CN112842951B - 二次发酵的桦树汁及其在皮肤外用组合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产二次发酵的桦树汁的方法，其包括分别采用乳酸菌和酵母菌作为菌种、以桦树汁和任选的谷物粉作为培养基进行二次发酵的步骤。本发明还涉及上述二次发酵的桦树汁在皮肤外用组合物，尤其是抗湿疹化妆品组合物中的应用。

Description

二次发酵的桦树汁及其在皮肤外用组合物中的应用

技术领域

本发明涉及一种生产二次发酵的桦树汁的方法，其包括分别采用乳酸菌和酵母菌作为菌种、以桦树汁和任选的谷物粉作为培养基进行二次发酵的步骤。本发明还涉及上述二次发酵的桦树汁在皮肤外用组合物，尤其是抗湿疹化妆品组合物中的应用。

背景技术

桦树为桦木科落叶乔木，桦树汁(也称桦树液)是桦树树皮被划开或树干钻孔流出的新鲜汁液，内含糖类、氨基酸、维生素、生物素、微量的矿质元素、芳香油、桦树醇、皂角甙等化合物，具有良好的保湿、抗炎、抗皱、美白等护肤功效。

发酵技术是指通过微生物的生长繁殖及代谢活动，产生和积累人们所需要的产物的工业技术。据报道，植物提取物通过发酵工艺后可以有提升功效、降低毒性、节省能源等优势。且在现阶段的研究中，乳酸菌发酵滤液或菌体有应用于食品或皮肤外用品中，有祛痘、抵抗特异性皮炎等效果，酵母菌发酵滤液有应用于皮肤外用品中，主要有美白、抗氧化等效果。但目前尚未见有将乳酸菌、酵母菌二次发酵的桦树汁用于化妆品领域的报道。

为拓宽发酵的桦树汁的应用，本发明人分别采用乳酸菌和酵母菌作为菌种，以桦树汁作为主要底物，任选地向其中添加促生长成分，例如谷物粉，进行发酵工艺，所得乳酸菌和酵母菌二次发酵的桦树汁显示了显著更好的护肤功效，尤其是抗湿疹功效。

发明内容

本发明人经研究发现，采用乳酸菌作为菌种进行第一次发酵，然后再采用酵母菌作为菌种以所得一次发酵液为底物进行第二次发酵，其中任选地向培养基(底物)中添加谷物粉，可以得到一种具有改进性能的乳酸菌和酵母菌二次发酵的桦树汁滤液产物，其在具有桦树汁本身活性成分的同时还富含发酵工艺产生的活性成分，例如乳酸、多糖、维生素等，从而具有优异的抗炎、修复皮肤屏障的功效，可作为皮肤外用组合物的抗湿疹活性原料。

