CN112940046B - 一种含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物、合成方法与应用 - Google Patents
一种含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物、合成方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物、合成方法与应用，属于药物合成技术领域，含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物，结构式如下：
其中，M为Fe或Ru中的一种。本发明设计并合成了新型含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物，其化合物具有合成方法简易可行、分离简便，结构简单、无手性中心等特点，体外抗肿瘤活性实验表明，该类配合物具有良好的活性，能够有效抑制肿瘤细胞的生长、迁移、爬行和克隆等特点，使肿瘤细胞周期阻滞在G1期，并诱导细胞凋亡。因此，本发明中的新型含氮芥铁/钌配合物具有成为制备肿瘤治疗药物的巨大潜力。
Description
技术领域
本发明涉及药物合成技术领域，特别是涉及一种含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物、合成方法与应用。
背景技术
在众多抗肿瘤药物当中，氮芥是一类应用较为广泛、疗效突出的抗肿瘤药物。其抗肿瘤机理是通过在细胞内形成缺电子的乙撑亚胺离子，进而与DNA、RNA或酶类生物大分子的富电子中心反应，产生共价结合，导致这些生物大分子丧失活性，使细胞复制受阻，从而达到抗肿瘤的目的。氮芥类抗肿瘤药主要由两部分组成，即烷基化部分和载体部分。烷基化部分即双β-氯乙胺基(ClCH2CH2)2N-，也称氮芥基，是抗肿瘤活性的功能基团；载体部分主要影响药物的物化性质，以及在体内的吸收、分布等药代动力学性质。通过选择不同的载体，可以达到提高药物选择性和疗效、降低毒性的目的。因此，开发新型氮芥类药物，将为获得良好理化性质的氮芥抗肿瘤药物提供重要的理论基础，并具有重要意义。
近年来，金属配合物作为新的抗癌药物引起了人们的注意。在非铂系药物中，金属铁、钌配合物是较有前途的抗癌药物之一。目前普遍认为，铁、钌配合物具有高效低毒、吸收容易、体内排泄快的特点。其在药学，生命科学、材料学等领域具有广泛应用前景。
以三联吡啶衍生物为配体的铁、钌配合物的研究在光物理、光化学、超分子化学、药学、材料科学和超分子化学等领域发等方面具有重要的研究价值，并受到了广泛重视。目前以三联吡啶衍生物为配体的铁、钌配合物的研究，主要是以设计含各种不同取代基的衍生物为基础，来改变其理化性质，使得其发展实用性较强。但多数情况下，所修饰的配体单独作用并没有抗肿瘤活性，需要与金属离子配合后，才能发挥其活性。因此，将本身具有生物活性的氮芥，与三联吡啶偶联形成，形成含氮芥的三联吡啶衍生物，再与铁、钌等金属离子进行配位，合成含氮芥的铁、钌配合物，以提高其生物活性，无疑为今后新型氮芥类药物或钌配合物类药物的研发提供重要的思路和策略。
发明内容
目前仍然鲜有文献报告将氮芥与金属配合物进行偶联，针对现有技术中存在的不足和为了填补本领域的技术空白，本发明提供了一种含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物、合成方法与应用，合成了一种新颖的配合物，其具备氮芥和金属配合物双重理化性质和生物活性，并可应用于制备抗肿瘤药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物，结构式如下：
其中，M为Fe或Ru中的一种。当M为Fe时，为配合物[Fe(tpy-CM)2]Cl2；当M为Ru时，为[Ru(tpy-CM)2]Cl2。本发明合成的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物的化学通式为[Fe(tpy-CM)2]Cl2和[Ru(tpy-CM)2]Cl2，其中，配体typ-CM为4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2',6',2-三联吡啶。
本发明还提供一种所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物的合成方法，包括以下步骤：
(1)合成4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛：冰水浴条件下，在DMF中滴加POCl3,边滴边搅拌，滴加完毕于冰水浴中继续反应25-35min，优选反应30min，得到第一溶液，然后将含有N,N-二(2-羟乙基)-苯胺的DMF溶液加入所述第一溶液中，90-110℃反应2-4h，优选于100℃反应3h，冷却至室温，得到第二溶液，将所述第二溶液倒入冰水中，用碱液调至中性，抽滤，滤饼洗涤后重结晶，得到浅黄色固体，即为4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛；
