CN112852704A - 一种黑皮鸡枞菌多糖orp-1在肠道菌的增殖及黏附中的应用 - Google Patents

一种黑皮鸡枞菌多糖orp-1在肠道菌的增殖及黏附中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黑皮鸡枞菌多糖ORP‑1在肠道菌的增殖及黏附中的应用，以所述黑皮鸡枞菌多糖ORP‑1制备肠道菌群调节剂。本发明通过体外实验探讨黑皮鸡枞菌多糖ORP‑1对肠道益生菌和肠道条件性病原菌的增殖、黏附的影响，同时利用Caco‑2细胞体外模拟建立经D‑gal诱导的小肠上皮细胞衰老模型，将双歧杆菌BB、嗜酸乳杆菌LA及大肠杆菌EC分别与Caco‑2细胞以及经D‑gal诱导的Caco‑2细胞共培养。结果发现，黑皮鸡枞菌多糖ORP‑1可以促进双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的增殖及在D‑gal诱导的Caco‑2细胞上黏附与定植，抑制肠道条件性病原菌大肠杆菌EC的增殖及在在D‑gal诱导的Caco‑2细胞上黏附与定植。

Description

一种黑皮鸡枞菌多糖ORP-1在肠道菌的增殖及黏附中的应用
技术领域
本发明属于肠道菌群调节剂技术领域，具体涉及一种黑皮鸡枞菌多糖ORP-1在肠道菌的增殖及黏附中的应用。
技术背景
益生菌是人体肠道内正常的生理性有益菌，双歧杆菌和嗜酸乳杆菌作为肠道内主要的益生菌，是通过在肠道内的黏附定植发挥益生作用。益生菌对肠道上皮细胞的黏附作用有利于其在肠道定植，从而恢复或增强肠道稳态，提高机体免疫力。而大肠杆菌作为人体肠道内条件性病原菌，异常时，大肠杆菌等条件性病原菌会大量增殖，损害肠道粘膜从而引发一些炎症，打破肠道稳态从而造成肠道紊乱。本发明通过间接和直接测定法来评价益生菌和条件性病原菌的黏附。间接测定法是指通过检测益生菌和条件性病原菌细胞壁的物理化学性质来推测黏附能力，比如疏水性、自聚集能力等。直接测定法是利用Caco-2细胞体外模拟建立经D-gal诱导的小肠上皮细胞衰老模型，通过革兰氏染色法直观地观察益生菌和条件性病原菌的黏附情况。
黑皮鸡枞菌多糖ORP-1是以黑皮鸡枞菌为原料制备的一种生物大分子。目前对于黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的研究集中在结构和体外消化酵解的益生元活性上，而对于黑皮鸡枞菌多糖ORP-1促进肠道益生菌的黏附及抑制条件性病原菌的增殖和黏附尚未研究，同时在本研究中以已知益生元低聚果糖FOS作为阳性对照。
发明内容
本发明旨在提供一种黑皮鸡枞菌多糖ORP-1在肠道菌的增殖及黏附中的应用。本发明首次将黑皮鸡枞菌多糖经分离纯化得到的单一组分多糖ORP-1应用于肠道益生菌和肠道条件性病原菌致病菌的增殖与黏附实验，使得对黑皮鸡枞菌多糖的肠道菌群调节功能研究更具有靶向性。
所述黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的组分构成以及制备方法为本课题组的前期研究工作，具体参见CN 110627919A公开的一种肠道益生元黑皮鸡枞菌多糖ORP-1及其制备方法和用途。
本发明黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的应用，是以所述黑皮鸡枞菌多糖ORP-1制备肠道菌群调节剂。
所述肠道菌为肠道益生菌两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,BB)、嗜酸乳杆菌(Lacrobacillus acidophilus,LA)及肠道条件性病原菌大肠杆菌(Escherichiacoli,EC)。
所述肠道菌群调节剂能够促进肠道益生菌双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的增殖，提高双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的疏水性及自聚集能力，提高双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA对D-gal诱导的Caco-2细胞的黏附率。
所述肠道菌群调节剂能够抑制肠道条件性病原菌大肠杆菌EC的增殖，降低大肠杆菌EC疏水性及自聚集能力，降低大肠杆菌EC对D-gal诱导的Caco-2细胞的黏附率。