一方面，本发明涉及一种生产二次发酵的桦树汁的方法，其包括分别采用乳酸菌和酵母菌作为菌种、以桦树汁和任选的谷物粉作为培养基进行二次发酵的步骤。

在一个实施方案中，所述方法包括下述步骤：

(1)采用乳酸菌作为菌种，在包含桦树汁和任选的谷物粉的培养基中，进行第一次发酵，得到乳酸菌发酵液；

(2)采用酵母菌作为菌种，以所得乳酸菌发酵液为底物，进行第二次发酵，得到二次发酵液；

(3)过滤所述二次发酵液，分别得到乳酸菌和酵母菌的混合菌体以及作为上清液的二次发酵的桦树汁滤液产物(即，作为产物的“二次发酵的桦树汁”)。

任选地，所述方法可进一步包括如下步骤：

(4)破碎所述乳酸菌和酵母菌的混合菌体，然后进行过滤，得到作为上清液的可溶性菌体溶胞物；和

(5)将所得菌体溶胞物与步骤(3)得到的二次发酵的桦树汁滤液混合，过滤，得到二次发酵的桦树汁滤液产物(即作为优选产物的“二次发酵的桦树汁”)。

本发明中所采用的乳酸菌包括乳杆菌属(Lactobacillus)，双歧杆菌属(Bifidobacterium)，以及选自乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)和明串珠菌属(Leuconostoc)的其它类别的乳酸菌等。所述乳杆菌属(Lactobacillus)包括且不局限于嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、短乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌(保加利亚亚种、乳亚种)、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、鸡乳杆菌、加氏乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、消化乳杆菌、弯曲乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、清酒乳杆菌。所述双歧杆菌属(Bifidobacterium)包括且不局限于青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两岐双岐杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、假小链双歧杆菌。其他乳酸菌包括且不局限于乳酸乳球菌(乳酸亚种、乳脂亚种、双乙酰亚种)、嗜热链球菌、乳酸链球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、肠膜明串珠菌、酒明串珠菌等。优选的乳酸菌菌种包括嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌。所述乳酸菌可以菌粉形式商购，例如，商购于杜邦公司、科汉森公司、荷兰皇家帝斯曼集团和北京科拓恒通生物技术股份有限公司等。

本发明所采用的酵母菌包括且不局限于酵母菌属(Saccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、假丝酵母菌属(Candida)、毕赤酵母菌属(Pichia)、覆膜酵母菌属(Saccharomycopsis)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)等。优选的酵母菌菌种包括酿酒酵母菌、卡氏酵母菌、产朊假丝酵母菌、马克思克鲁维酵母菌和乳酸克鲁维酵母菌。所述酵母菌可以活性干酵母菌、菌种保藏管等形式商购，例如，商购于杜邦公司、科汉森公司、乐斯福集团、安琪酵母菌股份有限公司和中国微生物菌种保藏中心等。

本发明中所涉及的桦树汁得自桦木科桦树属，其可来自白桦(Betula alba)、柔毛桦(Betula pubescens)、垂枝桦(Betula Pendula)和亚洲白桦(Betula platyphylla)等品种。所述桦树汁为在解冻至早春发叶之间，人工在桦树的树干基部钻孔收集而得的无色透明、无沉淀、无杂物，具有桦树清香营养丰富的汁液。所述桦树汁可商购得到并原样采用，例如可购自大兴安岭超越野生浆果开发有限责任公司。

本发明中可采用的桦树汁为桦树汁原液或浓缩的桦树汁，其中浓缩的桦树汁的浓缩倍数为约1.05-10.0倍，优选约2.0-5.0倍。

所述浓缩的桦树汁是通过将商购得到的桦树汁产品进行浓缩得到的。浓缩方法是本领域已知的，例如加热浓缩、低温真空浓缩、膜浓缩等。在本发明中，优选通过低温冷冻浓缩或膜浓缩工艺进行浓缩，例如，将商购的桦树汁原液输入低温干燥设备，降温至约-40℃至-70℃，抽真空至约0.1-30Pa而进行低温真空浓缩，从而得到不同浓缩倍数的浓缩桦树汁。

上述步骤(1)第一次发酵是本领域已知的。例如，按照约60-80％(v/v)的装液量，将桦树汁培养基在约95-140℃的超高温瞬时杀菌约4-30秒后加入约100-20000升已经空消无菌状态的发酵罐中，或将桦树汁培养基加入约100-20000升发酵罐中，并以约95-121℃灭菌约10-30分钟。按发酵罐中培养基体积计将乳酸菌直投式菌剂或乳酸菌种子液在无菌条件下接入发酵罐中，在约30-45℃温度和约50-350rpm的转速下进行搅拌，连续发酵约24-168小时，停罐，即完成第一次发酵过程，得到乳酸菌发酵液。

其中，上述乳酸菌直投式菌剂可直接投入发酵罐中。上述乳酸菌种子液是通过使菌粉活化培养得到的。菌粉活化培养是本领域已知的，例如，按照最终发酵体积的约1/50-1/10制备菌种活化步骤的无菌桦树汁种子液培养基；称取约0.1-10g/L、优选约0.5-5g/L以无菌桦树汁种子液培养基计的相应质量的乳酸菌菌粉，将其加入到种子液培养基中，在约30-45℃下培养约4-12小时，即得到所述乳酸菌种子液。

上述桦树汁培养基可以采用桦树汁、尤其是浓缩的桦树汁，例如浓缩约2.0-5.0倍的桦树汁来制备。桦树汁在所述桦树汁培养基中的含量为约90％以上，优选约94％以上，基于所述桦树汁培养基的总重量。

