CN112852826B

CN112852826B - 猪α环形转录本αCT基因及应用

Info

Publication number: CN112852826B
Application number: CN202110206755.7A
Authority: CN
Inventors: 刘光亮; 刘果; 王彬
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-06-04
Filing date: 2019-06-04
Publication date: 2023-05-19
Anticipated expiration: 2039-06-04
Also published as: CN110128524A; CN112961863A; CN110128524B; CN112852826A; CN112961863B

Abstract

本发明公开猪α环形转录本αCT基因及应用，其序列为SEQ ID No.11。本发明所述的检测方法是将从将待检猪的淋巴组织样品中提取RNA反转录，再以所得到的cDNA为待检模板，用本发明公开的引物序列SEQ ID No.1至SEQ IDNo.7进行扩增，根据扩增产物的核酸电泳图中是否出现特定条带对照DNA分子量标准确定待检猪待检IgA⁺B细胞类别转换重组情况。本发明可在制备用于评价猪IgA黏膜免疫活化情况的试剂中的应用。

Description

猪α环形转录本αCT基因及应用

技术领域

本发明涉及一种猪IgA⁺B细胞类别转换重组的标志物序列，以及猪IgA⁺B细胞类别转换重组的检测方法。

背景技术

IgA⁺B细胞类别转换重组三种关键产物是指B细胞在IgA类别转换重组过程中所产生的转录产物：α胚系转录本(αgerm-line transcripts,αGLT)，即IαCα；IgA类别转换后转录本α(Post-switchtranscriptsα,PSTα)，即IμCα和α环形转录本(αcircle transcripts,αCT)，即IαCμ。

黏膜免疫应答，尤其是分泌型免疫球蛋白A(sIgA)对于抵抗病原感染，维持机体健康及微生态平衡具有至关重要的作用。肠道黏膜是人和动物体最大的黏膜组织，肠道派伊尔集合淋巴结(Peyer’s patches,PP结)是由小肠黏膜淋巴组织有序集合而成，是肠道黏膜免疫发生及IgA抗体产生的主要部位。肠系膜淋巴结(MLN)也是肠道重要的免疫组织，对于维持肠道免疫应答有重要作用。

B细胞经抗原刺激后，需要经过抗体类别转换重组(CSR)和亲和力成熟(SHM)两个重要过程才能形成高亲和力IgA⁺B细胞。在IgA类别转换重组(IgA CSR)过程中，编码免疫球蛋白(Ig)的重链恒定区的外显子由编码IgM的Cμ转变为编码IgA的Cα，而结合抗原的可变区保持恒定。IgA抗体类别转换重组起始于一种可诱导的非编码α胚系转录本(αGLT)-IαCα的产生，在细胞内高表达的激活诱导的胞苷脱氨酶(AICDA,AID)的作用下，基因组Sμ和Sα转换区DNA分别双股断裂，经过断端修复与连接，使原来间隔于Sμ和Sα的DNA序列被切除，形成一个环形产物，由于其上面有启动子(Iα)，在降解前短暂编码α环形转录本(αCT)-IαCμ；而两个远端转换区序列连接在一起，形成最终的转换重组产物，编码IgA类别转换后转录本α(PSTα)-IμCα，使B细胞由起初表达的IgM抗体变为表达IgA抗体。这个过程中，αGLT、PSTα，尤其是αCT是体内外类别转换重组的最直接证据。

目前，黏膜免疫研究多以小鼠为模型，这三种转录产物早已成熟应用于体内外评价IgA⁺B细胞类别转换重组。但是，猪的黏膜免疫研究甚少，猪IgA⁺B细胞类别转换重组的研究目前仍为空白，研究工具的匮乏很大程度上阻碍了猪黏膜免疫学发展。猪不仅是一种重要的经济动物；也能够作为大动物模型，弥补传统实验动物模型如小鼠、大鼠和兔等小动物的不足，应用于科学研究中。发展和完善研究工具、研究方法对于猪黏膜免疫学的发展进步至关重要。猪αGLT、PSTα，尤其是αCT的检测作为体内外IgA⁺B细胞类别转换重组的最直接证据，对于评价猪黏膜免疫应答具有十分重要意义。该方法可用作病原感染、疫苗免疫和各类因子、佐剂对IgA⁺B细胞分化和黏膜免疫应答活化情况的评价指标。为发掘和选择有效的黏膜免疫佐剂、疫苗和免疫策略提供依据。