(2)合成4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2',6',2-三联吡啶：将4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛、2-乙酰吡啶和NaOH加入到乙醇中，室温反应25-35min(优选反应30min)后加入氨水，反应10-15h，优选反应12h，得到第三溶液，将所述第三溶液浓缩到原来的1/3，过滤，滤饼洗涤后烘干，然后重结晶得到浅黄色固体，即为4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2',6',2-三联吡啶；
(3)合成含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物：将4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2',6',2-三联吡啶溶于乙二醇甲醚中，搅拌状态下加入铁/钌的氯化物，120-130℃回流反应6-10h，优选124℃回流反应8h，除去溶剂后洗涤，干燥，得到含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物。
进一步地，所述步骤(1)中DMF与POCl3的摩尔比为(2-2.5)：1，含有N,N-二(2-羟乙基)-苯胺的DMF溶液中N,N-二(2-羟乙基)-苯胺与DMF的摩尔比为1：1。
进一步地，所述步骤(1)碱液包括NaOH、KOH、Na2CO3、K2CO3或乙醇钠。
进一步地，所述步骤(1)用乙醇/二氯甲烷的混合溶液重结晶，混合溶液中乙醇与二氯甲烷的体积比为1：1。
进一步地，所述步骤(2)4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛、2-乙酰吡啶和NaOH的摩尔比为1：2：2。
进一步地，所述步骤(2)用甲醇/二氯甲烷的混合溶液重结晶，混合溶液中甲醇与二氯甲烷的体积比为1：1。
进一步地，所述步骤(3)4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2',6',2-三联吡啶与铁/钌的氯化物的摩尔比为2：1。
本发明还提供所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤药物活性成分包括本发明所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物或其药学上可接受的盐。
本发明以合成的偶联氮芥的三联吡啶作为配体，然后与铁、钌离子进行配位合成相应配合物[Fe(tpy-CM)2]Cl2和[Ru(tpy-CM)2]Cl2。所述配合物[Fe(tpy-CM)2]Cl2和[Ru(tpy-CM)2]Cl2由于包含金属离子，带有电荷，因此，比起单独氮芥或钌配合物，该配合物具有全新的抗肿瘤机制。细胞毒性实验验证了[Ru(tpy-CM)2]Cl2具有抗肿瘤活性，对肿瘤细胞生长的抑制能力较强。细胞周期表明该药物能够使细胞G1期阻滞，凋亡实验表明该药物能够诱导细胞凋亡。划痕实验(Wound Healing)表明该药物消弱了细胞伤口愈合的能力。细胞迁移实验(Transwell Migration)表明细胞迁移能力明显减弱。细胞克隆形成实验(Colonyformation)表明药物显著抑制细胞的生长。Western blot进一步表明了该药物影响了细胞周期蛋白Cyclin A1、Cyclin E和凋亡相关蛋白Bim。
本发明公开了以下技术效果：
1、成功将氮芥与钌、铁配合物两个活性官能团进行偶联，合成含氮芥的钌、铁配合物，其化合物具有合成方法简易可行、分离简便，结构简单、无手性中心等特点，体外抗肿瘤活性实验表明，该类配合物具有良好的活性，能够有效抑制肿瘤细胞的生长、迁移、爬行和克隆等特点，使肿瘤细胞周期阻滞在G1期，并诱导细胞凋亡。
2、制备本发明新化合物的操作步骤少，副反应少，原料易得，溶剂绿色环保和产物易于分离提纯。
3、该药物本身具有较好的抗肿瘤活性，为氮芥与金属配合物的偶联物的开发提供了重要的借鉴和思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1步骤1制备产物的核磁氢谱图；
图2为本发明实施例1步骤1制备产物的质谱图；
图3为本发明实施例1步骤2制备产物的核磁氢谱图；
图4为本发明实施例1步骤2制备产物的核磁碳谱图；
图5为本发明实施例1步骤2制备产物的质谱图；
图6为本发明实施例1步骤3制备产物的核磁氢谱图；
图7为本发明实施例1步骤3制备产物的核磁碳谱图；
图8为本发明实施例1步骤3制备产物的质谱图；
图9为本发明实施例2步骤3制备产物的核磁氢谱图；
图10为本发明实施例2步骤3制备产物的核磁碳谱图；
图11为本发明实施例2步骤3制备产物的质谱图；
图12为本发明效果验证1中MDA-MB-231细胞毒性实验结果图；
图13为本发明效果验证1中786-O细胞毒性实验结果图；
图14为本发明效果验证1中A549细胞毒性实验结果图；
图15为本发明效果验证1中HepG2细胞毒性实验结果图；
图16为本发明效果验证2中786-O细胞经化合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2孵育后的细胞周期实验结果图；
