CN101333187A - 一类新型pi3k酶抑制剂及其应用 - Google Patents
一类新型pi3k酶抑制剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一类PI3K酶抑制剂的制备及其应用。首先对先导化合物进行结构改造并且通过合成得到，然后用Western印迹法测定目标化合物对PI3K酶的抑制率，进行生物活性筛选，从而获得一类较为理想的新型PI3K酶抑制剂。经细胞实验，证明了本发明的PI3K酶抑制剂对肿瘤细胞有比较显著的抑制作用。可作为制备治疗PI3K酶活性过高导致疾病的潜在药物；本发明的PI3K酶抑制剂，活性高，毒性低，预示具有较大的临床应用前景。所说的PI3K酶抑制剂，为具有通式I、II、III的化合物或其药学上可接受的盐。
Description
技术领域
本发明涉及一类新型PI3K酶抑制剂——5-(3-氨基苯)烟酸甲酯类似物的新用途，具体的说，涉及5-(3-氨基苯)烟酸甲酯类似物作为新型PI3K酶抑制剂及其在抑制PI3K酶活性过高导致的疾病治疗中的应用。
技术背景
癌症、高血压和血栓病都是人类目前最难克服的几种顽症，亦是世界医学的几大难题。癌症是世界上夺走生命最多的疾病，每年死亡人数有七百万左右。我国癌症年新发病例为200万，因癌症死亡人数为140万，每死亡5人中，即有1人死于癌症。癌症已成为我国城市的第一杀手，农村的第二大死因。高血压是常见高发疾病，据统计到2025年全世界将有超过15亿高血压患者，其中四分之三的患者将来自发展中国家。高血压会导致心血管、脑血管、肾血管以及大血管等病变。血栓病亦是困扰人们的常见疾病。因此针对上述几种疾病的药物开发与研制已成为近年来的重要课题。
PI3Ks(磷酯酰肌醇3-激酶)抑制剂作为这几种疾病治疗的潜在价值引起了广泛关注。PI3Ks主要包括PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ四种形态。其主要功能包括：1)激活PI3Ks/Akt通路控制下游的凋亡抑制蛋白来抑制细胞凋亡，从而诱导了肿瘤细胞的耐药性(Cancer Treatment Reviews 2004，30：193-204)。2)控制PI3Ks/Akt通路下游蛋白(GSK3，mTOR，Mdm2等)促进细胞增殖(Cancer Treatment Reviews 2004，30：193-204)。3)磷酸化并激活鸟嘌呤交换因子(GEFs)，如Vav，Tiam1，SOS，P-Rex1，活化的GEFs进一步激活控制细胞游走的关键蛋白Rho-GTPases(J.Cell Biol.2003，160：17-23；Cell2002，108：809-821)。4)控制细胞DNA的转录和表达，细胞营养物质的摄取，从而影响到细胞的生长与分裂(TRENDS in pharmacological Sciences 2003，24：366-376)。药理研究(Science2000，287：1049-1053；Science 2000，287：1046-1049；Science 2000，287：1040-1046；FASEB J.2001，15：2019-2021)表明，PI3Kγ缺失老鼠对各种炎症和血栓病表现出强烈的抗性，抑制PI3Ks酶活性有助于改善心血管的收缩性和治疗高血压病；反之，高活性的PI3Ks能够促进肿瘤细胞的增殖和抑制肿瘤细胞的调亡。因此PI3Ks酶是一个重要的疾病治疗靶标，PI3Ks酶抑制剂成为多种疾病治疗的潜在药物。LY294002是目前已进入临床研究的PI3K酶抑制剂药物，然而其活性太强，对正常细胞毒性大，寻求新型PI3Ks酶抑制剂也就成为当前PI3Ks酶研究的热点。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一类新型PI3K酶抑制剂——5-(3-氨基苯)烟酸甲酯类似物，作为治疗PI3K酶活性过高导致的疾病的潜在药物，以满足PI3Ks酶抑制剂药物开发的需要。
本发明公开的新型PI3K酶抑制剂，具有通式I、II、III的化合物或其药学上可接受的盐：
式II
其中：-R1为-NH2，-CH2NH2或-CONH2；
-R2，-R3，-R4为-CH3或者-OCH3或者-OCH(CH3)2。
优化的化合物为：3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺或其药学上可接受的盐、4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺或其药学上可接受的盐、4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲酰胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
其中最优化的化合物为3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺或其药学上可接受的盐
本发明所说的盐没有特殊限制，只有当它们作治疗用途时，是药学上可接受的。本发明化合物含有碱性基团可与酸成盐。这类酸加成盐的例子包括：与无机酸，尤其是氢卤酸(如氢溴酸、氢碘酸、氢氯酸)，硝酸、硫酸、磷酸、碳酸等形成的盐；与低级烷基磺酸，如甲磺酸、三氟甲磺酸形成的盐；与芳基磺酸，如苯磺酸或对甲苯磺酸形成的盐；与有机酸，如乙酸、富马酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、马来酸、苹果酸或琥珀酸形成的盐；与氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸形成的盐。
本发明公开了式I、II、III所示PI3K酶抑制剂的用途，用于制备治疗PI3K酶活性过高导致疾病的药物。且该PI3K酶抑制剂的细胞选择性优于LY294002。