优选地，可将作为碳源、氮源的谷物粉加入所述桦树汁培养基中。所述谷物粉包括但不限于糙米粉、燕麦粉、米糠粉、米粞粉、小麦粉、小麦胚芽粉、全豆粉、酶解燕麦粉，其中优选米糠粉、小麦胚芽粉和酶解燕麦粉。所述谷物粉在所述桦树汁培养基中的含量为约0-8％，优选约3-5％，基于所述桦树汁培养基的总重量。

进一步地，可将pH调节剂加入到桦树汁培养基中，以将桦树汁培养基的pH调节到约5.0-7.0。所述pH调节剂是本领域已知的，例如，包括但不限于乳酸、柠檬酸、氨水、乳酸钠、柠檬酸钠和氢氧化钠，优选柠檬酸钠。

此外，还可以将促进乳酸菌生长的无机盐加入到培养基中，其实例包括但不限于磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、柠檬酸氢二铵、乙酸钠、硫酸锰、硫酸镁、硝酸钾等。所述无机盐的用量是本领域已知的，通常为约0-2％，优选约0.2-1％，基于桦树汁培养基的总重量。

在包含谷物粉、pH调节剂和/或无机盐的情况下，将这些物质加入桦树汁中即可制备桦树汁培养基。

上述步骤(2)第二次发酵也是本领域已知的。例如，将作为二次发酵底物(培养基)的所得乳酸菌发酵液装罐后，以培养基体积为准，将活性干酵母菌或酵母菌种子液在无菌条件下接入发酵罐中，在约20-35℃温度和约150-400rpm的转速下进行搅拌，通入0.2-2.0vvm的气体，连续发酵约24-48小时，停罐，即完成发酵过程，得到二次发酵液。

任选地，在将所得乳酸菌发酵液用作第二次发酵的培养基之前，对其进行灭菌操作。所述灭菌操作是本领域已知的，例如，可以将所述乳酸菌发酵液通过超高温瞬时杀菌设备进行灭菌，其中灭菌温度为约95-140℃，时间为约4-30秒。灭菌后将其投入到无菌发酵罐中，其中按照50-70％(v/v)进行装罐，以发酵罐的总工作体积计。也可直接将所得乳酸菌发酵液投入发酵罐中，在发酵罐中在约95-121℃下灭菌约10-30分钟。

上述酵母菌种子液是通过使活性干酵母菌复水得到的。活性干酵母菌复水是本领域已知的，例如，按照约0.05-1.0g/L，优选0.1-0.5g/L计算发酵所需要的活性干酵母菌总质量，将其加入到约5-10倍体积无菌水中，在约30-35℃下复水约10-20分钟，得到酵母菌种子液。

在步骤(2)中，也可任选地向所述作为二次发酵底物(培养基)的乳酸菌发酵液中进一步加入上述谷物粉、pH调节剂和/或无机盐作为补料。所述谷物粉补料的添加量通常为约0-4％。所述pH调节剂将乳酸菌发酵液的pH调节到约4-6所述无机盐补料的添加量通常为约0-0.5％。

上述步骤(3)过滤所述二次发酵产物是本领域已知的。例如，采用碟式离心机/管式离心机，在约6000-15000rpm下进行约0.5-15分钟。或者，可通过陶瓷膜或有机膜等进行膜分离过滤。所述过滤步骤将二次发酵产物中获得的混合菌体和二次发酵的桦树汁滤液分开，得到作为上清液的二次发酵的桦树汁滤液，即，作为产物的二次发酵的桦树汁。

上述任选的步骤(4)破碎所得乳酸菌和酵母菌的混合菌体是本领域已知的。可采用的方式包括且不限于高压破碎法、反复冻融法、酶解法等。例如，使用约3-5倍质量的发酵的桦树汁滤液将所得混合菌体重悬，得到菌体的重悬液，然后采用高压细胞破碎机，在约1-2升/分钟的流速和约800-1200巴的压力下，均匀处理所述重悬液，直至菌体的破碎率达到约98％以上。或者，也可将菌体重悬液在约零下10-20℃冻结，在约30-50℃下复溶，反复5-10次。或者，亦可采用溶菌酶、胰蛋白酶等按约0.2-1.0％添加至重悬液中，基于重悬液的体积，在酶适宜温度下处理约0.5-5小时。然后，将经破碎的菌体重悬液进行过滤，通常在约10000-20000rpm下进行约10-30分钟，所得上清液即为可溶性菌体溶胞物。或者，通过有机膜或陶瓷膜进行分离，分离出的清液即为可溶性菌体溶胞物。