图17为本发明效果验证3中786-O细胞经化合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2孵育后用Annexin V-PI双染法检测细胞凋亡情况的结果图；
图18为本发明效果验证4中786-O细胞经化合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2孵育后的细胞划痕实验结果图，其中图A为显微镜下拍摄细胞爬行的情况图，B图为对应数据图；
图19为本发明效果验证5中786-O细胞经化合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2孵育后的Transwell细胞迁移实验结果图，其中图A为倒置荧光显微镜下拍摄Transwell细胞迁移图，B为对应数据图；
图20为本发明效果验证6中786-O细胞经化合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2孵育后的细胞侵袭实验结果图，其中图A为倒置荧光显微镜下拍摄细胞侵袭情况图，B为对应数据图；
图21为本发明效果验证6中786-O细胞经化合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2孵育后的克隆形成实验结果图，其中图A为拍照图，B为对应数据图；
图22为本发明效果验证6中786-O细胞经化合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2孵育后的泳道蛋白的表达图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1至实施例2是配合物[Fe(tpy-CM)2]Cl2和[Ru(tpy-CM)2]Cl2制备实施例，所用试剂均为常见市售商品，纯度级别均为分析纯。其合成工艺路线如下：
实施例1[Fe(tpy-CM)2]Cl2的制备
步骤1、4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛的合成
将102.2mmol(7.46g)的DMF加入干燥的圆底烧瓶中,冰水浴下边搅拌边缓慢滴加45.5mmol(6.97g)的POCl3,滴加完继续于冰浴中继续反应30min。然后将含有13.8mmol(2.50g)的N,N-二(2-羟乙基)-苯胺的DMF 13.8mmol(1.01g)溶液加入上述溶液,于100℃反应3h，冷却，待回至室温后，将上述溶液倒入到200mL的冰水中，用1mol/L的NaOH溶液调至中性，抽滤，滤饼用少量冷的乙醇/水混合液(v:v＝1：1)洗两次,最后用乙醇/二氯甲烷(v:v＝1:1)混合液重结晶，得浅黄色固体，即为4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛，产率85％，核磁氢谱图见图1，质谱图见图2。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:9.72(s,1H,CHO),7.72(d,J＝8.86Hz,2H,ArH),6.90(d,J＝8.80Hz,2H,ArH),3.85(t,J＝5.75Hz,4H,CH2CH2Cl),3.79(t,J＝5.61Hz,4H,CH2CH2Cl)；HR-MS(ESI)calcd for C11H14Cl2NO[M+H]+246.0452,found246.0450.
步骤2、4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2',6',2-三联吡啶(化合物tpy-CM)合成
将10mmol的4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛(1.23g)、20mmol的2-乙酰吡啶(1.21g)和20mmol的NaOH(0.80g)加入到80ml乙醇中，室温下反应30min后加入15mL 25％的氨水，反应12h。将溶剂浓缩到大约原来的1/3，过滤，滤饼用水/乙醇(v:v＝1:1)洗两次，烘干，然后用甲醇/二氯甲烷(v:v＝1:1)重结晶，得浅黄色固体，即为tpy-CM，产率42％，核磁氢谱图见图3，核磁碳谱图见图4，质谱图见图5。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:8.76(d,J＝4.26Hz,2H,ArH),8.66(t,J＝4.19Hz,4H,ArH),8.02(td,J＝8.09,1.42Hz,2H,ArH),7.81(d,J＝8.71Hz,2H,ArH),7.52(dd,J＝7.39,5.21Hz,2H,ArH),6.95(d,J＝8.90Hz,2H,ArH),3.83(m,4H,CH2CH2Cl),3.81(m,4H,CH2CH2Cl).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:155.92,155.68,149.76,149.52,148.03,137.84,128.44,125.58,124.84,121.33,116.99,112.85,52.35,41.49.HR-MS(ESI)calcd for C25H23Cl2N4[M+H]+449.1300,found 449.1305.
