CN112940059A - 一种糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种糖基修饰的萘酰亚胺‑多胺缀合物、其制备方法及应用。本发明通过利用全乙酰或脱保护后的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖等糖基修饰萘酰亚胺母核，实现靶向肿瘤细胞高表达的糖基转运体（GLUTs），对肝癌及晚期肝癌均实现较好的靶向性。本发明首次发现靶向肝癌及晚期肝癌的新型萘酰亚胺‑多胺缀合物，并首次发现可调控亚细胞器的萘酰亚胺配合物，为晚期肝癌的治疗提供新的思路及研究方向。

Description

一种糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物、其制备方法及应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是一种发现晚、致死率高的恶性肿瘤，在恶性肿瘤中占第六位。大约90％的肝癌患者即使在术后也不能存活5年以上，尽管在合理和联合用药的癌症治疗技术上取得了进展，目前的抗癌药物不能治愈肝癌切除术后的复发和转移。因此，开发靶向肝癌和肝癌转移的新型药物迫在眉睫。

近年来，除光物理性质外，萘酰亚胺作为一种多功能的抗肿瘤活性化合物的活性也在不断提高。以氨萘非特为代表的萘酰亚胺及其衍生物是一种抗肿瘤效果良好的DNA嵌入剂，由于结构中的平面芳香环在DNA碱基对之间的嵌入会扭曲DNA主链构象并干扰DNA-蛋白质的相互作用从而起到抗肿瘤作用。早在1973年，Brana课题组合成了一系列拥有抗肿瘤活性的萘酰亚胺-多胺衍生物，其中的两个化合物安萘菲特(Amonafide)和米托萘胺(Mitonafide)进入临床二期试验，Amonafidede对白血病细胞(P388)和白血病细胞(L1210)有较好的抑制作用，Mitonafide对人口腔上皮癌细胞(KB)和宫颈癌(Hela)的抗肿瘤活性较好，但是Amonafidede能够引起人体骨髓抑制、呕吐、静脉炎症等不同程度的影响；而Mitonafide则会对人体造成严重的中枢系统毒性，这些都限制了其在临床中的应用，因此通过对萘酰亚胺结构的修饰来增强其靶向性及解决其免疫抑制等问题成为目前化疗药物研究和开发的重点。

糖基化修饰是药物结构改造和修饰的重要手段之一。糖类是生物体能量的主要来源，尤其癌细胞对糖的摄入量较大，癌细胞表面存在很多的糖功能受体，对萘酰亚胺类药物进行糖基化修饰，可以实现对肿瘤细胞的靶向性，将一些具有生物活性的基团或先导化合物设计合成为糖基化衍生物，可优化药物分子的药理活性及作用模式，从而得到实现基于Warburg效应的靶向性强、高生物利用度高活性的新化合物。目前对萘酰亚胺结构修饰的重点主要是对萘酰亚胺进行的靶向性修饰。近年来的研究表明，糖基修饰的产物在抗肿瘤转移中表现出较好的效果，而如何设计糖基修饰的萘酰亚胺缀合物，靶向肝癌及肝癌转移却并未见报道。

图1为进入临床的萘酰亚胺(氨萘非特、米托萘胺)、糖基化修饰的萘酰亚胺先导化合物12a、糖基化铂药物13及进入临床的糖基化产物14-15的结构式，通过调控肿瘤亚细胞器功能、逆转DNA损伤修复及增强肿瘤周围T免疫作用表现出抗肿瘤生长及转移活性。通过多种萘酰亚胺化合物靶向肿瘤糖基转运体调控亚细胞器及细胞核功能成为逆转耐药及解除肿瘤周围T细胞免疫抑制的有效手段。因此通过设计合成糖基化修饰的萘酰亚胺化合物，可增强DNA损伤同时改善DNA损伤修复逆转耐药，合成的部分萘酰亚胺类似物可通过糖基转运体GLUTs来靶向亚细胞器及细胞核，并表现出良好的抗肿瘤生长及转移的活性，并同时增强抗肿瘤免疫功能。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于克服现有技术中存在的不足，提出一种高稳定性、高靶向性的萘酰亚胺-多胺缀合物，研究萘酰亚胺缀合物是否对亚细胞器及细胞核发挥双重的抑制作用，研究萘酰亚胺缀合物是否在进入体内后可协同的抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移等作用。