发明目的

本发明提供一种可作为检测猪IgA黏膜免疫应答活化情况的标志物，以及检测的方法和可能的用途。

本发明的猪IgA黏膜免疫应答活化情况的标志物为：

1)猪α胚系转录本αGLT，其基因序列为SEQ ID No.8；

2)猪IgA类别转换后转录本α短序列PSTα-1，其基因序列为SEQ ID No.9；

3)猪IgA类别转换后转录本α长序列PSTα-2，其基因序列为SEQ ID No.10；

4)猪α环形转录本αCT，其基因序列为SEQ ID No.11。

本发明的猪IgA类别转换重组的检测方法是从待检猪的淋巴组织样品中提取RNA并反转录，再以所得到的cDNA为待检模板，用引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7进行扩增，根据扩增产物的核酸电泳图中是否出现特定条带对照DNA分子量标准确定待检猪待检IgA⁺B细胞类别转换重组情况。

引物序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或/和SEQ ID No.7可用于猪IgA类别转换重组的检测。

本发明所述的任一标志物序列可在制备用于检测猪IgA黏膜免疫活化情况的试剂中的应用。

本发明所公开的引物序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7中任一个或其任意的组合可在制备用于评价猪IgA黏膜免疫活化情况的试剂中的应用。

附图说明

图1：猪派伊尔集合淋巴结αGLT、PSTα和αCT扩增结果(电泳图)；

图2：猪肠系膜淋巴结αGLT、PSTα和αCT扩增结果(电泳图)；

图3：猪αGLT、PSTα和αCT序列结构图；

图4：猪αGLT、PSTα和αCT扩增方法批内重复检测结果(电泳图)；

图5：猪αGLT、PSTα和αCT扩增方法批间重复检测结果(电泳图)。

具体实施方式

以下结合具体实例和附图说明对本发明做进一步说明

本发明的猪IgA类别转换重组的PCR检测方法是先将待检猪的淋巴组织样品通过Trizol法或RNA提取试剂盒提取RNA，取2μg RNA加入1μL反转录引物Oligo(dT)于65℃水浴锅中孵育5分钟，取出后于冰浴中静置2分钟，之后将混合物加入含有反转录酶、dNTP、RNA酶抑制剂和反应缓冲液的预混体系，于42℃水浴锅中反转录1小时，70℃加热5分钟使反转录酶失活。以所得到的cDNA为待检模板，用本专利提供的引物和反应条件进行扩增，扩增产物以浓度1.5％的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，根据扩增产物的核酸电泳图中是否出现特定条带对照DNA分子量标准确定待检猪样品中αGLT、PSTα和αCT表达状况。

实施例1.α胚系转录本，α环形转录本和转换后转录本αPCR引物的设计与合成。

利用已知的猪抗体重链区基因组序列(登录号：AB699686和AB699687)和已发表的相关文献，预测基因组上编码IgM和IgA的重链恒定区(Cμ和Cα)前的启动子区Iμ和Iα所在位置。并分别在Iμ预测序列上设计引物PF，Iα预测序列上设计引物GF和CF1，在Cμ序列上设计引物CR1和CR2，在Cα序列上设计引物GR和PF。所设计引物由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。七条引物序列和对应的序列编号分别为：

实施例2.反应条件的确定

首先，设置不同的退火温度(54℃-65℃)扩增，筛选αGLT和PSTα扩增的最适退火温度，通过优化筛选最终确定αGLT和PSTα的最佳退火温度分别为58℃-61℃和61℃-64℃。

对于αCT，首先设置不同的退火温度(54℃-58℃)进行第一轮扩增，用第一轮的产物作为模板，设置不同的退火温度(60℃-65℃)进行第二轮PCR扩增，筛选两轮PCR的最佳退火温度。通过优化筛选最终确定第一、二轮PCR的最佳退火温度分别为54℃-56℃和58℃-61℃。

以最佳退火温度扩增PP结和肠系膜淋巴结中αGLT、PSTα和αCT，结果分别如图1和图2所示。

实施例3.PCR扩增产物的测序。

将3μL的PCR产物与1μL p-LB-Simple vector载体混合，在T4 DNA连接酶及连接缓冲液的作用下，室温连接5分钟。将反应后混合物转化至DH5α感受态细胞中，挑选阳性克隆，提取重组质粒送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序。结果显示αGLT产物长度为242bp，其中含有Iα区111bp，Cα区131bp；PSTα有两个产物，分别为251bp和515bp，其中分别含Iμ区146bp和410bp，Cα区105bp；αCT产物长度为359bp，其中含有Iα区271bp，Cμ区88bp。三种产物结构示意图如图3所示，测序结果如下：

