CN112940112A - 一种抗兔d型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体及其制备方法，其包括以下步骤：（1）利用兔D型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗免疫健康产蛋母鸡，获得高免鸡蛋；（2）取高免鸡蛋蛋黄，除去蛋黄膜并搅匀蛋黄；（3）向蛋黄中加入灭菌双蒸水，搅拌均匀成为蛋黄液，调节蛋黄液的pH值除去脂质，再加入硫酸铵沉淀卵黄抗体；（4）将步骤（3）所得产物透析、灭活和过滤，即得卵黄抗体。本发明所公开的抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备方法，步骤简单，操作简便，通过该方法制备所得的卵黄抗体对兔D型多杀性巴氏杆菌的感染具有很好的预防作用。

Description

一种抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体及其制备方法，属于兽用生物技术领域。

背景技术

兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌感染兔引起的一种传染病，分布在世界各地，是影响兔产业发展的重要疾病之一。多杀性巴氏杆菌血清型复杂，根据菌株的荚膜抗原可将其分为血清A、B、D、E和F型菌株，各血清型菌株之间没有交叉保护。流行病学调查显示，近年来血清A型和D型菌株是国内兔群中的主要流行菌株。兔巴氏杆菌病最有效的防控手段是疫苗免疫。然而，国内目前仅有针对血清A型的灭活疫苗。该疫苗仅能对血清A型菌株进行防控，而对血清D型菌株无交叉免疫保护效力。

卵黄抗体是母禽，尤其是蛋鸡，受到外来抗原刺激后，转移并富集于蛋黄中的针对外来抗原的特异性抗体。卵黄抗体具有针对性强、稳定性高和易于大批量制备等优点，已广泛应用于畜禽传染病的防控。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体及其制备方法。为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）利用兔D型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗免疫健康产蛋母鸡，获得高免鸡蛋；

（2）取高免鸡蛋蛋黄，除去蛋黄膜并搅匀蛋黄；

（3）向蛋黄中加入灭菌双蒸水，搅拌均匀成为蛋黄液，调节蛋黄液的pH值除去脂质，再加入硫酸铵沉淀卵黄抗体；

（4）将步骤（3）所得产物透析、灭活和过滤，获得卵黄抗体。

所述步骤（1）中兔D型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗由多杀性巴氏杆菌PmD01制备，该菌株于2021年3月3日于中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida ）PmD01，保藏号为：CCTCC NO：M 2021201，保藏地址为：武汉大学。该灭活疫苗中抗原含量为2.0×10¹⁰-1.0×10¹¹ CFU/mL。

所述步骤（3）中向蛋黄中加入灭菌双蒸水的体积为蛋黄体积的9倍。

所述步骤（3）中调节蛋黄液的pH值为5.1。

所述步骤（3）中硫酸铵沉淀方法为先加入终浓度为50%（W/V）的硫酸铵，离心，弃上清，沉淀用蛋黄液等体积的灭菌双蒸水溶解；再加入终浓度为33%（W/V）的硫酸铵，离心，弃上清，沉淀用1/10蛋黄液体积的灭菌生理盐水溶解。

所述步骤（4）中透析、灭活和过滤为将步骤（3）所得产物转移入分子量截留为14KD的透析袋中，用蛋黄液（材料中出现的“蛋黄液”都是指步骤（3）中蛋黄与双蒸水混匀之后得到的蛋黄液）等体积的灭菌生理盐水于4℃透析过夜，重复3次，加入体积终浓度为0.1%的甲醛4℃灭活72小时，再用0.45 μm无菌滤器过滤，得到卵黄抗体。

本发明的优点在于：

本发明公开的抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备方法简单，操作简便，所得卵黄抗体的效价高，能有效预防D型多杀性巴氏杆菌感染兔的发生。