本发明通过体外实验探讨黑皮鸡枞菌多糖ORP-1对肠道益生菌和肠道条件性病原菌的增殖、疏水性和自凝集能力的影响，同时利用Caco-2细胞体外模拟建立经D-gal诱导的小肠上皮细胞衰老模型，将双歧杆菌BB、嗜酸乳杆菌LA及大肠杆菌EC分别与Caco-2细胞以及经D-gal诱导的Caco-2细胞共培养。在体外增殖的实验中，以FOS为阳性对照。结果发现，黑皮鸡枞菌多糖ORP-1可以促进双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的增殖及在D-gal诱导的Caco-2细胞上黏附与定植，抑制肠道条件性病原菌大肠杆菌EC的增殖及在D-gal诱导的Caco-2细胞上黏附与定植。综合考虑黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的增殖效果不次于FOS，也适于作为一种新型的肠道调节剂，所以在接下来的黏附操作中仅考察我们黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的黏附作用即可。具体过程如下：
(一)本发明黑皮鸡枞菌多糖ORP-1应用于肠道益生菌双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的增殖及黏附：
1、所述黑皮鸡枞菌多糖ORP-1制备方法参考申请者课题组前期公布号为CN110627919A的发明专利。
2、将双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA分别以2％的接种量接种于MRS培养基中。
3、将步骤1制备的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1分别加入到步骤2所得的MRS培养基中，使其终浓度为2％，阳性对照组为添加了2％的FOS的MRS培养基，空白对照组为未添加黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的空白MRS培养基。
4、将步骤3所得培养基同时置于培养箱，于37℃厌氧培养18-24h，用于增殖、疏水性和自凝聚能力应用。
5、将1mL菌体浓度为5.0×109CFU/mL的双歧杆菌和嗜酸乳杆菌分别加入到Caco-2细胞以及经D-gal诱导的Caco-2细胞中。
6、取1mL用DMEM高糖培养基配制的浓度为1600μg/mL的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1分别添加于步骤5所得Caco-2细胞中使其终浓度为800μg/mL，并粘附2h，用于粘附应用。
(二)本发明黑皮鸡枞菌多糖ORP-1应用于肠道条件性病原菌大肠杆菌EC的增殖及黏附：
1、所述黑皮鸡枞菌多糖ORP-1制备方法参考申请者课题组前期公布号为CN110627919A的发明专利。
2、将大肠杆菌EC以2％的接种量接种于LB培养基中。
3、将步骤1制备的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1分别加入到步骤2所得的LB培养基中，使其终浓度为2％，阳性对照组为添加了2％的FOS的LB培养基，空白对照组为未添加黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的空白LB培养基。
4、将步骤3所得培养基同时置于培养箱，于37℃厌氧培养18-24h，用于增殖、疏水性和自凝聚能力应用。
5、将1mL菌体浓度为5.0×109CFU/mL大肠杆菌分别加入到Caco-2细胞以及经D-gal诱导的Caco-2细胞中。
6、取1mL用DMEM高糖培养基配制的浓度为1600μg/mL的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1分别添加于步骤5所得Caco-2细胞中使其终浓度为800μg/mL，并粘附2h，用于粘附应用。
本发明的有益效果体现在：
本发明中的肠道菌群调节剂黑皮鸡枞菌多糖ORP-1可以促进肠道益生菌双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的增殖，提高双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的疏水性及自聚集能力，提高双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA对D-gal诱导的Caco-2细胞的黏附率；本发明中的肠道菌群调节剂黑皮鸡枞菌多糖ORP-1可以抑制肠道条件性病原菌大肠杆菌EC的增殖，降低大肠杆菌EC疏水性及自聚集能力，降低大肠杆菌EC对D-gal诱导的Caco-2细胞的黏附率。
附图说明
图1为本发明实施例2中黑皮鸡枞菌多糖ORP-1和FOS对双歧杆菌BB、嗜酸乳杆菌LA和大肠杆菌EC增殖的影响。从图中可知，黑皮鸡枞菌多糖ORP-1和FOS干预后，能够明显促进肠道益生菌双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的增殖，抑制肠道条件性病原菌大肠杆菌EC的增殖。在0-16h内，ORP-1对BB的促进作用优于FOS；在13-24h内，ORP-1对LA的促进作用优于FOS；在0-24h内，ORP-1对EC的抑制作用优于FOS。