α胚系转录本(αgerm-line transcripts,αGLT)，即IαCα。

SEQ ID NO.8：

ACTCCAGCTCCTATGCAGCGGCTGGGCAGATGGACCTGCGGTGTGGGGCCACAAGGCCCGAGAGGCCTGGGCCTCTCCCAGCCACCGTGGACCCTCTGGCAGCTTGAGCAGTGTCTGAAACCAGCCCCAAAATCTTCCCACTGACTCTGGGGAGCAGCGAGCCTGCCGGATATGTGGTCATCGCCTGCCTGGTCCGGGACTTCTTCCCGTCAGAGCCCCTGACAGTAACCTGGAGCCCTAGT。

IgA类别转换后转录本α短序列(Post-switchtranscriptsα,PSTα)，即IμCα-1。

SEQ ID NO.9：

GCACGATTTTCAGTTGGCCCGCTTCCCCTCGTGATTAGGACAGACGCGGGCACTCTGGCCCAGCCGTCTTGGCTCAGTATCTGCAGGCGTCCGTCTCGGGACGGAGCTCAGGGGAAGAGCGTGACTCCAGTTGAACGTGATAGTCGTGTCTGAAACCAGCCCCAAAATCTTCCCACTGACTCTGGGGAGCAGCGAGCCTGCCGGATATGTGGTCATCGCCTGCCTGGTCCGGGACTTCTTCCCGTCAGAGC。

IgA类别转换后转录本α长序列(Post-switchtranscriptsα,PSTα-2)，即IμCα。

SEQ ID NO.10：

GCACGATTTTCAGTTGGCCCGCTTCCCCTCGTGATTAGGACAGACGCGGGCACTCTGGCCCAGCCGTCTTGGCTCAGTATCTGCAGGCGTCCGTCTCGGGACGGAGCTCAGGGGAAGAGCGTGACTCCAGTTGAACGTGATAGTCGGTGCGTTGAGAGGAGACCCAGTCGGGTGTCGAGTCAGAAGGGGCCCGGGGCCCGAGGCCCTGGGCAGGACGGCCCGTGCCCTGCATCACGGGCCCAGCGTCCTAGAGGCAGGACTCTGGTGGAGAGTGTGAGGGTGCCTGGGGCCCCTCCGGAGCTGGGGCCGTGCGGTGCAGGTTGGGCTCTCGGCGCGGTGTTGGCTGTTTCTGCGGGATTTGGAGGAATTCTTCCAGTGATGGGAGTCGCCAGTGACCGGGCACCAGGCTGTGTCTGAAACCAGCCCCAAAATCTTCCCACTGACTCTGGGGAGCAGCGAGCCTGCCGGATATGTGGTCATCGCCTGCCTGGTCCGGGACTTCTTCCCGTCAGAGC。

α环形转录本(αcircle transcripts,αCT)，即IαCμ。

SEQ ID No.11：

ACTCCAGCTCCTATGCAGCGGCTGGGCAGATGGACCTGCGGTGTGGGGCCACAAGGCCCGAGAGGCCTGGGCCTCTCCCAGCCACCGTGGACCCTCTGGCAGCTTGAGCAGGTGGGTCCCAGAGGCTGCTCAGGCCTCAGCTCCTGCACAGCCAGGCCACACCGGGGCCTCCTGGGCTGGAAGCATGGAAGGAAGGCAGGTACCAAAACAAGGAGGAGGAGAAGGAGGAAGGAGGGGCCCTCTAGCCCCGAGGACCGAGGGCAGGATGAACCCAGAACATCCAGGACTTCCCGTCCGTCCTGAGAGGCGGCAAGTACTTGGCCTCCTCCCGGGTGCTCCTACCCTCTGTGAGCATCCCC。

实施例4.重复性验证

用已确定的方法检测检测PP结αGLT、PSTα和αCT，批内重复性检测为一个样品做3个重复检测，结果如图4所示；批间重复性检测为分三次对样品进行检测，结果如图5所示；表明该检测方法的重复性良好。

