乳剂和游离虾青素，研究不同运载体系虾青素在小鼠血清中的浓度-时间曲线，以及不同异构体比例，考察其在吸收代谢和生物利用率方面的差异性。试验结果表明海参甾醇制备的脂质体具有明显的升高血清虾青素特别是顺式虾青素的作用。
1.方法
1.1灌胃乳剂的配置
游离虾青素灌胃剂：50mg游离态虾青素加入到5ml生理盐水中，加入总体系2％的吐温20，冰浴超声后，用细胞破碎仪破碎，最终将虾青素制成10mg/ml的乳液用于小鼠灌胃。
海参甾醇虾青素脂质体：将200mg虾青素，400mg海参甾醇与1200mg蛋黄磷脂溶解于氯仿和甲醇的混合溶液中,振荡充分混合后,减压蒸发除去有机溶剂使溶液形成一层均匀薄膜后,真空干燥；向薄膜中加入20ml生理盐水,在超声仪中将薄膜溶解分散均匀,得到虾青素脂质体混悬液，细胞破碎，最终制成虾青素浓度10mg/ml、海参甾醇20mg/ml的脂质体，用于小鼠灌胃。
胆固醇虾青素脂质体：将200mg虾青素，400mg胆固醇与1200mg蛋黄磷脂溶解于氯仿和甲醇的混合溶液中,振荡充分混合后,减压蒸发除去有机溶剂使溶液形成一层均匀薄膜后,真空干燥；向薄膜中加入20ml生理盐水,在超声仪中将薄膜溶解分散均匀,得到虾青素脂质体混悬液，细胞破碎，最终制成虾青素浓度10mg/ml、胆固醇20mg/ml脂质体，用于小鼠灌胃。
海参甾醇虾青素简单混合灌胃剂：100mg游离态虾青素和200mg海参甾醇加入到10ml生理盐水中，加入总体系2％的吐温20，冰浴超声，破碎。最终将制成虾青素浓度10mg/ml、海参甾醇20mg/ml的乳液用于小鼠灌胃。
胆固醇虾青素简单混合灌胃剂：100mg游离态虾青素和200mg胆固醇加入到10ml生理盐水中，加入总体系2％的吐温20，冰浴超声，破碎。最终将制成虾青素浓度10mg/ml、胆固醇20mg/ml的乳液用于小鼠灌胃。
利用本发明方法制得的脂质体性质稳定，平均粒度为100-200nm，PDI为0.2-0.3，分散性好，包封率可达90％以上。
1.2动物实验
Balb/c小鼠给予基础饲料适应性喂养7d后，按照体重随机分为5组：游离虾青素组(A)，海参甾醇虾青素脂质体组(LSA),胆固醇虾青素脂质体组(LCA),甾醇虾青素简单混合组(S+A)，胆固醇虾青素简单混合组(C+A)。实验前禁食不禁水10h，各实验组按虾青素剂量100mg/kg BW灌胃不同灌胃剂，灌胃结束后正常进水，分别于灌胃后2,4,6,8,12,14h后取血。
1.3血清虾青素测定方法
分离血清，按照血清提脂的方法处理。取100ul血清样品，加入2ml氯仿，2ml甲醇，1.7ml超纯水充分涡旋混匀，离心后取下层氯仿层减压浓缩，用初始流动相复溶，过膜，液相分析测定血清各种虾青素水平。
2.结果
海参甾醇制备脂质体包埋虾青素可以显著升高血清虾青素含量及顺式虾青素比例。
图1为实施例1试验小鼠在灌胃不同灌胃剂后，血清中虾青素浓度-时间曲线。从图中看出，灌胃后，脂质体形式包埋虾青素的小鼠血清中的虾青素浓度明显上升，且显著高于游离形式的虾青素。两种脂质体形式虾青素在血清中的含量变化趋势相似，均在4h时，血清中的虾青素浓度达到最高峰值，海参甾醇组为0.40μg/mL，胆固醇组为0.38μg/mL；在随后的4-14h内，血清中的虾青素浓度缓慢下降，到14h时，其在血清中浓度分别为0.29μg/mL和0.35μg/mL，仍保持较高水平。而游离虾青素组和直接简单混合的两组在6h时，才达到血清中虾青素积累浓度峰值，游离组为0.13μg/mL；海参甾醇简单混合组为0.14μg/mL；胆固醇简单混合组为0.12μg/mL。而且在随后的6-14h，血清中虾青素浓度逐渐下降，到14h时，血清中虾青素浓度仅分别为0.03μg/mL、0.028μg/mL和0.03μg/mL。海参甾醇脂质体组不仅缩短了虾青素进入血液的时间，同时也提高了血液虾青素浓度。