图2为本发明实施例3中黑皮鸡枞菌多糖ORP-1对双歧杆菌BB、嗜酸乳杆菌LA和大肠杆菌EC疏水性的影响。结果显示，黑皮鸡枞菌多糖ORP-1明显提高了双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的疏水性，降低了大肠杆菌EC的疏水性。
图3为本发明实施例4中黑皮鸡枞菌多糖ORP-1对双歧杆菌BB、嗜酸乳杆菌LA和大肠杆菌EC自聚集能力的影响。从图中看出，黑皮鸡枞菌多糖ORP-1明显提高双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的自聚集能力，降低大肠杆菌EC的自聚集能力。
图4为本发明实施例5中800μg/mL黑皮鸡枞菌多糖ORP-1对双歧杆菌BB(A)、嗜酸乳杆菌LA(B)和大肠杆菌EC(C)黏附Caco-2细胞的影响。结果显示，D-gal诱导后，双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA对Caco-2细胞黏附能力显著性降低，大肠杆菌EC对Caco-2细胞黏附能力显著性升高；800μg/mL黑皮鸡枞菌多糖ORP-1干预D-gal诱导的Caco-2细胞后，能够显著提高双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA对Caco-2细胞的黏附率，降低大肠杆菌EC对Caco-2细胞的黏附率。
具体实施方式
实施例1：
本实施例肠道菌群调节剂为黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，其制备步骤参考申请者课题组前期公布号为CN 110627919 A的发明专利。
黑皮鸡枞菌子实体经粉碎过60目筛，热水浸提三次得浸提液，浸提液与无水乙醇按照1：4的比例醇沉，所得的沉淀物用蒸馏水溶解即得黑皮鸡枞菌粗多糖水溶液。用Sevage法按照多糖水溶液：三氯甲烷：正丁醇＝5：4：1除蛋白，醇沉之后冻干即得黑皮鸡枞菌粗多糖。将黑皮鸡枞菌粗多糖过DEAE-52纤维素层析柱和Superdex-75分子筛凝胶层析柱后即得黑皮鸡枞菌多糖ORP-1。
实施例2：
实施例1中获得的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1和FOS对肠道益生菌双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA及肠道条件性病原菌大肠杆菌EC增殖的影响
将双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA分别以2％的接种量接入含有蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，无水葡萄糖20g/L，吐温-80 1mL/L，磷酸氢二钾2g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L的MRS培养基中，随后往MRS培养基中加入黑皮鸡枞菌多糖ORP-1使其浓度为2％，阳性对照组为添加了2％的FOS的MRS培养基，空白对照组为未添加黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的空白MRS培养基。置于厌氧培养箱37℃培养24h，每隔4h测定培养液OD600值监测双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的增殖情况。
将大肠杆菌以2％的接种量接入到牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L的LB培养基中，随后往LB培养基中加入黑皮鸡枞菌多糖ORP-1使其浓度为2％，阳性对照组为添加了2％的FOS的LB培养基，空白对照组为未添加黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的空白LB培养基。置于厌氧培养箱37℃培养24h，每隔4h测定培养液OD600值监测大肠杆菌的增殖情况。
实施例3：
实施例1中获得的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1对肠道益生菌双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA及肠道条件性病原菌大肠杆菌EC疏水性的影响