附图说明

图1 兔D型多杀性巴氏杆菌kmt1基因和dcbF基因的PCR扩增结果，其中M：DL2000DNA Marker；1:kmt1基因（260bp）; 2:dcbF基因（580bp）; 3:kmt1基因阴性对照; 4:dcbF基因阴性对照。

图2 多杀性巴氏杆菌PmD01以1.0×10⁶ CFU活菌数经鼻腔攻毒引起试验兔的纤维素性肺炎图。

具体实施方式

实施例1

兔D型巴氏杆菌的分离、鉴定和筛选

1）无菌采集呼吸道病死兔的肺脏样品，接种于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板，37℃倒置培养24-48小时，挑取圆形，光滑，半透明，不溶血，直径小于1.0毫米，边缘整齐的小菌落，在5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板上连续纯化3次，获得纯化的培养物。

2）取上述纯培养物，均匀地涂布在载玻片上，经革兰氏染色后显微镜观察细菌形态。选取革兰氏阴性的小杆菌。

3）分别提取经步骤1）和2）筛选得到的纯培养物的基因组DNA，利用kmt1基因和dcbF基因引物分别扩增分离菌的kmt1基因和dcbF基因。kmt1基因上游引物为kmt1-F，引物序列为：5’-GTTTTATGCCACTTGAAATGGGAA-3’；kmt1基因下游引物为kmt1-R，引物序列为5’-TAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATATT-3’。dcbF基因上游引物为dcbF-F，引物序列为：5’-TAGTCAGTATTATAATGACTTCTCATAATACAG-3’；dcbF基因下游引物为dcbF-R，引物序列为5’-TCACGCATTGTGTTATAATACAGTG-3’。

PCR反应体系为50 μL：包含25 μL 2×PCR Mix，基因组DNA 1 μL，上下游引物（10μM）各2 μL，灭菌双蒸水补齐至50 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃ 30秒、58℃30秒、72℃ 45秒，35个循环；72℃延伸10分钟。D型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因和dcbF基因阳性，kmt1基因和dcbF基因PCR扩增的目的片段大小分别为260bp和580bp（图1）。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收，送铂尚生物技术（上海）有限公司测序。选取kmt1基因和dcbF基因序列分别与GenBank中多杀性巴氏杆菌相应序列同源性高于99%以上的菌株，用于进一步的动物回归试验。

4）取步骤3）鉴定的兔D型多杀性巴氏杆菌，分别以1.0×10⁶ CFU活菌数经鼻腔接种12只35日龄健康兔。观察30天，每天观察试验兔的临床症状，包括试验兔的精神状态，是否出现咳嗽，是否出现鼻腔分泌物，采食量是否减少等。剖检试验期内死亡的试验兔和试验结束时存活的试验兔，观察试验兔肺脏的病变，采集肺脏样品进行细菌的再分离和鉴定。结果显示，兔D型多杀性巴氏杆菌PmD01感染试验兔后能导致最高的发病率和最高的死亡率，分别为100%（12/12）和33.33%（4/12）；该菌经鼻腔人工接种试验兔后，试验兔采食量减少、出现咳嗽、鼻腔出现浆液性或脓性鼻涕；该菌能导致试验兔产生纤维素性肺炎，且能从试验兔的肺脏样品中回收到该菌株（图2）。结果表明，在本发明分离到的兔D型多杀性巴氏杆菌中PmD01的毒力最强。因此，本发明选取多杀性巴氏杆菌PmD01制备灭活疫苗用于抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备。

实施例2

兔D型巴氏杆菌灭活疫苗的制备和安全性检测

1.兔D型巴氏杆菌灭活疫苗的制备

将多杀性巴氏杆菌PmD01划线接种于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板，挑取单菌落转接至脑心浸液液体培养基，37℃ 180rpm扩大培养24小时，作为种子液。将种子液按0.1%（V/V）接种到脑心浸液液体培养基，37℃ 180rpm培养24小时，加入甲醛至体积终浓度为0.2%，37℃ 100rpm灭活24小时，即为灭活菌液，此时灭活菌液中抗原的含量为4.0×10¹⁰-2.0×10¹¹ CFU/mL。取20 mL和50 mL灭活菌液，分别加入20 mL完全弗氏佐剂和50 mL不完全弗氏佐剂，混匀，得到40 mL完全弗氏佐剂灭活疫苗和100 mL不完全弗氏佐剂灭活疫苗，灭活疫苗中抗原含量为2.0×10¹⁰-1.0×10¹¹ CFU/mL。