步骤3、[Fe(tpy-CM)2]Cl2的合成
将4mmol的tpy-CM溶入到120mL的乙二醇甲醚当中，搅拌下加入2mmol的FeCl3，于124℃加热回流反应8h，除去溶剂后用乙醚洗涤两次(20mL×2)，干燥，得到产物[Fe(tpy-CM)2]Cl2，产率为92％，纯度为97％，核磁氢谱图见图6，核磁碳谱图见图7，质谱图见图8。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.63(s,2H),9.13(d,J＝7.76Hz,2H),8.53(d,J＝8.26Hz,2H),8.04(t,J＝7.60Hz,2H),7.27(d,J＝5.62Hz,2H),7.22(t,J＝6.79Hz,2H),7.17(d,J＝8.42Hz,2H),3.96(t,J＝6.71Hz,4H),3.89(t,J＝6.51Hz,4H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ160.01,158.65,153.15,149.43,149.23,139.03,129.75,127.89,124.44,123.92,119.92,112.83,52.20,41.81.HR-MS(ESI):C50H48Cl4N8Fe,m/z,calculated 477.0975,found477.0970.
实施例2[Ru(tpy-CM)2]Cl2的制备
实施例2的步骤1和步骤2与实施例1的步骤1和步骤2相同。
步骤3、将4mmol的tpy-CM(1.348.2g)溶入到120mL的乙二醇甲醚当中，搅拌下加入2mmol的RuCl3·3H2O，于124℃加热回流反应8h，除去溶剂后用乙醚洗涤两次(10mL×2)，干燥，得到产物[Ru(tpy-CM)2]Cl2，产率为90％，纯度为97％，核磁氢谱图见图9，核磁碳谱图见图10，质谱图见图11。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.42(s,2H),9.15(d,J＝8.25Hz,2H),8.40(d,J＝9.10Hz,2H),8.06(td,J＝7.7,1.6Hz,2H),7.52(d,J＝4.90Hz,2H),7.28(td,J＝7.05,1.12Hz,2H),7.10(d,J＝8.91Hz,2H),3.96(t,J＝6.60Hz,4H),3.89(t,J＝6.15Hz,4H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ158.78,155.30,152.51,148.89,147.38,138.34,129.57,128.08,125.22,124.20,119.92,112.77,52.22,41.80.HR-MS(ESI)C50H48Cl4N8Ru,m/z,calculated 500.0822,found 500.0820.
效果验证1、体外抗肿瘤活性
用于测定细胞活性的一种高灵敏度比色检测法：将处于对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔培养皿中，密度约2×103个细胞，约24h细胞贴壁后，每孔加入100μM的不同浓度的药物(用含10％FBS的培养基稀释)，于37℃培养箱，孵育72h后，弃去96孔板内的培养基，每孔加入100μL CCK8试剂，继续培养箱内孵育2h。接着用酶标仪读取每孔OD450数值，计算不同浓度药物处理后细胞的活性改变。结果见图12-图15，对应的数据见表1-表4。
表1 人乳腺癌细胞MDA-MB-231毒性实验结果(细胞存活率/％)
表2 人肾透明细胞腺癌细胞786-O毒性实验结果(细胞存活率/％)
表3 人非小细胞肺癌细胞系A549毒性实验结果(细胞存活率/％)
表4 人肝癌细胞HepG2细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)
从表1至表4和图12-图15可以看出，随着化合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2或[Fe(tpy-CM)2]Cl2浓度的增加，其对MDA-MB-231、786-O、A549和HepG2等肿瘤细胞的增殖的抑制能力不断增强，且均有较高的抑制活性。同时，相比之下[Ru(tpy-CM)2]Cl2比[Fe(tpy-CM)2]Cl2具有更好的抗肿瘤活性。下面以药物[Ru(tpy-CM)2]Cl2对786-O细胞的作用进一步展开研究。
效果验证2、细胞周期实验
采用流式细胞术研究了配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2诱导786-O细胞的细胞周期阻滞情况，结果见图16。由图16可知，G1期的比例随着加药浓度的增加而增加。具体地，当加药浓度为0μM时，G1期的比例占48.3％，当浓度为8μM时，G1期的比例上升到67.4％，当浓度上调到16μM时，G1期的比例进一步上升到75.7％，总体呈浓度依赖关系。说明配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2能有效使786-O细胞阻滞于G1期而发挥抗肿瘤作用。
效果验证3、细胞凋亡实验