本发明还提供了所述糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物的制备方法。

本发明又进一步提供了所述萘酰亚胺-多胺缀合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物，包含式I所示的化合物：

其中R₁为碳原子数小于等于20的链状烷基、碳原子数为4-8的环状烷基、含有5-8个碳原子的芳香杂环、碳原子数为1-4的链状烷基取代的芳香杂环或非芳香杂环。

Sug为全乙酰葡萄糖、全乙酰半乳糖、全乙酰甘露糖、全乙酰鼠李糖、全乙酰麦芽糖、全乙酰乳糖、全乙酰蔗糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、麦芽糖、乳糖或蔗糖。

R₂为多胺类似物(PA)或者氢原子，多胺类似物(PA)具体为：

其中r＝0、1、2、3、4或5，p＝0、1、2、3、4或5，q＝0、1、2、3、4或5。

具体的，所述的萘酰亚胺-多胺缀合物为下述结构的化合物12a-12b：

所述糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物的制备方法，包括如下步骤：

化合物11与化合物8在无水丙酮中冰浴0.5-1h后，在室温条件下反应过夜得目标化合物。

具体的，化合物11与化合物8的摩尔比为1：(1-2)，无水丙酮用量为4-5mL。

其中，化合物11的结构式为

化合物8的结构式为

具体的，所述糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物的合成路线如下：

上述糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

具体的，所述肿瘤是指人子宫颈癌、人乳腺癌、人肺腺癌、人肝癌、人结肠癌、耐顺铂人肺腺癌或人前列腺癌。

具体的，所述药物包含糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物以及药学上可接受的载体。

本发明中利用萘酰亚胺化合物区别于氨萘非特的特殊稳定性，同时利用肿瘤细胞区别于正常细胞对糖类摄入量较多的特性，以及肿瘤细胞表面较多的糖基转运受体，改变以往氨萘非特的较差的溶解性等问题，运用有机合成手段合成萘酰亚胺化合物。

本发明设计并合成的萘酰亚胺化合物可以在增强萘酰亚胺类药物靶向性的同时，通过靶向肿瘤高多胺微环境调控溶酶体及细胞核功能成为逆转耐药及解除肿瘤周围T细胞免疫抑制的有效手段，减少DNA的修复比例、增强萘酰亚胺类似物对先天和获得耐药细胞的作用。

与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：

1、本发明首次合成新型糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物，对肝癌及晚期肝癌表现较好的治疗作用。

2、与经典的氨萘非特不同，本发明所述缀合物通过靶向线粒体上调ROS，并调控肿瘤细胞中氧化性物质超氧化物及H₂O₂，下调还原性物质如GSH及GSH-Px，发挥抗肝癌生长及转移的活性，且这种调控作用与ROS通路密切相关。通过萘酰亚胺结构的修饰，实现亚细胞器和细胞核双重靶向作用。

3、本发明通过靶向肿瘤糖基转运体GLUTs及糖代谢过程，调控线粒体及细胞核功能，同时增强抗肿瘤免疫反应，并对晚期转移性肿瘤有较好的治疗潜力。

4、本发明所述萘酰亚胺-多胺缀合物12a对p53及γH2AX的上调说明其作用与DNA损伤也密切相关。利用肿瘤细胞表面高表达的糖基转运蛋白，提高了药物对肿瘤细胞的靶向性，提高生物利用度，降低对正常细胞的毒副作用。通过糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物对晚期转移性肿瘤及在解除肿瘤周围免疫抑制起重要作用。

5、本发明改善了萘酰亚胺类药物的水溶性及脂溶性，提高了肿瘤细胞对药物的摄入量。本发明通过对萘酰亚胺类似物的修饰，提高了药物的稳定性，延长了半衰期，减小了给药量，提高了机体对药物的最大耐受量。