2 兔D型巴氏杆菌灭活疫苗的安全性检测

1）无菌检测：取0.2 mL步骤1制备的完全弗氏佐剂灭活疫苗和不完全弗氏佐剂灭活疫苗分别均匀地涂布于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板上，重复3次，37℃倒置培养72小时。结果均为阴性，说明无细菌污染。

2）动物安全性试验：

a）小鼠的安全性试验：试验一组：取5周龄健康BALB/c小鼠10只，公母各半，每只小鼠腹腔注射0.5 mL步骤1制备的完全弗氏佐剂灭活疫苗；试验二组：取5周龄健康BALB/c小鼠10只，公母各半，每只小鼠腹腔注射0.5 mL步骤1制备的不完全弗氏佐剂灭活疫苗；对照组：取5周龄健康BALB/c小鼠10只，公母各半，每只小鼠腹腔注射0.5 mL无菌脑心浸液液体培养基。试验期14天。试验期间，试验一组、试验二组和对照组小鼠均健康活泼，无死亡，采食和饮水正常，说明步骤1制备的完全弗氏佐剂灭活疫苗和不完全弗氏佐剂灭活疫苗安全。

b）兔的安全性试验：试验一组：35日龄健康兔10只，公母各5只，颈背部皮下注射步骤1制备的完全弗氏佐剂灭活疫苗1 mL；试验二组：35日龄健康兔10只，公母各5只，颈背部皮下分2点注射步骤1制备的完全弗氏佐剂灭活疫苗各1.5 mL，共3 mL；试验三组：35日龄健康兔10只，公母各5只，颈背部皮下注射步骤1制备的不完全弗氏佐剂灭活疫苗1 mL；试验四组：35日龄健康兔10只，公母各5只，颈背部皮下分2点注射步骤1制备的不完全弗氏佐剂灭活疫苗各1.5 mL，共3 mL；对照组：35日龄健康兔10只，公母各5只，颈背部皮下注射无菌脑心浸液液体培养基1 mL；观察14天。观察期间，试验一组、试验二组、试验三组、试验四组和对照组兔均健康活泼，无死亡，采食和饮水正常，也未观察到疫苗注射引起的局部的和全身的不良反应，说明步骤1制备的完全弗氏佐剂灭活疫苗和不完全弗氏佐剂灭活疫苗安全。

实施例3

卵黄抗体的制备，包括以下步骤：

1.取30羽健康产蛋的京红1号蛋鸡颈部皮下分2点注射1 mL（每点注射0.5 mL）兔D型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗（抗原含量为1.0×10¹¹ CFU/mL），共免疫4次，相邻两次免疫的时间间隔为14天，第1次免疫用完全弗氏佐剂灭活疫苗（实施例2制备），第2次免疫、第3次免疫和第4次免疫用不完全弗氏佐剂灭活疫苗（实施例2制备），第4次免疫后7天开始收集鸡蛋，收集卵黄抗体效价高于1:64的高免鸡蛋；