采用Annexin V FITC和PI双染色法测定配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2对786-O细胞的凋亡效应。图17为药物浓度分别为0、8和16μM作用于细胞48h后，配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2对诱导786-O细胞凋亡的百分数。由图17可知，0μM时，早期凋亡和晚期凋亡只占6.45％和5.47％。8μM时，早期凋亡和晚期凋亡分别上升到10.51％和8.33％。当加药浓度为16μM时，晚期凋亡进一步上升到19.02％。可推测配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2通过诱导786-O细胞进入晚期凋亡而抑制肿瘤生长。
效果验证4、细胞划痕实验
细胞划痕实验可以简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法,类似体外伤口愈合模型。将处于对数生长期的细胞，按5×105个细胞的密度接种于6孔培养皿上，待贴壁后后，用微量枪头在细胞生长的中央区域垂直划线，碎片用PBS清洗2次，添加细胞培养基，使细胞继续生长至实验设定的时间。弃掉培养基后加入Hoechst染料于37℃孵育染色20min，用PBS清洗2次后，在倒置荧光显微镜下拍摄划痕区细胞的迁移情况，见图18。对应的数据见表5。
从表5和图18中可以看出，经过24h的爬行，786-O细胞空白组表现出较强的迁移能力，而加药组则明显抑制细胞的迁移和爬行，并随着浓度增加，抑制能力增加，呈现浓度依赖关系。表明配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2能有效抑制细胞的迁移。
表5 786-O细胞划痕实验结果(Wound width/％)
| 浓度(μM) | 0 | 8 | 16 |
| 0h | 100.0±3.9 | 105.1±4.5 | 118.64±5.5 |
| 24h | 29.6±3.0 | 72.0±5.1 | 94.9±4.4 |
效果验证5、Transwell细胞迁移实验
验证经典的肿瘤细胞迁移作用，具有重复性强，容易量化的优点。待肿瘤细胞处于对数生长期时，以约5×105个细胞/皿的密度种入到6孔培养皿，待贴壁且融合度达70-80％后，更换含有10％FBS的培养基，加入不同浓度的[Ru(tpy-CM)2]Cl2，孵育48h后，吸弃培养基，PBS清洗1次，用0.25％胰酶消化，以及PBS清洗1次，用不含血清的培养基重悬细胞。用细胞计数板读取细胞悬液浓度，将5万个细胞种入孔径8μm的Transwell小室的上室，用无血清培养基补齐体积至300μL。Transwell小室的下室加入10％FBS的培养基1mL，放入24孔板中培养。24h后取出Transwell小室，用甲醇固定15min，PBS清洗1次，结晶紫染色10min后，再用PBS清洗1次，用棉签擦拭未穿过小室的细胞，在倒置显微镜下拍摄并计数已迁移的细胞数目。如图19，对应数据见表6。
表6 不同浓度下的786-O细胞的迁移细胞数
从表6及图19中可以看出，随着配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2浓度的增加，转移到transwell板上室下表面的细胞逐渐减少，这说明配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2可通过降低肿瘤细胞的转移能力来发挥抗肿瘤作用。
效果验证6、细胞侵袭实验
取Transwell小室，加入50ul 10％的基质胶至小室上层铺平，放入细胞培养箱中凝固24h。取对数生长期的786-O细胞，用PBS洗涤，用0.25％胰酶消化，以及PBS清洗1次，接着用无血清培养基将细胞悬浮，调密度为106/mL。在24孔板下室加入1mL含10％的FBS培养基，将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液300μL加入上室，放入培养箱中培养24h。24h后取出Transwell小室，用甲醇固定15min，PBS清洗1次，结晶紫染色10min后，再用PBS清洗1次，用棉签擦拭未穿过小室的细胞，在倒置显微镜下拍摄并计数已迁移的细胞数目，结果见图20。
表7 不同浓度下的786-O细胞的侵袭细胞数
| 浓度(μM) | 0 | 8 | 16 |
| 细胞数 | 367.3±10.0 | 128.0±15.1 | 68.6±7.3 |
从表7及图20中可以看出，随着[Ru(tpy-CM)2]Cl2浓度为8μM时，细胞侵袭数从367.3下降到128.0，当作用的浓度增加到16μM时，侵袭的细胞数只有约68.6，呈浓度依赖关系。说明药物[Ru(tpy-CM)2]Cl2能有效的抑制细胞的侵袭。
效果验证7、克隆形成实验
于六孔板中种入处于对数生长期的786-O细胞。待细胞贴壁后加入不同浓度的[Ru(tpy-CM)2]Cl2，孵育48h后，吸弃培养基，用PBS洗去多余的培养基，用胰酶消化细胞，将各组细胞以800个/孔种于6孔板中，加入培养基孵育10-14天。吸弃培养基，多余的培养基通过用PBS洗去，室温下用甲醇固定30分钟，多余的甲醇用PBS洗去，再用1mM的结晶紫染液染色10分钟，PBS洗去多余染液，拍照。结果见图21，对应的数据见表8。
表8 不同药物处理组的786-O细胞克隆形成数
| 浓度(μM) | 0 | 8 | 16 |
| 克隆数 | 94.0±6.6 | 19.6±2.2 | 16.6±2.2 |
从图21中可以看出，随着配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2浓度的增加，细胞克隆数逐渐减少，当浓度为6μM时，克隆数由94.0下降到19.6，浓度上升到16μM时，细胞克隆数仅为16.6。表明配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2对786-O细胞具有较强的抗增殖作用。