所述的PI3K酶活性过高导致的疾病包括炎症、血栓、自身免疫性疾病、心血管疾病和肿瘤病；具体包括急性胰腺炎，慢性肠道炎，支气管哮喘；急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、瓣膜病、心房颤动；糖尿病，类风湿关节炎，慢性甲状腺炎；动脉粥样硬化、高血压；乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和淋巴瘤。
本发明的PI3K酶抑制剂毒性低，活性高，预示具有较大的临床应用前景。
附图说明
图1为WesternBlot实验结果表现的七种目标化合物对PI3Ks酶活性的影响。
图2为3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺与LY294002的药物敏感性实验结果。
图3为4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺与LY294002的药物敏感性实验结果。
图4为3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺的细胞选择性实验结果。
图5为4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺的细胞选择性实验结果。
图6为3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺与ly294002的细胞选择性对比实验结果；图中1号化合物为3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺。
图7为4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺与ly294002的细胞选择性对比实验结果；图中2号化合物为4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺。
图8为本发明化合物或其药学上可接受的盐的通式。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例13-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺
步骤A：3-溴-2，4，6-三甲基吡啶的制备
将称取的2，4，6-三甲基吡啶滴加入到3.0ml三氟乙酸中(瓶中溶液颜色变深，放出大量的热)，待温度降下来之后，再加入浓硫酸(4.0ml)和N-溴代丁二酰亚胺(NBS，分4次加入)，室温下搅拌36h，反应需避光。事先配制2mol/L的NaOH溶液置于-20℃冰箱冷冻备用。待反应结束，将NaOH溶液缓缓滴加入单口烧瓶(冰浴中进行，配合冷凝装置，磁力搅拌)，中和至pH为7。乙酸乙酯萃取，萃取液用Na2SO4干燥后旋转蒸干，得到淡黄色的液体，即产物3-溴-2，4，6-三甲基吡啶。Rf值(石油醚∶乙酸乙酯＝8∶2)0.61，MS(EI)：m/z199，m/z201[M]+，1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ2.33(s，3H)，δ2.42(s，3H)，δ2.62(s，3H)，δ6.87(s，1H)。
步骤B：2，4，6-三甲基-3-(3-硝基苯)吡啶的合成
将称取的2，4，6-三甲基-3-溴吡啶(0.01mol，1.99g)和3-硝基苯硼酸(0.01mol，1.66g)放入100ml三颈烧瓶中，加入甲醇6.5ml，甲苯37.5ml，磁力搅拌溶解。再加入Na2CO32.125g，蒸馏水12.5ml，继续搅拌，通N2气20min。称取Pd(PPh3)40.6g，加入三颈烧瓶，继续通N2气15min。油浴加热，开始回流时计时，反应24h。反应完后，将反应液转移到一圆底烧瓶中，用旋转蒸发蒸发仪蒸去溶剂。蒸干后，用乙酸乙酯提取，超声共振助溶解，放置一段时间使产物充分溶解到乙酸乙酯中。将固体杂质抽滤出去，所得滤液点硅胶板，得到Rf值0.23(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)。经柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚(1∶6)收集有用的组分。旋转蒸干，重结晶(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1)得到白色固体即产物2，4，6-三甲基-3-(3-硝基苯)吡啶，产率为71％，Mp 117-119℃，MS(EI)：m/z 242，m/z242[M]+。
步骤C：3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺的合成
将中间体化合物化合物2，4，6-三甲基-3-(3-硝基苯)吡啶(0.267g)与氯化亚锡(1.745g)一同加入盛有适量异丙醇的圆底烧瓶中，加入浓HCl 3.5ml，油浴加热，磁力搅拌，加热至60℃时，开始计时，反应5h。配制10％的NaOH溶液，置冰箱中备用。待反应完之后，将NaOH溶液从冰箱中取出，把三颈烧瓶中的反应液倾倒入其中，并调pH值至中性，发现有白色沉淀产生。抽滤，所得固状滤饼用乙酸乙酯提取。再次抽滤，滤液中加无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸干，经柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚(1∶1)，得到淡黄色的液体，即产物3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺，产率为38％。Rf(乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1)0.3；MS(ESI)：m/z 213([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：2.02(s，3H)，2.27(s，3H)，2.52(s，3H)，3.72(brs，J＝2.48Hz，2H)，6.46(s，J＝1.75Hz，1H)，6.52(d，J＝7.51Hz，1H)，6.68(d，J＝10.28Hz，1H)，6.89(s，1H)，7.21(m，J＝15.48，1H)，纯度为96.7％。