附图说明

图1为进入临床的萘酰亚胺(氨萘非特、米托萘胺)、糖基化修饰的萘酰亚胺先导化合物12a、糖基化铂药物13及进入临床的糖基化产物14-15的结构式；

图2为不同浓度的阳性药物氨萘非特(A)及12a(B)对肝癌细胞(HepG-2和Huh-7)及肝正常细胞(HL-7702)的抑制率对比；

图3为12a和氨萘非特组对肝癌的体内抗肿瘤活性；小鼠分为阴性对照组、氨萘非特组(5mg/kg)、12a(3mg/kg)或12a(5mg/kg)；

图4为12a和氨萘非特组对HCC肿瘤的体内抗转移活性；

图5为活细胞中12a的亚细胞器定位；

图6为萘酰亚胺缀合物12a在是否存在根皮素(肿瘤细胞膜表面高表达的糖转运系统的抑制剂)下在HepG-2(A)及Huh-7(B)两种肝癌细胞中抑制率的变化；

图7为孵育24小时后，浓度为10μM的糖基化修饰的萘酰亚胺缀合物12a和氨萘非特对肝癌细胞中p53蛋白(A)及基因(B)、γH2AX蛋白(C)及基因(D)表达的影响；

图8为糖基化修饰的萘酰亚胺缀合物12a对肝癌细胞ROS(A)(B)、正常肝细胞HL-7702(C)(D)、氧化性物质超氧化物(E)、H₂O₂(F)、还原性物质GSH(G)含量的影响；

图9为糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a代表性HPLC图谱；

图10为糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a在水(A)及RPMI 1640(B)中的稳定性。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。

除了特别说明，本文中提及的各种试剂均来自市售满足实验要求的高纯度试剂；实施例中，所述的Cis.是顺铂，Oxp.是奥沙利铂，AF是氨萘非特。

本发明通过化学合成手段实现不同结构的萘酰亚胺类似物与糖基的连接，从而合成不同的萘酰亚胺类似物。从本发明的试验结果可以看出萘酰亚胺类似物对肿瘤生长及转移尤其肝癌的生长及转移均具有较好的活性。本发明所述不同系列的萘酰亚胺母核修饰的类似物作为一种抗肿瘤化合物，其设计、合成与抗癌活性的试验的目的在于制备具有广谱、高效、低毒的抗癌活性分子，为癌症临床治疗提供新型候选药物。

在此基础上，本发明将葡萄糖等经典的糖基片段引入已有经典萘酰亚胺母核，首次设计合成糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物，并对目标化合物结构进行表征，测试其体外及体内抗肿瘤活性。

本发明所述糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a-12b设计思路如下：

1)糖基转运体(GLUTs)在肿瘤细胞膜表面高表达，目标分子中引入糖基的结构，能增强靶向性。将糖基的结构引入萘酰亚胺母核修饰的多胺类似物，在增强靶向性同时，增强化合物水溶性及稳定性，从而改善母核顺铂溶解性差、稳定性差、体内利用度低等缺陷。

2)临床实验研究表明，不同链长度的糖基结构的微小差异可能对其生物功能产生重大影响。因此，本发明将不同种类的进入过临床阶段的多胺类似物明星分子引入目标分子体系分别合成12a-12b，旨在探究不同种类的多胺结构对萘酰亚胺母核修饰的类似物活性的影响。

本发明所述的萘酰亚胺母核的合成方法具体参见文献：Ma J,Li Y,Li L,Yue K,Liu H,Wang J,Xi Z,Shi M,Zhao S,Ma Q,Liu S,Guo S,Liu J,Hou L,Wang C,Wang PG,Tian Z,Xie S.A Polyamine-Based Dinitro-Naphthalimide Conjugate as Substratesfor Polyamine Transporters Preferentially Accumulates in Cancer Cells andMinimizes Side Effects in vitro and in vivo.Front Chem.2020,8,166.doi:10.3389/fchem.2020.00166.