2.将高免鸡蛋用清水洗净，晾干，用75%酒精进行表面消毒，取出蛋黄，过3层灭菌纱布去除卵黄膜，并将蛋黄搅拌均匀；

3.取50 mL蛋黄，加入450 mL灭菌双蒸水，搅拌均匀，得到蛋黄液，用0.1 M的盐酸调节蛋黄液pH值至5.1，4℃静置12小时，12000rpm 4℃离心30min，收集上清；缓慢地加入硫酸铵，边加边搅拌，使加入的硫酸铵完全溶解，至终浓度为50%（W/V），4℃静置12小时，10000rpm 4℃离心30min，沉淀用500 mL灭菌双蒸水溶解；缓慢地加入硫酸铵，边加边搅拌，使加入的硫酸铵完全溶解，至终浓度为33%（W/V），4℃静置12小时，10000rpm 4℃离心30min，沉淀用50 mL灭菌生理盐水溶解；

4.将步骤3所得产物转移入分子量截留为14KD的透析袋，用500 mL灭菌生理盐水于4℃透析12小时，重复3次，加入体积终浓度为0.1%的甲醛4℃灭活24小时，再用0.45 μm的无菌滤器过滤，得到48 mL卵黄抗体。

实施例4

卵黄抗体的检测

1.卵黄抗体的效价检测

1）抗体检测用D型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的制备：将活菌数为2.0×10¹¹ CFU/mL的多杀性巴氏杆菌PmD01（CCTCC NO：M 2021201）以0.1%（V/V）接种至5 mL脑心浸液培养基，37℃ 180rpm培养24小时；10000rpm 4℃离心5分钟，弃上清，沉淀用1 mL 2.5%（W/V）氯化钠溶液重悬；重悬液置56℃水浴中孵育2小时，水浴时每20分钟摇匀一次，12000rpm 4℃离心30分钟，取上清；上清转移至分子截留量为3.5 KD的透析袋中，用500 mL灭菌生理盐水于4℃透析12小时，重复3次，最后用0.45 μm无菌滤器过滤，得到2.2 mL兔F型多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原。

2）琼脂扩散试验：将50μL步骤1）所得的D型多杀性巴氏杆菌荚膜抗原加入梅花型孔的中间孔，将实施例3制备的卵黄抗体用灭菌生理盐水进行连续的2倍倍比稀释至1:1024并将各个稀释度的卵黄抗体50μL加入梅花型孔的周边孔，再取50 μL灭菌生理盐水加入梅花型孔的周边孔作为阴性对照，37℃湿盒中反应12小时，测定卵黄抗体的效价。结果显示，卵黄抗体的效价为1:256。

2. 无菌检测：取0.2mL实施例3制备所得的卵黄抗体，均匀地涂布于含5%（V/V）脱纤维绵羊血的脑心浸液琼脂平板上，37℃倒置培养72小时，观察有无细菌生长。结果为阴性，说明无细菌污染。

3. 卵黄抗体的安全性检测

1）小鼠的安全性试验：取20只5周龄BALB/c小鼠，平均分为2组，每组10只，公母各5只。试验组：每只小鼠经腹腔注射0.5 mL实施例3制备所得的卵黄抗体；对照组：每只小鼠经腹腔注射0.5 mL灭菌生理盐水。观察14d。观察期间，试验组和对照组小鼠均活泼健康，采食和饮水正常，无死亡，说明实施例1制备所得的卵黄抗体安全性好。

2）兔的安全性试验：取30只35日龄健康兔，平均分为3组，每组10只，公母各5只。试验一组：颈背部皮下分两点各注射1.5mL（共3 mL）实施例3制备所得的卵黄抗体；试验二组：颈背部皮下注射1 mL实施例3制备所得的卵黄抗体；对照组：颈背部皮下注射1 mL灭菌生理盐水。观察14d。观察期间，试验一组、试验二组和对照组试验兔均活泼健康，无死亡采食和饮水正常，也未观察到卵黄抗体注射引起的局部的和全身的不良反应。结果说明，实施例3制备所得的卵黄抗体安全性好。