实施例24-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺
步骤A：4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]氰苯的合成
具体方法同实施例1中步骤B，此反应中的芳卤为3-溴-2，4，6-三甲基吡啶(1.592g，8mmol)，苯硼酸则为对腈基苯硼酸(1.176g，8mmol)。经柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚(1∶8)，乙酸乙酯-石油醚(1∶1)重结晶得到白色晶体，即目标产物4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]氰苯，Rf(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)0.61，产率为58.6％；MS(EI)：m/z 222([M]+，100％)。
步骤B：4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺的合成
将20ml叔丁醇置于单口圆底烧瓶中，加入称取的中间体化合物4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]氰苯(0.5g)和NaOH(0.43g)，磁力搅拌，油浴加热回流1.5h。反应结束后，将反应液旋转蒸干，用饱和食盐水洗涤3次，并将洗涤液用乙酸乙酯萃取。合并萃取得到的乙酸乙酯，旋转蒸干，再经柱层析分离，洗脱剂为甲醇-石油醚(1∶10)，甲醇-石油醚(1∶8)重结晶得到白色晶体即产物4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺，产率为63.5％，Rf(甲醇∶石油醚＝5∶1)0.18，Mp 201-202℃。MS(ESI)：m/z 240([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ1.98(s，3H)，δ2.05(s，2H)，δ2.22(s，3H)，δ2.52(s，3H)，δ6.94(s，1H)，δ7.24(d，J＝8.17Hz，2H)，δ7.91(d，J＝8.19Hz，2H)；纯度为99.0％。
实施例34-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲酰胺
步骤A：3-氯-6-异丙氧基哒嗪的制备
在1L的三颈烧瓶中，于常温下，将3，6-二氯哒嗪(0.1mol)溶解于500ml的异丙醇中，加入金属钠(0.1mol)，水浴加热，控制温度为60℃，搅拌2小时后，反应液冷却至室温，抽滤，滤液减压浓缩，水洗，抽滤，重结晶(乙醇)，得产物3-氯-6-异丙氧基哒嗪。Mp 77-79℃；MS(EI)：m/z 174，m/z176[M]+。
步骤B：4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]氰苯的合成
具体方法同实施例1中步骤B，本反应中的芳卤为3-氯-6-异丙氧基哒嗪(1.392g，0.008mol)，苯硼酸则为对腈基苯硼酸(1.176g，0.008mol)，经柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚(1∶12)，乙酸乙酯-石油醚(1∶1)重结晶得到浅黄色晶体，即目标产物4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]氰苯，产率为39.3％；Rf(石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1)0.21；Mp 120～123℃；MS(EI)：m/z 239([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：1.48(d，6H)，5.66(m，J＝24.7Hz，1H)，7.03(d，J＝9.2Hz，1H)，7.80(m，J＝15.9Hz，3H)，8.14(d，J＝8.6Hz，2H)；元素分析：C14H13N3O实测值(理论值)/％为C 70.29(70.47)，H 5.44(5.02)，N 17.57(17.65)。
步骤C：4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲酰胺的合成
具体方法同实施例2中步骤B，反应物为中间体化合物4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]氰苯(1.912g，0.008mol)，经柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚(2∶1)，乙酸乙酯重结晶得到白色晶体即产物4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲酰胺，产率为37.7％；Rf(乙酸乙酯∶石油醚＝4∶1)0.26；Mp 233-234℃；MS(ESI)：m/z 257([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：1.43(m，J＝10.51Hz，6H)，5.54(m，J＝24.61Hz，1H)，7.17(d，J＝9.26Hz，1H)，8.01(d，J＝8.58Hz，2H)，8.10(d，J＝10.20Hz，3H)，纯度为98.6％
实施例44-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺
步骤A：4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]氰苯的合成
