CN112924448B - 一种利用盐析法检测真蛋白含量的测定方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过盐析法检测真蛋白含量的测定方法,包括:1)称取样品置于容器中,加适量水,加热至沸腾后转为80℃水浴30min;2)从水浴中取出后即刻缓慢加入氢氧化钠,再加入硫酸铜,静置陈化得试液;3)将静置后的试液过滤,洗涤沉淀物数次;4)将沉淀物和滤纸充分干燥后,放入定氮消管内先加入15mL硫酸,静置,缓慢加热预消解后取下冷却,然后再次加入硫酸、无水硫酸钠、硫酸铜加热到420℃消解至澄清,获得待测试样;5)将上述待测试样用凯氏定氮法进行氮的测定,即得出样品中真蛋白含量。本发明确定了利用盐析法检测饲料或乳制品中真蛋白含量结果更加准确,提升了测定结果的重复性、稳定性。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域,涉及一种改进的盐析法测定饲料或乳制品中真蛋白含量的测定地及其应用。
背景技术
蛋白质的含量是评价饲料、乳制品营养价值的主要指标之一,是饲料、乳制品质量的关键控制因素,目前评判蛋白质含量高低一般采用粗蛋白来表示,粗蛋白通常是采用国家标准方法凯氏定氮法通过测定饲料、乳制品中的总氮含量计算而得到的蛋白质含量,而总氮含量包括了蛋白态的氮和非蛋白态的氮,真蛋白就是根据蛋白态的氮计算所得到的蛋白质的含量。中国标准出版社于2001出版的“中国农业标准汇编饲料卷”中也提到了测定饲料中粗蛋白的标准方法,但是国家标准中的粗蛋白实质上包括了真蛋白质和非蛋白类物质,与真实蛋白质含量有一定偏差,而只有真蛋白含量的高低才能客观反映饲料、乳制品营养价值的高低。这种评价标准的缺陷为一些不法商贩提供了可乘之机,致使饲料原料、乳制品中掺假行为时有发生。王俊峰于2004年发表的“饲料中真蛋质含量的测定方法”(《广东饲料》第十三卷第六期2004年12月)以及王文芹等于2005年发表的文章“真蛋白质含量的测定”(《发酵科技通讯》第34卷第1期2005年1月)以及均提出了测定真蛋白含量的方法,但这些方法由于缺少操作规范,许多操作步骤和条件均有较大波动,致使对真蛋白的测定结果准确性和重复性很差,因此,如何对真蛋白的测定方法的操作步骤进一步优化,提高其重复性和准确性是当前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于针对当前真蛋白含量测定方法缺少详细的操作规范,致使测定结果准确性和重复性差的问题,提供一种更为细化、精准的利用盐析法检测饲料或乳制品中真蛋白含量的检测方法。
本发明所述的技术问题可通过以下技术方案得以解决:
一种通过盐析法检测真蛋白含量的测定方法,包括:
1)准确称取样品0.5-2g置于容器中,加适量水,加热至沸后,放入80℃的水浴锅中水浴30min;
2)从水浴锅中取出后立即先缓慢加入氢氧化钠溶液,再加入硫酸铜溶液,边加边搅拌,静置陈化2h以上,得试液;所述氢氧化钠溶液浓度为1.25-2.5%;所述硫酸铜溶液浓度为6-10%;所述氢氧化钠溶液与硫酸铜溶液的体积比为1:1;优选地,添加量分别为15-20mL;
3)将静置后的所述试液以双层定性滤纸过滤,以热水洗涤沉淀数次;
4)将过滤洗涤后的沉淀物和滤纸一起充分干燥,然后通过预消解、消解获得待测样;