在上述任选的步骤(5)中，将步骤(4)所得可溶性菌体溶胞物与步骤(3)所得二次发酵的桦树汁滤液混合均匀，然后进一步过滤，所得滤液即为作为优选产物的二次发酵的桦树汁。

所述方法还可进一步包括将所得产物经超高温瞬时杀菌，其中杀菌温度为约95-140℃，时间约为4-30秒；然后，将杀菌过的产物转至存储罐存储，并分装。

通过上述方法得到的二次发酵的桦树汁色浅、透明，含有桦树汁底物自身的营养成分(其中包括B族维生素、微量元素、氨基酸、脂肪酸等)，和发酵新生成的功效成分(其中包括有机酸、胞外多糖、氨基酸、γ-谷维醇等)。通常，所得二次发酵的桦树汁包含0.1-10g/L的总酚、0.1-5g/L的多糖、0.05-10g/L的氨基酸和2-20g/L的γ-谷维醇。因此，所得二次发酵的桦树汁含有丰富的活性营养物，可以作为原料营养物用于皮肤外用组合物中，尤其是抗湿疹化妆品组合物中，显示了优异的抗湿疹功效。

另一方面，本发明涉及一种二次发酵的桦树汁，其是通过分别采用乳酸菌和酵母菌作为菌种、以桦树汁和任选的谷物粉作为培养基进行发酵而获得的。

通常，所得二次发酵的桦树汁包含0.1-10g/L的总酚、0.1-5g/L的多糖、0.05-10g/L的氨基酸和2-20g/L的γ-谷维醇。

再一方面，本发明涉及二次发酵的桦树汁在皮肤外组合物中的用途。

又一方面，本发明涉及一种皮肤外用组合物，其包含(A)二次发酵的桦树汁。

所述二次发酵的桦树汁在所述皮肤外用组合物中的含量可以在宽范围内变化，例如大于0至小于100％，优选为约20-95％，基于所述皮肤外用组合物的总重量。

所述皮肤外用组合物包括药物组合物或者化妆品组合物，尤其是化妆品组合物，特别是抗湿疹化妆品组合物。

除了所述二次发酵的桦树汁外，所述皮肤外用组合物还可以任选地包含(B)皮肤外用组合物中常用的成分，其包括但不限于媒介物、活性成分和辅料等。组分(B)是本领域已知的，本领域技术人员可根据需要选择其类型和用量，例如，组分(B)的含量为约2-82％重量，基于所述皮肤外用组合物的总重量。

所述媒介物包括例如稀释剂、分散剂或载体等，其实例包括但不限于乙醇、双丙甘醇、丁二醇等。所述媒介物在所述皮肤外用组合物中的含量是本领域已知的，例如，其通常占组分(B)总重量的约0.5-20％。

所述活性成分包括例如润肤剂、保湿剂、抗炎活性成分、抗湿疹活性成分等。

所述润肤剂的实例包括但不限于橄榄油、澳洲坚果油、甜杏仁油、葡萄籽油、鳄梨油、玉米油、芝麻油、大豆油、花生油、白池花籽油、红花籽油、狗牙蔷薇果油、刺阿干树仁油、霍霍巴籽油、向日葵籽油、毛瑞榈果油、角鲨烷、棕榈酸乙基己酯、肉豆蔻酸异丙酯、氢化聚异丁烯、异十六烷、异十二烷、碳酸二乙基己酯、碳酸二辛酯、月桂酰肌氨酸异丙酯、异壬酸异壬酯、氢化聚癸烯、甘油三(乙基己酸)酯、鲸蜡醇乙基己酸酯、双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯、辛酸/癸酸甘油三酯、油醇芥酸酯、辛基十二醇肉豆蔻酸酯、辛基十二醇、聚二甲基硅氧烷、辛基聚甲基硅氧烷、鲸蜡基聚二甲基硅氧烷、环五聚二甲基硅氧烷等的一种或多种。固体润肤剂的实例包括但不限于鲸蜡醇、硬脂醇、鲸蜡硬脂醇、山嵛醇、鲨肝醇、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、蜂蜡、小烛树蜡、巴西棕榈蜡、羊毛脂、地蜡、霍霍巴籽蜡、石蜡、微晶蜡、氢化米糠蜡、氢化椰油甘油酯类、甘油山嵛酸酯/二十酸酯、肉豆蔻醇肉豆蔻酸酯、双-二甘油多酰基己二酸酯-2、牛油果树果脂、木鲁星果棕籽脂等中的一种或多种。所述润肤剂在所述皮肤外用组合物中的含量是本领域已知的，例如其通常占组分(B)总重量的约1-50％。