化合物8a、8b的制备：

化合物1(葡萄糖)在乙酸酐及乙酸钠存在下反应充分得化合物2(全乙酰化的葡萄糖)，化合物2在通氨气条件下与THF/水的混合溶剂，在冰浴条件下反应得1位脱保护的化合物3，化合物3经过1位上三氯乙腈供体后，再与5a(5b)经糖基化偶联反应后得化合物6a(6b)，化合物6a(6b)再氢气氛围下经1位脱苄基还原得化合物7a(7b)，化合物7a(7b)在草酰氯作用下经DMF催化，常温反应得化合物8a(8b)。

化合物8a(8b)、化合物11的具体制备工艺不是本发明的发明点，故不再赘述。

化合物8a的具体合成方法及工艺参数参考文献(Jing Ma,Qingpeng Wang,Zhonglv Huang,Xiande Yang,Wenpei Hao,Xin Wang*,Peng George Wang*.GlycosylatedPlatinum(IV)Complexes as Substrates for Glucose Transporters(GLUTs)andOrganic Cation Transporters(OCTs)Exhibited Cancer Targeting and Human SerumAlbumin Binding Properties for Drug Delivery.Journal of Medicinal Chemistry,2017,60(13):5736-5748)。

化合物11的合成具体可参考文献(Dai Fujun,Li Qian,Wang Yuxia,GeChaochao,Feng Chenyang,Xie Songqiang,He Haoying,Xu Xiaojuan,WangChaojie.Design,Synthesis,and Biological Evaluation of Mitochondria-TargetedFlavone-Naphthalimide-Polyamine Conjugates with Antimetastatic Activity.[J].Journal of medicinal chemistry,2017,60(5).)、文献(Li Jinghua,Tian Runguo,GeChaochao,Chen Ying,Liu Xiaodan,Wang Yuxia,Yang Yacheng,Luo Wen,Dai Fujun,WangSenzhen,Chen Shuai,Xie Songqiang,Wang Chaojie.Discovery of The PolyamineConjugate with Benzo[cd]indol-2(1H)-one As a Lysosome-targeted AntimetastaticAgent.[J].Journal of medicinal chemistry,2018.)。

实施例1：12a

¹H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.06(s,1H),8.54(s,1H),8.36(d,J＝12.3Hz,1H),7.96(s,1H),7.58(s,1H),5.32–4.96(m,4H),4.20(d,J＝28.8Hz,3H),3.80(s,2H),3.36(s,2H),2.83(s,6H),2.00(s,12H).¹³C NMR(75MHz,Chloroform-d)δ170.58,170.20,170.01,169.41,167.22,164.09,163.62,136.32,133.98,130.00,127.35,124.06,121.80,100.66,72.15,72.02,71.54,68.39,68.12,61.61,55.25,43.64,35.42,20.95,20.68,20.56.ESI-MS(positive ion mode):m/z[M+H]⁺:calcd:672.2405；obsd:672.2407.Calcdfor C₃₂H₃₇N₃O₁₃:C 57.22％,H 5.55％,N 6.26％.Found:C 57.20％,H 5.50％,N 6.24％.

其制备方法如下：

化合物11(1mmol)与化合物8a(1.5mmol)在无水丙酮(5mL)中冰浴半小时后，在室温条件下反应过夜得目标化合物12a。

具体的合成路线如下：

实施例2：12b

¹H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.89(s,1H),8.33(d,J＝7.0Hz,1H),8.15(s,1H),7.96(d,J＝8.1Hz,1H),7.64(s,1H),5.19(t,J＝9.3Hz,1H),5.11–4.92(m,2H),4.54(t,J＝6.5Hz,1H),4.31(d,J＝5.8Hz,2H),4.21(s,2H),3.66(d,J＝27.8Hz,2H),3.32(s,2H),2.87–2.73(m,2H),2.47(d,J＝27.1Hz,6H),2.03(dt,J＝13.0,8.2Hz,12H),1.23(s,2H).¹³C NMR(75MHz,Chloroform-d)δ171.84,170.87,170.20,169.62,169.39,164.26,163.69,133.72,132.33,129.53,127.30,123.72,122.85,122.07,121.48,100.92,72.72,71.90,71.42,69.33,68.41,61.80,57.29,45.62,37.70,33.66,25.41,20.80,20.74,20.58.ESI-MS(positive ion mode):m/z[M+H]⁺:calcd:700.2718；obsd:700.2715.Calcdfor C₃₄H₄₁N₃O₁₃:C 58.36％,H 5.91％,N 6.01％.Found:C 58.26％,H 5.87％,N 5.98％.