5)将所述待测样以凯氏定氮法进行氮的测定,即得样品中真蛋白含量。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤1)中样品量为0.5-1g。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤1)中以g:mL计,样品质量与水的加入量的比例为1:100-25。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤1)中加热至沸后,于80℃的水浴锅中水浴30分钟。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤2)中先缓慢加入1.25%氢氧化钠20mL,再加入6%硫酸铜溶液20mL,边加边搅拌,静置陈化2-4h。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤3)中以80-90℃的热水洗涤沉淀6至7次。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤3)中洗涤沉淀直至以5%氯化钡溶液数滴检查滤液时不生成白色硫酸钡沉淀。
在根据本发明的一个实施方案中,步骤4)中的消化步骤是通过包括下述步骤的方法实现的:先加入15mL浓硫酸,静置1小时,然后慢慢升温至100℃左右,进行预消解,1小时后取下冷却,再加无水硫酸钠3g,无水硫酸铜0.3g,浓硫酸5mL,置于消解炉上继续升温到420℃消解至溶液澄清。
在根据本发明的一个实施方案中,所述样品为饲料或乳制品。
本发明的另一方面提供了上述的利用盐析法检测真蛋白的测定方法在检测饲料或乳制品中的应用。
本发明的有益效果在于:
本发明提供的盐析法检测方法通过对加热方式、加入硫酸铜和氢氧化钠的浓度、体积、速度、消解等过程的控制、沉淀时间等重要环节进行细化优化,通过分析各个环节给实验结果带来的影响,确定了利用盐析法检测饲料或乳制品中真蛋白测定的最佳实验条件,使对于饲料或乳制品中真蛋白含量的测定结果更加准确,提升了测定结果的重复性、稳定性,对提高食品行业、饲料行业真蛋白的检测能力具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明,但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。
原理
蛋白质在碱性条件下能与硫酸铜发生盐析作用而析出沉淀,该沉淀物不溶于热水。而非蛋白氮类物质易溶于热水,用热水洗涤沉淀,将水溶性含氮物质洗去,剩下的沉淀物质再用凯氏定氮法测定即可得出饲料、乳制品真蛋白质的含量。
主要仪器设备半自动凯氏定氮仪、消解仪、台式粉碎机、分析天平、水浴锅、干燥箱、调温电炉、烧杯、锥形瓶、酸式滴定管、玻璃棒、玻璃漏斗、中速定量滤纸等等。
试剂
硫酸、氢氧化钠、无水硫酸钠、硫酸铜、硼酸、0.1N盐酸标准溶液、氯化钡、甲基红、溴甲酚绿,基准无水碳酸钠。
以上试剂无特殊说明均为分析纯,试液无特殊说明均为水溶液。
供试材料
1)选取含蛋白质量不同水平的供试样品7个:
蛋白粉、全脂奶粉、鲜牛奶、进口鱼粉、豆粕、菌体蛋白、肉骨粉。
2)掺杂物:
羽毛粉、尿素、硫酸铵、三聚氰胺。
3)标准物质:
奶粉中蛋白质标准物质:30g/瓶,标准值:17.44%。北京普天同创生物科技有限公司生产。
实施例1试验方法及步骤
1)准确称取试样0.5g左右(精确至0.0001g)置于200mL烧杯中,加50mL水,加热至沸后,放入80℃的水浴锅中水浴30分钟。
2)从水浴锅中取出烧杯,立即用移液管向烧杯中先缓慢加入1.25%氢氧化钠20mL,再加入6%硫酸铜溶液20mL,边加边搅拌,静置陈化2h。
3)静置后的试液用双层定性滤纸过滤,用80-90℃的热水洗涤沉淀6至7次,用5%氯化钡溶液数滴检查滤液,至不生成白色硫酸钡沉淀为止。
4)将过滤洗涤后的沉淀物和滤纸一起放在80℃烘箱中充分干燥约2小时,然后全部转移到消化管中,先加入15mL浓硫酸,静置1小时,然后慢慢升温至100℃左右,进行预消解,1小时后取下冷却,再加无水硫酸钠3g,无水硫酸铜0.3g,浓硫酸5mL,置于消解炉上继续升温到420℃消解至溶液澄清。
5)按凯氏定氮法进行氮的测定,同时做空白试验。
实施例2不同试验条件对试验结果的影响
1、称样量对测定结果的影响(以鱼粉和菌体蛋白为供试品)。