图2反映了海参甾醇虾青素脂质体可以提高血清中顺式虾青素比例。以4h时的生物样本为研究对象，考察虾青素在消化吸收过程中异构体的变化，通过HPLC分析小鼠血清中9-顺式虾青素、13-顺式虾青素和全反式虾青素的浓度。灌胃100mg/kg BW虾青素4h后，血清中虾青素异构体浓度如图2所示。所有组小鼠血清中均检测出2种虾青素异构体，13-顺式虾青素和全反式虾青素。从图中可以看出，不同形式的虾青素灌胃乳剂，在消化吸收过程中，虾青素异构体的组成比例具有明显差异。其中游离虾青素组在4h时，13-顺式和全反式两种异构体相对含量分别为：40％和60％；海参甾醇和虾青素简单混合组的13-顺式虾青素和全反式虾青素异构体的相对含量分别为：40.6％和59.3％；胆固醇和虾青素简单混合组的13-顺式虾青素和全反式虾青素异构体的相对含量分别为：43.2％和56.7％，三组相差不大。而海参甾醇虾青素脂质体组实验结果显示：13-顺式虾青素和全反式虾青素异构体的相对含量分别为：79.1％和20.9％，顺式占更高比例，胆固醇虾青素脂质体组实验结果显示：13-顺式虾青素和全反式虾青素异构体的相对含量分别为：12.5％和87.5％，全反式虾青素比例显著高于13-顺式虾青素。脂质体形式的虾青素顺反异构均与直接混合游离虾青素相比发生显著变化。
实施例2：
1.方法
1.1灌胃乳剂的配置
游离虾青素灌胃剂：50mg游离态虾青素加入到10ml生理盐水中，加入总体系2％的吐温20，冰浴超声促溶后，用细胞破碎仪破碎，最终将虾青素制成5mg/ml的乳液用于小鼠灌胃。
海参甾醇虾青素脂质体：将100mg虾青素，150mg海参甾醇与1200mg蛋黄磷脂溶解于氯仿和甲醇的混合溶液中,振荡充分混合后,减压蒸发除去有机溶剂使溶液形成一层均匀薄膜后,真空干燥；向薄膜中加入20ml生理盐水,在超声仪中将薄膜溶解分散均匀,得到虾青素脂质体混悬液，细胞破碎，最终制成虾青素浓度5mg/ml、海参甾醇7.5mg/ml的脂质体，用于小鼠灌胃。
胆固醇虾青素脂质体：将100mg虾青素，150mg胆固醇与1200mg蛋黄磷脂溶解于氯仿和甲醇的混合溶液中,振荡充分混合后,减压蒸发除去有机溶剂使溶液形成一层均匀薄膜后,真空干燥；向薄膜中加入20ml生理盐水,在超声仪中将薄膜溶解分散均匀,得到虾青素脂质体混悬液，细胞破碎，最终制成虾青素浓度5mg/ml、胆固醇7.5mg/ml的脂质体，用于小鼠灌胃。
海参甾醇虾青素简单混合灌胃剂：50mg游离态虾青素和75mg海参甾醇加入到10ml生理盐水中，加入总体系2％的吐温20，冰浴超声，破碎。最终制成虾青素浓度5mg/ml、海参甾醇7.5mg/ml的乳液用于小鼠灌胃。
胆固醇虾青素简单混合灌胃剂：50mg游离态虾青素和75mg胆固醇加入到10ml生理盐水中，加入总体系2％的吐温20，冰浴超声冰浴超声，破碎。最终制成虾青素浓度5mg/ml、胆固醇7.5mg/ml的乳液用于小鼠灌胃。
利用本发明方法制得的脂质体性质稳定，平均粒度为100-200nm，PDI为0.2-0.3，分散性好，包封率可达90％以上。
1.2动物实验
Balb/c小鼠给予基础饲料适应性喂养7d后，按照体重随机分为5组：游离虾青素组(A)，海参甾醇虾青素脂质体组(LSA),胆固醇虾青素脂质体组(LCA),海参甾醇虾青素简单混合组(S+A)，胆固醇虾青素简单混合组(C+A)。实验前禁食不禁水10h，各实验组按虾青素剂量50mg/kg BW灌胃不同灌胃剂，灌胃结束后正常进水，分别于灌胃后2,4,6,8,12,14h后取血。
1.3血清虾青素测定方法
分离血清，按照血清提脂的方法处理。取100ul血清样品，加入2ml氯仿，2ml甲醇，1.7ml超纯水充分涡旋混匀，离心后取下层氯仿层减压浓缩，用初始流动相复溶，过膜，液相分析测定血清各种虾青素水平。
2.结果
海参甾醇制备脂质体包埋虾青素可以显著升高血清虾青素含量及顺式虾青素比例。