其制备方法如下：

实施例2中化合物8b的制备方法与实施例1的不同之处在于，将化合物6a替换5a进行反应，最终得到化合物8b。

化合物11(1mmol)与化合物8b(1.5mmol)在无水丙酮(5mL)中冰浴半小时后，在室温条件下反应过夜得目标化合物12b。

具体的合成路线如下：

试验例1：目标分子生物活性评价

(1)体外抗肿瘤活性测试

本试验选用癌细胞株包括：人乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF-7)，人肺腺癌细胞(A549)及耐顺铂人肺腺癌细胞(A549cisR)，人肝癌细胞(HepG-2和Huh-7)。

测试方法：向96孔板加入细胞悬浮液100μL，控制细胞密度为3000-5000个/孔，最后一列留作调零孔。放置37℃细胞培养箱培养24h后向96孔板中加入梯度浓度(0.2，0.6，1.3，3.2，7.5，17.8，42.2，100，单位μM)的化合物培养基溶液100μL，继续放置37℃细胞培养箱培养48h。向96孔板每孔中加入5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃细胞培养箱培养4h后取出，吸除培养基，加入DMSO 150μL于37℃摇床避光震摇20min。在470nm下用酶标仪测定每孔吸光度，计算其IC₅₀值，每组实验至少重复三遍，测量结果如表1所示。其中加入三个阳性对照，分别为氨萘非特(AF)、顺铂(Cis.)及奥沙利铂(Oxp.)。

表1糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a-12b(IC₅₀单位：μM)在人体肿瘤细胞株的细胞毒性谱(RF ^a:Resistant factor＝IC₅₀(A549cisR)/IC₅₀(A549))

注释：[a]The RF(resistance factor)is defined as the IC₅₀ value inA549cisR cells/IC₅₀ value in A549 cells.[b]FI(fold increase)is defined as IC₅₀(amonafide)/IC₅₀(12a).[c]FI(fold increase)is defined as IC₅₀(cisplatin)/IC₅₀(12a).[d]An average of three measurements.ND＝not determined.

表1的体外抗肿瘤活性测试结果显示，糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a-12b表现出明显优于氨萘非特的抗肿瘤活性，且不同结构的糖基配体对化合物的抗肿瘤活性影响较为显著，表现为对各种测试肿瘤细胞均较好的活性，且糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a表现出对HepG-2和Huh-7表现为效果优于阳性药物氨萘非特、顺铂及奥沙利铂，其FI值1.40-2.47，在肝癌细胞中为最高，而在其他肿瘤中的对比效果并不明显，且达到了nmol水平，在体外显示出对肝癌良好的靶向性。

(2)体外对正常细胞毒性测试

本试验所需人正常肝细胞(HL-7702)均为外购，用上述MTT法测定先导化合物12a对正常细胞的杀伤能力。

表2糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a对癌细胞和与之相当的正常细胞生存能力的影响(IC₅₀单位：μM)。

注释：[a]SI(selectivity index)is defined as IC₅₀ in HL-7702/IC₅₀ inHepG-2.[b]SI(selectivity index)is defined as IC₅₀ in HL-7702/IC₅₀ in Huh-7.

从表2中的测试结果可以看出，糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a除了其抗肿瘤活性差别很大之外，其对正常肝细胞的差别也较大，其SI值为2.84-2.86，分别为氨萘非特及临床常用化疗药物顺铂及奥沙利铂的6倍，显示出在体外对正常细胞较低的毒性力。

如图2所示，该现象从不同浓度的阳性药物氨萘非特(a)及12a(b)对肝癌细胞(HepG-2和Huh-7)及肝正常细胞(HL-7702)的抑制率对比中可以发现相似的现象。

试验例2：不同浓度糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a和氨萘非特在肝癌中的体内抗肿瘤活性