表1称样量对结果的影响
从表1可以看出,试样质量在0.5g-2g之间两种试样的测试结果均在允许相对偏差范围内,说明试样称样量在0.5g-2g之间对测试结果影响不大。考虑到洗涤、消解、滴定消耗的盐酸体积等因素,试样质量为0.5g-1g比较合适。
2、加热方式对测定结果的影响(以鱼粉和菌体蛋白、标准物质为供试品)。
在试样前处理中,样品煮沸后保持微状态30分钟,目的是使试样中的非蛋白类物质充分溶解于水中。在实际操作中发现称样后加入的50mL水,在样品煮沸后保持微沸状态30分钟后,几乎蒸干,试样容易粘在烧杯壁上,这就需要在微沸过挰中不断加入水,为了解决这一问题,本试验在其它条件不变的情况下,先把样品用调温电炉煮沸,再用水浴锅水浴,并选出三个不同的水浴温度对试样进行处理,结果如下:
表2加热方式对结果的影响
从表2可以看出,三个不同水浴温度段处理样品的测试结果与电炉微沸状态下处理样品的测试结果有差异,原因在于:样品在煮沸处理时,有一部分样品会粘附在烧杯壁上,在洗涤转移时会造成少许样品的损失,且重现性差。不同水浴温度处理的样品,从测定结果中可以看出在50℃时偏低,主要原因是在温度较低时,蛋白质没有完全析出。80℃、100℃时测定数据比较稳定,说明温度越高,蛋白质析出的越完全,从安全及节能因素考虑,选定试样在电炉上煮沸后转移到80℃水浴锅中水浴30分钟最为合适。
3、硫酸铜与氢氧化钠浓度、用量对测定结果的影响(以奶粉中蛋白质标准物质为供试品)。
首先取4组不同浓度、不同体积的硫酸铜和氢氧化钠进行交叉试验。
表3硫酸铜和氢氧化钠的浓度、体积对测试结果的影响
硫酸铜在试验中为蛋白质变性提供重金属离子,氢氧化钠一方面有助于鱼粉中的蛋白质溶出,另一方面是为蛋白质变性提供碱性环境。从表3看出,硫酸铜和氢氧化钠的用量及浓度都减少时测得结果明显偏低,而其它三种情况测得的结果相差甚微,从节约试剂考虑,选择硫酸铜浓度为6%,氢氧化钠浓度为1.25%,用量都是20ml。
4、静置陈化时间对测定结果的影响(以进口鱼粉为供试材料)。
加入沉淀剂后的试样,必须经过陈化,让试样中的真蛋白质充分盐析。
表4陈化时间对测定结果的影响
从表4可以看出,静置时间不足2小时情况下,静置时间越短,测试结果越低,说明蛋白质盐析没有充分完成;静置时间2小时以上后,测试结果趋于稳定。考虑到试验的高效性,静置时间选用2小时即可。
实施例3验证试验
在向标准物质中人为添加非蛋白氮类物质条件下测定其真蛋白的含量,以验证方法的可靠性和可行性。
表5添加掺杂物试验结果
从表5中可以看出,在标准物质中人为加入非蛋白氮类物质,其粗蛋白含量明显增加,这是不法商贩掺假的主要手段。尿素、硫酸铵、三聚氰胺易溶于水,所以其真蛋白测定结果与标准物质的含量接近,而羽毛粉的含量相对偏高,原因是粉碎不细的羽毛粉,难溶于水,清洗过滤就不彻底,但从相对偏差来看,在允许范围内。因此,本方法适合于添加了非蛋白蛋类产品的测定,掺杂物不会影响真蛋白的测定结果。
实施例4方法的精密度及准确度
1、精密度验证
用上述优化后的测试条件,对奶粉蛋白质标准物质(真蛋白含量17.44%)进行6次处理、测定,其结果如下:
表6精密度试验
2、准确度验证(加标回收率)
在鱼粉中添加蛋白质标准物质,进行加标回收率试验,以验证方法的准确度。
表7加标回收率试验
由表6、表7可以看出,蛋白质标准物质测试的相对偏差为2.58%,加标回收率在96.84%-103.11%,均在允许范围内。由此可见,改进和优化后的测定方法完全适合于饲料、乳制品类物质真蛋白的测定。
3、适用性试验
为了验证优化改进后的试验方法对不同种类物质真蛋白测定的适用性,选取了蛋白粉、全脂奶粉、鲜牛奶、进品鱼粉、豆粕、菌体蛋白、肉骨粉,按照国标GB/T6432粗蛋白的测定方法和改进及优化后真蛋白的测定方法,分别对其进行粗蛋白、真蛋白的测定,结果如表8所示:
表8不同种类物质粗蛋白、真蛋白的测定结果