将双歧杆菌和嗜酸乳杆菌分别以2％的接种量接种于MRS培养基中，大肠杆菌以2％的接种量接种于LB培养基中，随后往MRS和LB培养基中分别加入黑皮鸡枞菌多糖ORP-1使其终浓度为2％，对照组为未添加黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的空白MRS和LB培养基。于37℃厌氧培养18h，以6000r/min于4℃离心10min，弃上清，收集菌体沉淀。用无菌PBS溶液(pH＝7.2)洗涤菌体沉淀2次后，将菌体重悬于PBS中使待测菌悬液吸光度为OD600＝0.25±0.05。分别取3mL双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和大肠杆菌待测菌悬液加入等体积的二甲苯，对照组不加，漩涡震荡3min，室温静置60min(此时实验组形成两相体系)，吸取水相测定OD600(A1)，A0为对照组在600nm的水相吸光值。
疏水率(％)＝[(A0-A1)/A0]×100
实施例4：
实施例1中获得的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1对肠道益生菌双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA及肠道条件性病原菌大肠杆菌EC自凝聚能力的影响
将双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA分别以2％的接种量接种于MRS培养基中，大肠杆菌EC以2％的接种量接种于LB培养基中，随后往MRS和LB培养基中分别加入黑皮鸡枞菌多糖ORP-1使其终浓度为2％，对照组为未添加黑皮鸡枞菌多糖ORP-1的空白MRS和LB培养基，于37℃培养18h，以6000r/min于4℃离心10min，弃上清，收集菌体沉淀。用无菌PBS溶液(pH＝7.2)洗涤2次后，将菌体重悬于PBS中待用。分别取2mL双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和大肠杆菌待测菌悬液于试管中漩涡震荡1min，测定OD600(A0)，于37℃静置2h，吸取1mL上清液测定OD600(At)。
自凝聚率(％)＝[(A0-At)/A0]×100
实施例5：
实施例1中获得的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1对肠道益生菌双歧杆菌BB、嗜酸乳杆菌LA及肠道条件性病原菌大肠杆菌EC黏附Caco-2细胞的影响
将1mL菌体浓度为5.0×109CFU/mL的双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和大肠杆菌分别加入到Caco-2细胞以及经D-gal诱导的Caco-2细胞中，同时加入1mL用DMEM高糖培养基配制的浓度为1600μg/mL的黑皮鸡枞菌多糖ORP-1，使其终浓度为800μg/mL，共培养2h后，用革兰氏染色法观察益生菌和大肠杆菌的黏附情况。
革兰氏染色法采用如下步骤：先用PBS洗去尚未黏附的菌落，用4％的多聚甲醛固定30min后，草酸铵结晶紫染1分钟，蒸馏水冲洗，加碘液覆盖涂面染约1分钟，水洗，用吸水纸吸去水分，加95％酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分，蕃红染色液(稀)染1分钟后，蒸馏水冲洗，干燥，于倒置显微镜下观察双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和大肠杆菌的黏附情况。

Claims (4)

1.一种黑皮鸡枞菌多糖ORP-1在肠道菌的增殖及黏附中的应用，其特征在于：
以所述黑皮鸡枞菌多糖ORP-1制备肠道菌群调节剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述肠道菌为肠道益生菌两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及肠道条件性病原菌大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述肠道菌群调节剂能够促进肠道益生菌双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的增殖，提高双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA的疏水性及自聚集能力，提高双歧杆菌BB和嗜酸乳杆菌LA对D-gal诱导的Caco-2细胞的黏附率。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述肠道菌群调节剂能够抑制肠道条件性病原菌大肠杆菌EC的增殖，降低大肠杆菌EC疏水性及自聚集能力，降低大肠杆菌EC对D-gal诱导的Caco-2细胞的黏附率。
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