本发明提供的基于PCR技术检测猪IgA类别转换标志物的方法，可作为猪IgA⁺B细胞分化及黏膜免疫应答活化情况的评价。本技术完善了猪IgA黏膜免疫应答的评价方法，对猪黏膜免疫学的发展有重要意义。此外，本技术还为评价病原体及疫苗，尤其是黏膜免疫疫苗、佐剂等对机体IgA黏膜免疫应答活化情况提供了可靠方法，从而为发掘和选择有效的黏膜免疫佐剂、疫苗和免疫方法提供科学依据。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 猪α环形转录本αCT基因及应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 (GF)

<400> 1

actccagctc ctatgcagcg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列 (GR)

<400> 2

actagggctc caggttactg t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 (PF)

<400> 3

gcacgatttt cagttggccc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 (PR)

<400> 4

gctctgacgg gaagaagtcc 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列 (CF1)

<400> 5

ctgaggccgc accaccag 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 (CR1)

<400> 6

agatggacac ggacttggtg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列 (CR2)

<400> 7

ggggatgctc acagagggta 20

<210> 8

<211> 242

<212> DNA

<213> α胚系转录本( αGLT)

<400> 8

actccagctc ctatgcagcg gctgggcaga tggacctgcg gtgtggggcc acaaggcccg 60

agaggcctgg gcctctccca gccaccgtgg accctctggc agcttgagca gtgtctgaaa 120

ccagccccaa aatcttccca ctgactctgg ggagcagcga gcctgccgga tatgtggtca 180

tcgcctgcct ggtccgggac ttcttcccgt cagagcccct gacagtaacc tggagcccta 240

gt 242

<210> 9

<211> 251

<212> DNA

<213> IgA类别转换后转录本α短序列( PSTα-1)

<400> 9

gcacgatttt cagttggccc gcttcccctc gtgattagga cagacgcggg cactctggcc 60

cagccgtctt ggctcagtat ctgcaggcgt ccgtctcggg acggagctca ggggaagagc 120

gtgactccag ttgaacgtga tagtcgtgtc tgaaaccagc cccaaaatct tcccactgac 180

tctggggagc agcgagcctg ccggatatgt ggtcatcgcc tgcctggtcc gggacttctt 240

cccgtcagag c 251

<210> 10

<211> 515

<212> DNA

<213> IgA类别转换后转录本α长序列( PSTα-2)

<400> 10

gcacgatttt cagttggccc gcttcccctc gtgattagga cagacgcggg cactctggcc 60

cagccgtctt ggctcagtat ctgcaggcgt ccgtctcggg acggagctca ggggaagagc 120

gtgactccag ttgaacgtga tagtcggtgc gttgagagga gacccagtcg ggtgtcgagt 180

cagaaggggc ccggggcccg aggccctggg caggacggcc cgtgccctgc atcacgggcc 240

cagcgtccta gaggcaggac tctggtggag agtgtgaggg tgcctggggc ccctccggag 300

ctggggccgt gcggtgcagg ttgggctctc ggcgcggtgt tggctgtttc tgcgggattt 360

ggaggaattc ttccagtgat gggagtcgcc agtgaccggg caccaggctg tgtctgaaac 420

cagccccaaa atcttcccac tgactctggg gagcagcgag cctgccggat atgtggtcat 480

cgcctgcctg gtccgggact tcttcccgtc agagc 515

<210> 11

<211> 359

<212> DNA

<213> α环形转录本(αCT)

<400> 11

actccagctc ctatgcagcg gctgggcaga tggacctgcg gtgtggggcc acaaggcccg 60

agaggcctgg gcctctccca gccaccgtgg accctctggc agcttgagca ggtgggtccc 120

agaggctgct caggcctcag ctcctgcaca gccaggccac accggggcct cctgggctgg 180

aagcatggaa ggaaggcagg taccaaaaca aggaggagga gaaggaggaa ggaggggccc 240

tctagccccg aggaccgagg gcaggatgaa cccagaacat ccaggacttc ccgtccgtcc 300

tgagaggcgg caagtacttg gcctcctccc gggtgctcct accctctgtg agcatcccc 359

Claims

1.猪α环形转录本αCT，其核苷酸序列为SEQ ID No.11。

2.权利要求1所述的猪α环形转录本αCT在制备用于检测猪黏膜免疫的试剂中的应用。

3.用于猪IgA类别转换重组检测的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQID No.1、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。

4.核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物在制备用于检测猪黏膜免疫的试剂中的应用。