从表8可以看出,菌体蛋白、肉骨粉其真蛋白的比率均≤80%,有掺假的嫌疑,蛋白粉、进口鱼粉、豆粕、乳制品中的全脂奶粉、鲜牛奶真蛋白的比率≥80%,质量较为可靠。
4、对比试验
对盐析法测定真蛋白的试验过程及条件进行了一系列的细化优化,为了验证改良后的试验方法的可行性,和改良前的试验方法进行了对比试验,结果如下:
表9优化试验条件前后进口鱼粉真蛋白的测定结果
表10优化试验条件前后不同种类的样品真蛋白的测定结果
从表9表10测定结果中可以看出,优化前的测定数据普遍偏低,而且数据极不稳定,主要原因是测定过程中样品的沉化、析出、洗涤、消解等环节不好把握,导致样品有所损失。根据方法优化前后测试数据的t-检验也可以看出,两组数据的变化的趋势整体一致,但具有显著性的差异,从而证明优化方法对测试结果准确性的显著提高。
5、结论
对真蛋白测定方法的探索过程中,在原盐析法测定真蛋白方法的基础上,进行了大量的重复试验、交叉试验,通过多次的失败,反复的摸索,最终探讨出适合真蛋白测定的方法。试验表明,改进和优化后测定真蛋白的方法,适用于饲料、乳制品等真蛋白的测定,并能排除人为因素添加的羽毛粉、尿素、硫酸铵、三聚氰胺等非蛋白氮物质的干扰。方法的准确性和精密度有了很大的提高,为进一步建立标准的真蛋白检测方法提供了可靠依据。
上述实施例仅供说明本发明之用,而并非是对本发明专利的限制;应当指出的是,对于本领域的普通技术人员,在不脱离本发明构思范围的情况下,还可以作出各种变化和变型,这些都属于本发明的保护范围;因此,凡跟本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰,均应属于本发明权利要求的覆盖范围。
Claims (8)
1.一种利用盐析法检测真蛋白含量的测定方法,其特征在于,包括:
1)准确称取样品0.5-1g置于容器中,加适量水,将样品在电炉上煮沸后放入80℃的水浴锅中水浴30min;
2)从水浴锅中取出后即刻缓慢加入氢氧化钠溶液,再加入硫酸铜溶液,边加边搅拌,静置陈化2h,得试液;所述氢氧化钠溶液浓度为1.25%;所述硫酸铜溶液浓度为6%;所述氢氧化钠溶液与硫酸铜溶液的体积比为1:1;所述氢氧化钠溶液与硫酸铜溶液的添加量分别为15-20mL;
3)将静置后的所述试液以双层定性滤纸过滤,以热水洗涤沉淀数次;
4)将过滤洗涤后的沉淀物和滤纸一起充分干燥后,放入定氮消管内先加入15mL硫酸,静置后缓慢加热至100℃,进行预消解;取下冷却后再次加入硫酸、无水硫酸钠、硫酸铜加热到420℃消解至溶液澄清,获得待测试样;
5)将上述待测试样以凯氏定氮法进行氮的测定,即得到样品中真蛋白含量。
2.如权利要求1所述的测定方法,其特征在于,步骤1)中以g:mL计,样品质量与水的加入量的比例为1:100-25。
3.如权利要求1所述的测定方法,其特征在于,步骤2)中先缓慢加入1.25%氢氧化钠20mL,再加入6%硫酸铜溶液20mL,边加边搅拌,静置陈化2h。
4.如权利要求1所述的测定方法,其特征在于,步骤3)中以80-90℃的热水洗涤沉淀6至7次。
5.如权利要求1所述的测定方法,其特征在于,步骤3)中洗涤沉淀直至以5%氯化钡溶液数滴检查滤液时不生成白色硫酸钡沉淀。
6.如权利要求1所述的测定方法,其特征在于,步骤4)中的消化步骤是通过包括下述步骤的方法实现的:
先加入15mL浓硫酸,静置1小时,然后慢慢升温至100℃,进行预消解,1小时后取下冷却,再加无水硫酸钠3g,无水硫酸铜0.3g,浓硫酸5mL,置于消解炉上继续升温到420℃消解至溶液澄清。
7.如权利要求1-6中任一项所述的测定方法,其特征在于,所述样品为饲料或乳制品。
8.如权利要求1-7所述的利用盐析法检测真蛋白含量的测定方法在检测饲料或乳制品中的应用。
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