所述保湿剂的实例包括但不限于甘油、双甘油、丁二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、双丙甘醇、1,2-戊二醇、聚乙二醇-8、聚乙二醇-32、甲基葡糖醇聚醚-10、甲基葡糖醇聚醚-20、PEG/PPG-17/6共聚物、甘油聚醚-7、甘油聚醚-26、甘油葡糖苷、PPG-10甲基葡糖醚、PPG-20甲基葡糖醚、PEG/PPG/聚丁二醇-8/5/3甘油、蔗糖、海藻糖、鼠李糖、甘露糖、棉子糖、甜菜碱、赤藓醇、木糖醇、尿素、甘油聚醚-5乳酸酯、透明质酸钠、水解透明质酸钠、乙酰化透明质酸钠、聚谷氨酸钠、水解小核菌胶、出芽短梗酶多糖、银耳多糖、酸豆籽多糖等中的一种或多种。所述保湿剂在所述皮肤外用组合物中的含量是本领域已知的，例如，其通常占组分(B)总重量的约1-30％。

所述抗炎活性成分的实例包括但不限于甘草酸二钾、马齿苋(PORTULACAOLERACEA)提取物、燕麦(AVENA SATIVA)仁提取物(燕麦酰基邻氨基苯甲酸)、泛醇、尿囊素、生物糖胶-1、β-葡聚糖、果聚糖、黄芩(SCUTELLARIA BAICALENSIS)根提取物、欧洲七叶树(AESCULUS HIPPOCASTANUM)提取物、红没药醇、4-叔丁基环己醇、神经酰胺3、氢化卵磷脂、光果甘草(GLYCYRRHIZA GLABRA)提取物、水解蜂王浆蛋白、谷维素、植物鞘氨醇、五羟黄酮(槲皮素)、姜根提取物迷迭香叶提取物、等中的一种或多种。所述抗炎活性成分在所述皮肤外用组合物中的含量是本领域已知的，例如，其通常占组分(B)总重量的约0.01-10％。

所述抗湿疹活性成分的实例包括但不限于糖皮质激素(包含所有强度的糖皮质激素)、氧化锌、炉甘石、硼酸溶液、盐酸小檗碱、依沙吖啶溶液、尿素、水杨酸、钙调神经磷酸酶抑制剂、水杨酸、乳酸、维A酸、焦油、维生素C、葡萄糖酸钙、硫酸锌铜等。所述抗湿疹活性成分在所述皮肤外用组合物中的含量是本领域已知的，例如，其通常占组分(B)总重量的约0.01-10％。

所述辅料包括例如乳化剂、增稠剂、防腐剂、香料等。

所述乳化剂的实例包括但不限于鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-80、甲基葡糖倍半硬脂酸酯、PEG-20甲基葡糖倍半硬脂酸酯、PEG-40氢化蓖麻油、PPG-26-丁醇聚醚-26、PEG-4聚甘油-2硬脂酸酯、PEG-60氢化蓖麻油、硬脂醇聚醚-2、硬脂醇聚醚-21、PPG-13-癸基十四醇聚醚-24、鲸蜡硬脂基葡糖苷、PEG-100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯SE、椰油基葡糖苷、鲸蜡硬脂醇聚醚-25、PEG-40硬脂酸酯、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯柠檬酸酯、聚甘油-10硬脂酸酯、聚甘油-10肉豆蔻酸酯、聚甘油-10二油酸酯、聚甘油-10月桂酸酯、聚甘油-10异硬脂酸酯、聚甘油-10油酸酯、聚甘油-10二异硬脂酸酯、聚甘油-6月桂酸酯、聚甘油-6肉豆蔻酸酯、蔗糖硬脂酸酯、蔗糖多硬脂酸酯等中的一种或多种。所述乳化剂在所述皮肤外用组合物中的含量是本领域已知的，例如，其通常占组分(B)总重量的约0.5-10％。