实施例5

卵黄抗体的保护力评价

1.取90只35日龄多杀性巴氏杆菌阴性和抗多杀性巴氏杆菌抗体阴性的健康兔，平均分为3组，每组30只，公母各15只。试验组：颈背部皮下注射1.0mL实施例3制备所得的卵黄抗体，72小时后经鼻腔接种100 μL（每个鼻孔50 μL）多杀性巴氏杆菌PmD01菌悬液，活菌数为1.0×10⁶ CFU，观察30d。对照组：颈背部皮下注射1.0mL灭菌生理盐水，72小时后经鼻腔接种100 μL（每个鼻孔50 μL）多杀性巴氏杆菌PmD01菌悬液，活菌数为1.0×10⁶ CFU，观察30d；正常对照组：不做任何处理。

2.统计试验兔由多杀性巴氏杆菌PmD01感染引起的发病率和死亡率，试验结束时剖解试验动物，观察呼吸道病变，采集病变组织和器官进行细菌的分离鉴定。试验动物发病的判定依据为，试验动物呼吸道有病变（如气管出血、出血性肺炎、胸腔和肺脏纤维素性渗出、纤维素性肺炎等）且病变组织中多杀性巴氏杆菌PmD01阳性，同时无引起试验动物呼吸道疾病的其他病原（如兔瘟、A型和F型多杀性巴氏杆菌、波氏杆菌和金黄色葡萄球菌等）；试验动物死亡的判定依据为，试验动物呼吸道有病变（如气管出血、出血性肺炎、胸腔和肺脏纤维素性渗出、纤维素性肺炎等）且病变组织中多杀性巴氏杆菌PmD01阳性，同时无引起试验动物呼吸道疾病的其他病原（如兔瘟、A型和F型多杀性巴氏杆菌、波氏杆菌和金黄色葡萄球菌等）；

结果：试验兔注射卵黄抗体后，试验组试验兔的发病率和死亡率（均为0）均明显低于对照组试验兔的发病率和死亡率（分别为100%和36.67%）。结果表明，本发明制备的卵黄抗体具有良好的保护效果。详细结果见表1。

表 1 试验兔的发病率和死亡率

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体及其制备方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttttatgcc acttgaaatg ggaa 24

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taagaaacgt aactcaacat ggaaatatt 29

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagtcagtat tataatgact tctcataata cag 33

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcacgcattg tgttataata cagtg 25

Claims (9)

1.一种抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用兔D型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗免疫健康产蛋母鸡，获得免疫鸡蛋；

（2）取免疫鸡蛋蛋黄，除去蛋黄膜并搅匀蛋黄；

（3）向蛋黄中加入灭菌双蒸水，搅拌均匀成为蛋黄液，调节蛋黄液的pH值除去脂质，再加入硫酸铵沉淀卵黄抗体；

（4）将步骤（3）所得产物透析、灭活和过滤，得到卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述兔D型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗由多杀性巴氏杆菌PmD01株制备，该菌株于2021年3月3日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M 2021201。

3.根据权利要求1所述的抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）兔D型多杀性巴氏杆菌灭活疫苗抗原含量为2.0×10¹⁰--1.0×10¹¹ CFU/mL。

4.根据权利要求1所述的抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）灭菌双蒸水的体积为蛋黄体积的9倍。

5.根据权利要求1所述的抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）调节蛋黄液的pH值至5.1。

6.根据权利要求1所述的抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中硫酸铵沉淀方法为：先加入终浓度为50%（W/V）的硫酸铵，离心，弃上清，沉淀用蛋黄液等体积的灭菌双蒸水溶解；再加入终浓度为33%（W/V）的硫酸铵，离心，弃上清，沉淀用1/10蛋黄液体积的灭菌生理盐水溶解。

7.根据权利要求1所述的抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）将步骤（3）所得产物转移入分子截留量为14KD的透析袋透析，加入体积终浓度为0.1%的甲醛4℃灭活24小时，再经0.45 μm无菌滤器过滤，得到卵黄抗体。

8.一种如权利要求1-7任一所述方法制备获得的抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体。

9.如权利要求8所述的抗兔D型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体在兔养殖过程中的应用。

Images