取对数生长期的肝癌细胞，消化后离心，用无菌PBS缓冲溶液洗涤细胞，离心后收集细胞，并用葡萄糖注射液重悬。用台盼蓝溶液染色后用移液枪将细胞悬液吸出10μL于细胞计数板中计数，计算活细胞数目。按照一定比例将细胞浓度稀释为10⁶个/200μL，使用医用酒精将实验用小鼠右侧腋下皮肤进行消毒，注射200μL的细胞悬液。七天后，将接过瘤的小鼠随机分组，包括对照组，化合物12a组3mg/kg、5mg/kg，氨萘非特组5mg/kg。每天给药方式给药七次，给药结束后观察七天，每天称重，测量瘤体积。七天后将小鼠脱臼处死，解剖取出原位肿瘤及各个脏器并称重记录。

图3为12a和氨萘非特组对肝癌的体内抗肿瘤活性；小鼠分为阴性对照组、氨萘非特组(5mg/kg)、12a(3mg/kg)或12a(5mg/kg)。图3中A)PBS、amonafide和12a组小鼠的相对重量；B)实验结束时PBS、amonafide和12a组的肿瘤重量；C)实验结束时PBS、amonafide和12a组的肿瘤图像，第一行，PBS对照组；第二行，氨萘非特组(5mg/kg)；第三行，12a(3mg/kg)；第四行，12a(5mg/kg)；D)实验结束时计算PBS、氨萘非特组和12a组的器官重量指数(器官重量/体重)×100％，包括心、肝、肾、肺和脾；***，P<0.001。

图3的实验结果显示，本发明实施例中先导化合物12a在3mg/kg(54.75％)和5mg/kg(65.99％)剂量下抑制率均优于阳性对照组5mg/kg(48.39％)，表现出在体内较好的抗肝癌的活性。且其脏器指数及体重变化与阳性组差别不大，说明较低的体内毒性。

试验例3：不同浓度糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a和氨萘非特在肝癌中的体内抗肿瘤转移活性

取对数生长期的肝癌细胞，消化后离心，用无菌PBS缓冲溶液洗涤细胞，离心后收集细胞，并用葡萄糖注射液重悬。用台盼蓝溶液染色后用移液枪将细胞悬液吸出10μl于细胞计数板中计数，计算活细胞数目。按照一定比例将细胞浓度稀释为10⁶个/200μl，然后采用尾静脉注射方式注射200μl细胞悬液。七天后，将接过瘤的小鼠随机分组，包括对照组，化合物12a组3mg/kg、5mg/kg，氨萘非特组5mg/kg，每天给药方式给药七次，给药结束后观察七天，每天称重。七天后将小鼠脱臼处死，解剖取出小鼠肺及各个脏器并称重记录，将肺固定在苦味酸多聚甲醛溶液中，之后取出拍照并计算结节数。

图4为12a和氨萘非特组对HCC肿瘤的体内抗转移活性；图4中A)12a和氨萘非特治疗期间小鼠的体重，以及对照组14天的体重；B)12a、氨萘非特和对照组治疗14d后小鼠肺转移结节的统计；C)对照组、12a(3mg/kg)、12a(5mg/kg)和阳性对照组(5mg/kg)每两天静脉注射一次的小鼠肺转移的代表性图像(n＝8只/组)；**P<0.01；***P<0.001。

图4的实验结果显示，本发明实施例中先导化合物12a在3mg/kg(54.47％)和5mg/kg(62.15％)剂量下抑制率均优于阳性对照组5mg/kg(45.90％)，表现出在体内较好的抗肝癌转移的活性。且其脏器指数及体重变化与阳性组差别不大，说明较低的体内毒性。

试验例4：共聚焦测定糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a在亚细胞器中的定位

采用德国莱卡激光共聚焦显微镜(Leica,Wetzlar,Germany)，溶酶体、内质网、高尔基体和线粒体荧光染料分别检测12a溶酶体、内质网、高尔基体和线粒体中的定位情况。在激光共聚焦细胞培养皿中加入12a(10μM)与HCC细胞预先在5000个细胞/皿中孵育2小时。用PBS洗涤收获的细胞3次，并染色30分钟，以使用Leika激光共聚焦显微镜捕获。