所述增稠剂的实例包括但不限于卡波姆类、丙烯酸(酯)类及其衍生物、黄原胶、阿拉伯胶、聚乙二醇-14M、聚乙二醇-90M、琥珀酰聚糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等高分子聚合物中的一种或多种。所述增稠剂在所述皮肤外用组合物中的含量是本领域已知的，例如，其通常占组分(B)总重量的约0.1-10％。

所述防腐剂的实例包括但不限于羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、苯甲醇、苯乙醇、双(羟甲基)咪唑烷基脲、山梨酸钾、苯甲酸钠、氯苯甘醚、脱氢乙酸钠、辛酰羟肟酸、1,2-己二醇、1,2-戊二醇、对羟基苯乙酮、辛甘醇、甘油辛酸酯、十一碳烯酸甘油酯、山梨坦辛酸酯、乙基己基甘油、牡丹根提取物等中的一种或多种。所述防腐剂在所述皮肤外用组合物中的含量是本领域已知的，例如，其通常占组分(B)总重量的约0.01-2％。

可根据皮肤外用组合物(药物或化妆品组合物)工业中已知的任何方法，将二次发酵的桦树汁与其它药物成分或者化妆品成分混合，得到药物组合物或者化妆品组合物。例如，使用化妆品领域中常用的溶解槽、乳化锅、分散器、输送泵等设备制备。制备时先将水溶性物质投入水相溶解釜，将油溶性物质投入油相溶解釜，将两个釜的温度加热至约80℃，其中对于易结块的原料，可先用分散器将其预分散。待溶解完成后将油相和水相输送至乳化锅中，均质乳化约5-15分钟。乳化完成后将料体温度降至常温，加入任选的香精、防腐剂等，并视需要调节产物的pH。相关检测指标都合格后方可灌装出货。以上制备方法可根据剂型要求进行删减或调整。

所述皮肤外用组合物可根据需要制成各种剂型，例如溶液、悬浮液、膏、霜、乳液、凝胶、粉末、喷剂等。

实施例

以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是，应当理解为，这些实施例、对比例仅仅是用于更详细地说明本发明，而不应理解为用于以任何形式限制本发明所附权利要求书的范围。

实施例1-4中采用的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)菌种商购于北京科拓恒通生物技术股份有限公司，菌株编号LC-Zhang；贝酵母菌(Saccharomyces bayanus)商购于安琪酵母菌股份有限公司，菌株编号BV818。

实施例1

(1)桦树汁培养基的制备

以东北大兴安岭采集的桦树汁原液(brix 1.20)为底物，添加0.2％乙酸钠、0.2％柠檬酸氢二铵、0.05％硫酸镁和0.02％硫酸锰，使用1M柠檬酸钠水溶液调整桦树汁培养基的pH为5.8±0.2。

(2)干酪乳杆菌种子液的制备

制备7升桦树汁培养基投入10升种子发酵罐中，并在105℃灭菌20分钟；冷却至37℃后，按0.5g/L投入干酪乳杆菌菌粉，以培养基体积计；在37℃环境中培养16小时，得到干酪乳杆菌种子液。

(3)第一次发酵

按照70％(v/v)体积装液量，将步骤(1)所配制的桦树汁培养基加入到100L发酵罐中，105℃灭菌20分钟；将所制备的干酪乳杆菌种子液无菌操作接入发酵罐中，于37℃、搅拌转速150rpm的条件下，连续发酵72小时，停罐，得到干酪乳杆菌发酵液。