具体方法同实施例1中步骤B，本反应中的芳卤为2-氯-4，6-二甲氧基嘧啶(1.396g，0.008mol)，苯硼酸则为对腈基苯硼酸(1.176g，0.008mol)。经柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚(1∶4)，乙酸乙酯-石油醚(1∶2)重结晶得到白色晶体即中间产物4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]氰苯，产率为75.9％；Rf(石油醚∶乙酸乙酯＝6.5∶3.5)0.878；Mp 156-157℃；MS(EI)：m/z 240([M-H]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：4.05(s，6H)，6.03(s，1H)，7.75(d，J＝8.5Hz，2H)，8.56(d，J＝8.6Hz，2H)；元素分析：C13H11N3O2实测值(理论值)/％为C 64.76(64.73)，H 4.29(4.56)，N 17.61(17.43)。
步骤B：4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺
具体方法同实施例2中步骤B，反应物为中间体化合物4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]氰苯(1.92g，0.008mol)，经柱层析分离，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚(2∶1)，乙酸乙酯重结晶得到白色晶体即产物4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺，产率为54.3％；Rf(乙酸乙酯∶石油醚＝4∶1)0.36；Mp 193-195℃；MS(EI)：m/z 258([M-H]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：4.11(s，7H)，5.74(br s，1H)，6.06(s，1H)，6.17(br s，1H)，7.91(d，J＝8.3Hz，2H)，8.54(d，J＝8.3Hz，2H)；元素分析：C13H13N3O3实测值(理论值)/％为C 60.77(60.23)，H 4.91(5.02)，N 15.81(16.21)；纯度为98.7％。
实施例54-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺
步骤A：4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]氰苯的合成
具体方法及数据同实施例2步骤A。
步骤B：4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺的合成
在三颈烧瓶中加入适量的THF，缓缓加入LiAlH40.76g(20mmol)，磁力搅拌。4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]氰苯(1.11g，5mmol)溶于少量的THF中，缓慢的滴加入三颈烧瓶中，油浴加热反应5h。待反应结束后，缓缓滴加2ml去离子水∶THF＝1∶1的溶液(冰水浴)，再滴加2ml 20％的NaOH溶液，然后再次滴加8ml去离子水∶THF＝1∶1的溶液。滤去沉淀，滤饼用THF洗三次。经柱层析分离，洗脱剂为甲醇-石油醚(4∶1)，得到淡黄色的液体即产物4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺；产率为54.3％；Rf(甲醇∶石油醚＝8∶1)0.70；MS(ESI)：m/z 226([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ1.25(m，J＝14.04Hz，2H)，δ2.0(s，3H)，δ2.25(s，3H，δ2.52(s，3H)，δ3.94(s，2H)，δ6.92(s，1H)，δ7.12(d，J＝8.05Hz2H)，δ7.38(d，J＝8.23Hz，2H)；纯度为99.9％。
实施例64-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲胺
步骤A：3-氯-6-异丙氧基哒嗪的制备
具体方法及实验数据同实施例3步骤A。
步骤B：4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]氰苯的合成
具体方法及实验数据同实施例3步骤B。
步骤C：4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲胺的合成
具体方法同实施例5中步骤B，反应物为中间体化合物4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]氰苯(1.912g，0.008mol)。经柱层析分离，洗脱剂为甲醇-石油醚(4∶1)，旋干得到黄色粘状液体，即产物4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲胺，产率为31.2％，Rf(甲醇∶石油醚＝8∶1)0.88；MS(ESI)：m/z 243([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ1.23(t，J＝14.01Hz，1H)，δ1.43(d，J＝6.16Hz，6H)，δ3.9(s，2H)，δ5.61(m，J＝24.66Hz，1H)，δ6.97(d，J＝19.21Hz，1H)，δ7.45(d，J＝8.22Hz，2H)，δ7.76(d，J＝9.23Hz，1H)，δ7.98(d，J＝8.23Hz，2H)；纯度为99.6％。
实施例74-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺
步骤A：4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]氰苯的合成