图3为实施例2试验小鼠在灌胃不同灌胃剂后，血清中虾青素浓度-时间曲线。从图中看出，灌胃后，脂质体形式包埋虾青素的小鼠血清中的虾青素浓度明显上升，且显著高于游离形式的虾青素。两种脂质体形式虾青素在血清中的含量变化趋势相似，均在4h时，血清中的虾青素浓度达到最高峰值，海参甾醇组为0.21μg/mL，胆固醇组为0.2μg/mL；在随后的4-14h内，血清中的虾青素浓度缓慢下降，到14h时，其在血清中浓度分别为0.14μg/mL和0.15μg/mL，仍保持较高水平。而游离虾青素组和直接简单混合的两组在6h时，才达到血清中虾青素积累浓度峰值，游离组为0.04μg/mL；海参甾醇简单混合组为0.06μg/mL；胆固醇简单混合组为0.06μg/mL。而且在随后的6-14h，血清中虾青素浓度逐渐下降，到14h时，血清中虾青素浓度仅分别为0.027μg/mL、0.026μg/mL和0.027μg/mL。海参甾醇脂质体组不仅缩短了虾青素进入血液的时间，同时也提高了血液虾青素浓度。
图4反映了海参甾醇虾青素脂质体可以提高血清中顺式虾青素比例。通过HPLC分析小鼠血清中9-顺式虾青素、13-顺式虾青素和全反式虾青素的浓度。灌胃50mg/kg BW虾青素4h后，血清中虾青素异构体浓度如图4所示。所有组小鼠血清中均检测出2种虾青素异构体，13-顺式虾青素和全反式虾青素。从图中可以看出，不同形式的虾青素灌胃乳剂，在消化吸收过程中，虾青素异构体的组成比例具有明显差异。其中游离虾青素组在4h时，13-顺式和全反式两种异构体相对含量分别为：25％和75％；海参甾醇和虾青素简单混合组的13-顺式虾青素和全反式虾青素异构体的相对含量分别为：18.9％和71.1％；胆固醇和虾青素简单混合组的13-顺式虾青素和全反式虾青素异构体的相对含量分别为：22.6％和77.4％。而海参甾醇虾青素脂质体组实验结果显示：13-顺式虾青素和全反式虾青素异构体的相对含量分别为：78.1％和11.9％，顺式占更高比例，胆固醇虾青素脂质体组实验结果显示：13-顺式虾青素和全反式虾青素异构体的相对含量分别为：10.5％和89.5％，全反式虾青素比例显著高于13-顺式虾青素。脂质体形式的虾青素顺反异构均与直接混合游离虾青素相比发生显著变化。
综上所述，以海参甾醇为原料制备新型虾青素脂质体具有良好的应用前景，既显著提高血清虾青素浓度，又显著提升顺式虾青素比例，使其更好的发挥功效。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (9)
1.海参甾醇脂质体在提高人体顺式虾青素含量制品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述海参甾醇脂质体的脂质体膜材料中含有海参甾醇。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述海参甾醇为单一种类的海参甾醇或不同种类海参甾醇的组合。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述脂质体的膜材料组分及其重量百分比为：磷脂类物质66.7％-90％，海参甾醇10％-33.3％，虾青素包埋量达到17％以上，不含胆固醇；平均粒度为100-200nm，包封虾青素时包封率为90％以上。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述海参甾醇脂质体为包埋虾青素的脂质体。
6.如权利要求3所述的的应用，其特征在于：所述虾青素为单一种类的虾青素或不同种类虾青素的组合。
7.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述制品为药品、食品、功能性食品或膳食补充剂。
8.一种提高人体顺式虾青素含量的制品，其特征在于：包括包埋虾青素的海参甾醇脂质体。
9.如权利要求7所述的制品，其特征在于：所述制品为乳剂或粉剂。
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