(4)灭菌

将步骤(3)所得干酪乳杆菌发酵液在发酵罐中95℃灭菌20分钟，并冷却至30℃。

(5)酵母菌种子液的制备

按照0.3g/L计算发酵所需的贝酵母菌活性干酵母菌总质量为23.1g，加入8倍的无菌水中；在35℃下复水15分钟，得到酵母菌种子液。

(6)第二次发酵

将步骤(5)所得酵母菌种子液无菌操作加入到步骤(4)所得无菌的干酪乳杆菌发酵液中，在30℃和200rpm的转速下进行搅拌，在0.8vvm的通气量下，连续发酵48小时，停罐，即完成发酵过程，得到二次发酵液。

(6)将二次发酵产物过滤

将步骤(6)所得的二次发酵产物使用0.2μm陶瓷膜过滤，得到最终的二次发酵的桦树汁滤液产物。

取二次发酵的桦树汁滤液产物，测试其中的总酚、多糖、氨基酸和γ-谷维醇的含量，结果如表1所示。同时，测试对人原代角质形成细胞的保湿和屏障修复相关蛋白表达的影响，结果如表2所示。还测试对湿疹模型小鼠的炎症因子的影响，结果如表3所示。

实施例2

(1)浓缩的桦树汁培养基的制备

以来自东北小兴安岭的桦树汁的浓缩液(浓缩5倍，brix 5.10)为底物，添加0.2％柠檬酸氢二铵、0.1％磷酸二氢钾、0.05％硫酸镁和0.02％硫酸锰，使用0.5M氢氧化钠水溶液调整桦树汁培养基的pH为5.8±0.2。

(2)第一次发酵

将步骤(1)所配制的浓缩的桦树汁培养基通过超高温瞬时杀菌设备128℃灭菌4秒；按照80％(v/v)体积装液量加入到1000L已经空罐杀菌后的发酵罐中并将培养基冷却至42℃；将所商购的干酪乳杆菌菌粉无菌操作投入发酵罐中，于42℃、搅拌转速200rpm的条件下，连续发酵54小时，停罐，得到干酪乳杆菌发酵液。

(3)干酪乳杆菌发酵液灭菌

将步骤(2)所得的干酪乳杆菌发酵液在发酵罐中105℃灭菌20分钟，并冷却至30℃。

(4)第二次发酵

将干酪乳杆菌发酵液体积计的0.3g/L的贝酵母菌活性干酵母菌粉无菌操作加入到步骤(3)所得无菌的乳酸菌发酵液中，在30℃和400rpm的转速下进行搅拌，在0.6vvm的通气量下，连续发酵48小时，停罐，即完成发酵过程，得到二次发酵液。

(5)将二次发酵产物过滤

将步骤(4)所得的二次发酵产物使用管式离心机进行过滤，其中搅拌转速13000rpm，操作温度10℃，流速160L/H，得到最终的二次发酵的桦树汁滤液产物。

(6)杀菌灌装

将步骤(5)所得的二次发酵的桦树汁滤液产物经超高温瞬时杀菌设备进行灭菌，其中杀菌温度为110℃，时间15秒，和然后灌装于无菌袋中。

取二次发酵的桦树汁滤液产物，测试其中的总酚、多糖、氨基酸、γ-谷维醇含量，结果如表1所示。同时，测试对人原代角质形成细胞的保湿和屏障修复相关蛋白表达的影响，结果如表2所示。还测试对湿疹模型小鼠的炎症因子的影响，结果如表3所示。

实施例3

(1)桦树汁培养基的制备

以东北小兴安岭采集的桦树汁原液(brix1.10)为底物，添加5％米糠粉，使用1M柠檬酸钠水溶液调整桦树汁培养基的pH为5.8±0.2。

(2)第一次发酵

将步骤(1)所配制的桦树汁培养基通过超高温瞬时杀菌设备在128℃下灭菌4秒；按照70％(v/v)体积装液量加入到2000L已经空罐杀菌后的发酵罐中并将培养基冷却至37℃；将商购的干酪乳杆菌菌粉无菌操作投入发酵罐中，于37℃、搅拌转速200rpm的条件下，连续发酵72小时，停罐，得到干酪乳杆菌发酵液。