具体方法及实验数据同实施例4步骤A。
步骤B：4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺的合成
具体方法同实施例5中步骤B，反应物为中间体化合物4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺，经柱层析分离，洗脱剂为甲醇-石油醚(4∶1)，旋干得到黄色粘状液体，即产物4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺，产率为25.9％，Rf(甲醇∶石油醚＝10∶1)0.68，MS(ESI)：m/z 246([M+H]+，100％)，1H-NMR(500MHz，CDCl3)；δ3.94(s，2H)，δ3.98(s，1H)，δ4.05(s，，6H)，5.96(s，1H)，7.40(d，J＝7.25Hz，2H)，8.41(d，，J＝1.56Hz，2H)；纯度为98.9％。
实施例83-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺的盐酸盐
取3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺(1.696g，0.008mol)，溶于50ml甲醇，加入浓度为0.1mol/L的盐酸溶液80ml，磁力搅拌器充分搅拌，旋转蒸发，除去大部分甲醇，冷却析出晶体，以甲醇重结晶。得到3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺盐酸盐，产率为31％。MS(EI)：m/z213([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：2.02(s，3H)，2.27(s，3H)，2.52(s，3H)，3.72(br s，J＝2.48Hz，2H)，6.46(s，J＝1.75Hz，1H)，6.52(d，J＝7.51Hz，1H)，6.68(d，J＝10.28Hz，1H)，6.89(s，1H)，7.21(m，J＝15.48，1H)。
实施例94-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺的盐酸盐
具体方法同实施例8，产率为42％。MS(EI)：m/z 240([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ1.98(s，3H)，δ2.05(s，2H)，δ2.22(s，3H)，δ2.52(s，3H)，δ6.94(s，1H)，δ7.24(d，J＝8.17Hz，2H)，δ7.91(d，J＝8.19Hz，2H)。
实施例104-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲酰胺的盐酸盐
具体方法同实施例8，产率为47.3％；MS(ESI)：m/z 257([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：1.43(m，J＝10.51Hz，6H)，5.54(m，J＝24.61Hz，1H)，7.17(d，J＝9.26Hz，1H)，8.01(d，J＝8.58Hz，2H)，8.10(d，J＝10.20Hz，3H)。
实施例114-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺的盐酸盐
具体方法同实施例8，产率为39.2％；MS(EI)：m/z 258([M-H]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：4.11(s，7H)，5.74(br s，1H)，6.06(s，1H)，6.17(br s，1H)，7.91(d，J＝8.3Hz，2H)，8.54(d，J＝8.3Hz，2H)。
实施例124-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺的盐酸盐
具体方法同实施例8，产率为33.9％；MS(ESI)：m/z 226([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ1.25(m，J＝14.04Hz，2H)，δ2.0(s，3H)，δ2.25(s，3H，δ2.52(s，3H)，δ3.94(s，2H)，δ6.92(s，1H)，δ7.12(d，J＝8.05Hz 2H)，δ7.38(d，J＝8.23Hz，2H)。
实施例134-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲胺的盐酸盐
具体方法同实施例8，产率为41％；MS(ESI)：m/z 243([M]+，100％)；1H-NMR(500MHz，CDCl3)：δ1.23(t，J＝14.01Hz，1H)，δ1.43(d，J＝6.16Hz，6H)，δ3.9(s，2H)，δ5.61(m，J＝24.66Hz，1H)，δ6.97(d，J＝19.21Hz，1H)，δ7.45(d，J＝8.22Hz，2H)，δ7.76(d，J＝9.23Hz，1H)，δ7.98(d，J＝8.23Hz，2H)。
实施例144-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺的盐酸盐
具体方法同实施例8，产率为47％；MS(ESI)：m/z 246([M+H]+，100％)，1H-NMR(500MHz，CDCl3)；δ3.94(s，2H)，δ3.98(s，1H)，δ4.05(s，，6H)，5.96(s，1H)，7.40(d，J＝7.25Hz，2H)，8.41(d，，J＝1.56Hz，2H)。
实施例157种目标化合物的活性筛选