图5为活细胞中化合物12a的亚细胞器定位；试验中用化合物12a(10μM)处理HepG2细胞8h，然后用线粒体跟踪器(mito tracker)、溶酶体跟踪器(Lyso tracker)、内质网跟踪器(ER tracker)和高尔基体跟踪器(Golgi tracker)染色，图像通过共焦显微镜获得。

图5实验结果显示化合物12a定位于溶酶体中，而在其他细胞器中并未看到该化合物，说明新型糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a靶向肝癌的生长及转移与启动线粒体功能密切相关。

试验例5：糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a在是否存在肿瘤细胞膜表面高表达的糖基转运系统(GLUTs)的抑制剂根皮素下抑制率的变化

在肿瘤细胞培养时，加入一定剂量的GLUTs转运蛋白的抑制剂，研究细胞抑制率及IC₅₀值的变化。具体方法如下：

将处于对数生长期的拟测定的HepG-2(5*10⁵/孔)和Huh-7(2*10⁵/孔)细胞铺在六孔板中，并放入37℃，5％CO₂的培养箱中培养，细胞贴壁生长，之后在96孔板中分别加入不同浓度的阳性参考药物氨萘非特以及目标化合物12a，加入根皮素组为在加入相同剂量的药物组时，同时加入相同剂量100μM根皮素，与药物组作用相同的时间后采用MTT测试其抑制率及IC₅₀值，不加入根皮素组在相同时间加入等量的培养基作为对照。

图6中实验结果显示在GLUTs转运蛋白的抑制剂根皮素存在下，抑制率发生较大的变化，证明糖基转运系统参与了糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a的跨膜转运，且对不同肿瘤细胞可能产物不同的选择性。

试验例6：糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a、氨萘非特(抚育24h)对肝癌细胞中启动线粒体、上调氧化性物质superoxide/H₂O₂，下调还原性物质glutathione引起ROS通路引起的凋亡，同时检测糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a p53及γH2AX蛋白含量，检测DNA凋亡通路对产物活性的影响

Western Blotting实验检测目标化合物对p53及γH2AX蛋白含量的影响

1)需根据抗体蛋白分子量进行选择合适分离与浓缩胶；2)将配置好的1×电泳液倒入玻璃板的槽中，并将上样梳拔掉；3)根据之前的蛋白上样体积的计算进行上样(样品为分别加入氨萘非特15μM或12a 5μM，10μM 15μM孵育24h后收集细胞蛋白变性及定量后得到)，在第一与最后一个样品后的泳道各加入3μl Marker；4)上样完成后，将玻璃板放入电泳槽中，并盖上盖子，调节电压为80V；5)当marker跑到分离胶底部时，将电泳仪关掉；6)配置1×转膜液，并放入冰箱中预冷，转膜液的配置方法为100ml的10×转膜液，甲醇200ml，蒸馏水700ml。将部分转膜液倒入托盘，并在托盘中进行切胶，切掉浓缩胶，PVDF膜提前在甲醇中活化，并覆盖在胶上，将胶与PVDF膜放置于转膜夹上，上下放置三层滤纸；7)将转膜槽中倒入转膜液，并将转膜夹放置于转膜槽中，盖上盖子，调节电流为200mA，调节转膜时间为两小时；8)转膜结束后，配置1×TBST溶液，并将膜从胶上分离，放入1×TBST溶液中洗一次，之后转移进脱脂奶粉溶液中，放置于摇床上匀速封闭一小时；9)配置一抗溶液，按照抗体：奶粉溶液＝1:1000的比例进行一抗溶液配置，并将溶液滴在抗体盒子中；10)将PVDF膜附在抗体溶液上，赶出气泡，放置于4℃冰箱，过夜；11)第二天，回收一抗溶液，配置1×TBST溶液，将PVDF膜用1×TBST溶液洗三次，每次十分钟，选择择合适的二抗溶液进行配置，室温中孵育PVDF膜2h左右；12)时间结束后，将PVDF膜用1×TBST溶液洗三次，用Beyo ECL显影液按1:1比例混合，淋于PVDF膜中；13)曝光显影，结果详见图7和图8。