效果验证8、Western blot实验
蛋白质印迹法(Western blot)，通过半定量的方法检测细胞内蛋白含量的变化。待肿瘤细胞处于对数生长期时，在6孔培养皿上种入约5×105个细胞，待24h细胞贴壁且融合度达70-80％后，更换含有10％FBS的培养基，加入一定浓度的药物，作用48h后，弃去培养基，用PBS清洗1次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液100μL，冰上裂解细胞15min后。经高速离心15min去除不溶物，通过BCA法绘制标准品曲线，测定每个样品的蛋白浓度并配平。加入含有SDS的缓冲液，100℃煮沸10min，使蛋白充分变性。在10-12％的SDS-PAGE胶中加入30ug蛋白/孔，经过100V 120min电泳后用湿式电转100V 60min将蛋白转至PVDF膜上。用5％BSA室温孵育PVDF膜，封闭1h。加入一抗稀释液孵育过夜。用0.1％TBST清洗3次后加入二抗稀释液孵育2h，0.1％TBST清洗3次后，用ECL法在BIORAD凝胶成像系统上检测每个泳道蛋白的表达。结果如图22，可以看出，配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2可以下调Cyclin A1、Cyclin E和CDK1的表达，上调Bim的表达。该结果进一步验证了配合物[Ru(tpy-CM)2]Cl2能够引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物，其特征在于，结构式如下：
其中，M为Fe或Ru中的一种。
2.一种如权利要求1所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛：冰水浴条件下，在DMF中滴加POCl3,边滴边搅拌，滴加完毕于冰水浴中继续反应25-35min，得到第一溶液，然后将含有N,N-二(2-羟乙基)-苯胺的DMF溶液加入所述第一溶液中，90-110℃反应2-4h，冷却至室温，得到第二溶液，将所述第二溶液倒入冰水中，用碱液调至中性，抽滤，滤饼洗涤后重结晶，得到浅黄色固体，即为4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛；
(2)合成4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2',6',2-三联吡啶：将4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛、2-乙酰吡啶和NaOH加入到乙醇中，室温反应25-35min后加入氨水，反应10-15h，得到第三溶液，将所述第三溶液浓缩到原来的1/3，过滤，滤饼洗涤后烘干，然后重结晶得到浅黄色固体，即为4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2',6',2-三联吡啶；
(3)合成含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物：将4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2',6',2-三联吡啶溶于乙二醇甲醚中，搅拌状态下加入铁/钌的氯化物，120-130℃回流反应6-10h，除去溶剂后洗涤，干燥，得到含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物。
3.根据权利要求2所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中DMF与POCl3的摩尔比为(2-2.5)：1，含有N,N-二(2-羟乙基)-苯胺的DMF溶液中N,N-二(2-羟乙基)-苯胺与DMF的摩尔比为1：1。
4.根据权利要求2所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)碱液包括NaOH、KOH、Na2CO3、K2CO3或乙醇钠。
5.根据权利要求2所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)用乙醇/二氯甲烷的混合溶液重结晶，混合溶液中乙醇与二氯甲烷的体积比为1：1。
6.根据权利要求2所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)4-[双(β-氯乙基)氨基]苯甲醛、2-乙酰吡啶和NaOH的摩尔比为1：2：2。
7.根据权利要求2所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物的合成方法，其特征在于，所述步骤(2)用甲醇/二氯甲烷的混合溶液重结晶，混合溶液中甲醇与二氯甲烷的体积比为1：1。
8.根据权利要求2所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物的合成方法，其特征在于，所述步骤(3)4-(4-[双(β-氯乙基)氨基]苯基)-2,2',6',2-三联吡啶与铁/钌的氯化物的摩尔比为2：1。
9.一种含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括权利要求1所述的含氮芥的三联吡啶铁/钌配合物或其药学上可接受的盐。
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