具体方法：密度达80～90％的人卵巢瘤细胞A2780细胞(购于中国科学研究院生物化学与细胞研究所)经抑制剂处理4小时，处理后细胞悬浮于RIPA缓冲液(100mM Tris，150mM NaCl，1％Triton，1％脱氧胆酸，0.1％SDS，1mM EDTA，and 2mM NaF)，另补加1mM钒酸钠，1mM亮抑酶肽，1mM抑肽酶，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，1mM二硫苏糖醇(DTT)，1mM胃酶抑素A，冰浴30分钟。细胞裂解液12000g离心15分钟，收集上清，使用Bio-Rad(Hercules，CA，USA)的蛋白浓度测定试剂测定蛋白浓度。将等浓度蛋白质进行SDS-PAGE电泳，并转移至硝酸纤维素膜。使用特异性抗体通过免疫杂交的方式(WesternBlot印迹法)检测目的蛋白。
WesternBlot印迹法结果(见附图说明中图1)采用复日Smartview生物电泳图像分析系统进行定量分析，评价被筛选化合物的生物活性。抑制率计算参照式I，图1中的号码与各化合物一一对应，详见表1。
表1各化合物对PI3K酶的抑制率
如上7种目标化合物和先导化合物3-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯胺、3-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯胺及PI3K酶特异性抑制剂LY294002在50μM浓度下分别能抑制93.3％，96.7％，21.4％，50.8％，-11.2％，-0.6％，9.3％，60.8％，35.4％及96.8％的PI3Ks酶活性，对应图1上的编号分别为1，2，5，6，7，8，3，4，9。
实验结果为负的化合物具有刺激性。实验结果表明，除7和8号化合物对PI3K酶反而具有刺激作用外，其他化合物均有抑制活性。且1号和2号化合物的抑制率较高，均达90％以上，与LY294002的抑制率较为相近。
实施例163-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺的药物敏感性实验
将3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺和LY294002分别用DMSO助溶，配成5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L的浓度待用。配阴性对照液，即配制与药液中相同浓度的DMSO溶液。DMSO的浓度≤0.5％。
(1)接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的人口腔表皮癌细胞KB-A-1(该细胞为美国国立健康研究院(National Institutes of Health，U.S.A.)Prof.Ira Pastan和Prof.Micheal M.Gottesman惠赠)，用含10％胎牛血清的RPMI 1604培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μl。
(2)培养细胞：将培养板放入CO2孵箱，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，待细胞贴壁后加入药液。
(3)96孔板上设加药孔，对照孔和空白孔。加药孔中加入浓度梯度的药物，每孔100μl，设4个复孔；阳性对照空中加入相应浓度的LY294002药液，设3个复孔；阴性对照孔中加入阴性对照液，设3个复孔。
(4)呈色：培养48h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸孔内培养上清液。每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使甲臜充分溶解。
(5)比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值(A)为纵轴绘制细胞生长曲线。通过Origin软件计算IC50值。判断：IC50≤150μM，结果为阳性，IC50＞150μM，结果为阴性。阳性的化合物即为有效的PI3Ks酶抑制剂。
3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺的IC50值为100.8μmol/L，LY294002的IC50值为36.7μmol/L。3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺虽与LY294002的抑制效果有一定差距，但是仍不失为一种有效的PI3K酶抑制剂。具体实验数据见图2(见附图说明)与表2。
表23-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺和LY294002的IC50值
实施例174-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺的药物敏感性实验
具体方法步骤同实施例16，4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺的IC50值为109.1μmol/L，LY294002的IC50值为37.1μmol/L。4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺虽与LY294002的抑制效果有一定差距，但是仍不失为一种有效的PI3K酶抑制剂。具体实验数据见图3(见附图说明)与表3。
表34-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺和LY294002的IC50值
实施例183-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺的细胞选择性实验
具体实验方法步骤同实施例16，实验的细胞为人口腔表皮癌细胞KB-A-1，人角质形成细胞HaCaT，人正常脐静脉内皮细胞ECV。3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺对人体正常细胞的抑制率较低，对肿瘤细胞的抑制率较高，具有不错的细胞选择性。具体实验结果见图4(见附图说明)和表4。