图7实验结果显示，与阳性药物氨萘非特相比，12a能明显上调p53及γH2AX蛋白的表达，证明12a抑制肝癌的生长及转移与DNA损伤通路密切相关。

图8实验结果显示，12a能同时上调肝癌细胞HepG-2及Huh-7氧化性物质superoxide/H₂O₂，下调还原性物质glutathione引起ROS通路引起的凋亡，而对正常的肝癌细胞HL-7702没有影响。

试验例7：糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a代表性HPLC图谱及在水中的稳定性测试

将糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a水溶液分别在37℃恒温震荡培养箱中培养24h、48h以及72h后采用HPLC检测药物的HPLC图谱及在水中的稳定性。其中HPLC采用仪器的型号为Waters E2695-2998，Venusil MP C18 colμMn色谱柱，HRMS检测其中的产物峰，ESI离子源。高效液相采用的流动相条件如表3所示，糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a纯度测试结果如表4，显示新型萘酰亚胺-多胺缀合物的纯度均大于95％，代表性HPLC图如图9所示。图10结果显示化合物12a在水中具有较高的稳定性。

表3

表4

综上所述，本发明合成的化合物具有良好的抗肿瘤活性，其体内外抗肿瘤活性均比氨萘非特、顺铂、奥沙利铂均较好，且稳定性较好，另外由于糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物对肝癌及肝癌转移具有较好的靶向性，提高了对肿瘤细胞的高选择性，另外，本发明提供的化合物解决了以往抗肿瘤药物的溶解性差、临床配伍较繁琐的问题，水溶性较好。由于相比经典的萘酰亚胺化合物氨萘非特不同，本发明所述萘酰亚胺-多胺缀合物12a，通过靶向线粒体上调ROS，并上调氧化性物质superoxide/H₂O₂，下调还原性物质glutathione引起ROS通路引起的凋亡，发挥抗肝癌生长及转移的活性，且这种调控作用与ROS通路密切相关。

同时糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物12a上调p53及γH2AX蛋白含量，显示DNA凋亡通路对抗肿瘤生长及转移有重要影响。并调控线粒体及细胞核功能，同时增强抗肿瘤免疫反应，并对晚期转移性肿瘤有较好的治疗潜力。本发明所述缀合物还解决了以往以氨萘非特为代表的萘酰亚胺类似物的溶解性差、临床配伍较繁琐、化疗药物临床应用中病人免疫力差等问题，提高体内利用度，增强疗效，降低以往化疗药物对脾脏、肾脏等的毒副作用。本发明首次发现靶向肝癌及晚期肝癌的新型糖基修饰的萘酰亚胺缀合物，作为可调控亚细胞器及肿瘤微环境的萘酰亚胺配合物，为晚期肝癌的治疗提供新的思路及研究方向。

Claims (7)

1.一种糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物，其特征在于，包含式I所示的化合物：

其中R₁为碳原子数小于等于20的链状烷基、碳原子数为4-8的环状烷基、含有5-8个碳原子的芳香杂环、碳原子数为1-4的链状烷基取代的芳香杂环或非芳香杂环；

Sug为全乙酰葡萄糖、全乙酰半乳糖、全乙酰甘露糖、全乙酰鼠李糖、全乙酰麦芽糖、全乙酰乳糖、全乙酰蔗糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、麦芽糖、乳糖或蔗糖；

R₂为多胺类似物PA或者氢原子，多胺类似物PA为：

其中r＝0、1、2、3、4或5，p＝0、1、2、3、4或5，q＝0、1、2、3、4或5。

2.根据权利1所述的萘酰亚胺-多胺缀合物，其特征在于，所述的萘酰亚胺-多胺缀合物为下述结构的化合物12a-12b：

3.权利要求1或2所述的糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

化合物11与化合物8在无水丙酮中冰浴0.5-1h后，在室温条件下反应过夜得目标化合物；

其中，化合物11的结构式为

化合物8的结构式为

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，化合物11与化合物8的摩尔比为1：(1-2)。

5.权利要求1或2所述糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是指人子宫颈癌、人乳腺癌、人肺腺癌、人肝癌、人结肠癌、耐顺铂人肺腺癌或人前列腺癌。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物包含糖基修饰的萘酰亚胺-多胺缀合物以及药学上可接受的载体。

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