表43-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺在不同浓度下对不同细胞的抑制率
实施例194-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺的细胞选择性实验
具体实验方法步骤同实施例16，实验的细胞为人口腔表皮癌细胞KB-A-1，人角质形成细胞HaCaT，人正常脐静脉内皮细胞ECV。实验数据表明4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺对人体正常细胞和肿瘤细胞的选择性不高。具体实验结果见图5(见附图说明)和表5。
表54-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺在不同浓度下对不同细胞的抑制率
实施例203-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺与LY294002的细胞选择性对比实验结果
具体实验方法步骤同实施例16，实验细胞为人口腔表皮癌细胞KB-A-1，人角质形成细胞HaCaT。实验证明，3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺对细胞的选择性要优于LY294002。具体实验数据见图6(见附图说明)和6。
表63-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺与ly294002的细胞选择性对比实验结果
实施例214-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺与LY294002的细胞选择性对比实验结果
具体实验方法步骤同实施例16，实验细胞为人口腔表皮癌细胞KB-A-1，人角质形成细胞HaCaT。实验数据表明，4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺与LY294002对细胞的选择性相仿，具体实验数据见图7(见附图说明)和表7。
表74-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺与ly294002的细胞选择性对比实验结果
Claims (10)
1、通式I、II、III的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：-R1为-NH2，-CH2NH2或-CONH2；
-R2，-R3，-R4为-CH3或者-OCH3或者-OCH(CH3)2。
2、根据权利要求1所说的通式I、II、III所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，
为
3、根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，通式I、II、III所示的化合物为5-(3-氨基苯)烟酸甲酯类似物。
4、根据权利要求1～3中任一所述的化合物或其药学上可接受的盐，作为制备PI3K酶抑制剂的应用，其特征在于，所说的盐包括无机酸盐、有机酸盐或氨基酸盐；具体包括氢嗅酸盐、氢碘酸盐、盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、乙酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、天冬氨酸盐或谷氨酸盐。
5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于：化合物或其药学上可接受的盐为以下列举中的任一：3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺或其药学上可接受的盐、4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺或其药学上可接受的盐、4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(6-异丙氧基哒嗪)]苯甲酰胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于：最优化的化合物或其药学上可接受的盐为3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺或其药学上可接受的盐。
7、根据权利要求4-6中任一所述的应用，其特征在于PI3K酶抑制剂的细胞选择性优于LY294002。
8、根据权利要求1～3中任一所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗PI3K酶活性过高导致的疾病的药物中的应用。
9、根据权利要求8所述的应用，所述的PI3K酶活性过高导致的疾病包括炎症、血栓、自身免疫性疾病、心血管疾病和肿瘤病；具体包括急性胰腺炎，慢性肠道炎，支气管哮喘；急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、瓣膜病、心房颤动；糖尿病，类风湿关节炎，慢性甲状腺炎；动脉粥样硬化、高血压；乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和淋巴瘤。
10、根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：最优化的化合物或其药学上可接受的盐为3-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺或其药学上可接受的盐、4-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺或其药学上可接受的盐。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081231 |