(3)干酪乳杆菌发酵液灭菌

将步骤(2)所得的干酪乳杆菌发酵液在发酵罐中105℃灭菌20分钟，并冷却至25℃。

(4)酵母菌种子液的制备

按照0.5g/L计算发酵所需的贝酵母菌活性干酵母菌总质量，加入10倍的无菌水中；在30℃下复水10分钟，得到酵母菌种子液。

(5)第二次发酵

将步骤(4)所得酵母菌种子液无菌操作加入到步骤(3)所得无菌的干酪乳杆菌发酵液中，在25℃和200rpm的转速下进行搅拌，在0.8vvm的通气量下，连续发酵48小时，停罐，即完成发酵过程，得到二次发酵液。

(6)将二次发酵产物过滤

将步骤(5)所得的二次发酵产物使用管式离心机过滤，其中搅拌转速13000rpm，操作温度10℃，流速160L/H，得到最终的二次发酵的桦树汁滤液产物。

取二次发酵的桦树汁滤液产物，测试其中的总酚、多糖、氨基酸、γ-谷维醇含量，结果如表1所示。同时，测试对人原代角质形成细胞的保湿和屏障修复相关蛋白表达的影响，结果如表2所示。还测试对湿疹模型小鼠的炎症因子的影响，结果如表3所示。

实施例4

(1)桦树汁培养基的制备

以来自东北小兴安岭的桦树汁的浓缩液(浓缩3倍，brix2.95)为底物，添加3％小麦胚芽粉和2％酶解燕麦粉，使用0.5M氢氧化钠水溶液调整桦树汁培养基的pH为5.8±0.2。

(2)第一次发酵

将步骤(1)所配制的桦树汁培养基通过超高温瞬时杀菌设备在128℃灭菌4秒；按照60％(v/v)体积装液量加入到5000L已经空罐杀菌后的发酵罐中并将培养基冷却至37℃；将商购的干酪乳杆菌菌粉无菌操作投入发酵罐中，于37℃、搅拌转速100rpm的条件下，连续发酵72小时，停罐，得到干酪乳杆菌发酵液。

(3)干酪乳杆菌发酵液灭菌

将步骤(2)所得的干酪乳杆菌发酵液在发酵罐中105℃灭菌20分钟，并冷却至25℃。

(4)第二次发酵

将干酪乳杆菌发酵液体积计的0.2g/L的贝酵母菌活性干酵母菌粉无菌操作加入到步骤(3)所得无菌的干酪乳杆菌发酵液中，在25℃和300rpm的转速下进行搅拌，在0.8vvm的通气量下，连续发酵60小时，停罐，即完成发酵过程，得到二次发酵液。

(5)将二次发酵产物过滤

将步骤(4)所得的二次发酵产物使用碟式离心机进行过滤，其中搅拌转速9000rpm，操作温度20℃，分离时间20分钟，得到最终的二次发酵的桦树汁滤液产物。

取二次发酵的桦树汁滤液产物，测试其中的总酚、多糖、氨基酸、γ-谷维醇含量，结果如表1所示。同时，测试对人原代角质形成细胞的保湿和屏障修复相关蛋白表达的影响，结果如表2所示。测试对湿疹模型小鼠的炎症因子的影响，结果如表3所示。

实施例5

(1)桦树汁培养基的制备

以来自东北小兴安岭的桦树汁的浓缩液(浓缩3倍，brix2.95)为底物，添加3％小麦胚芽粉和2％酶解燕麦粉，使用0.5M氢氧化钠水溶液调整桦树汁培养基的pH为5.8±0.2。

(2)第一次发酵

将步骤(1)所配制的桦树汁培养基通过超高温瞬时杀菌设备在128℃灭菌4秒；按照60％(v/v)体积装液量加入到5000L已经空罐杀菌后的发酵罐中并将培养基冷却至37℃；将商购的干酪乳杆菌菌粉无菌操作投入发酵罐中，于37℃、搅拌转速100rpm的条件下，连续发酵72小时，停罐，得到干酪乳杆菌发酵液。

(3)第二次发酵

将干酪乳杆菌发酵液体积计的0.2g/L的贝酵母菌活性干酵母菌粉无菌操作加入到步骤(2)所得的干酪乳杆菌发酵液中，在25℃和300rpm的转速下进行搅拌，通过发酵罐控制系统添加0.5M氢氧化钠水溶液使得发酵液pH稳定在5.0±0.2；在0.3vvm的通气量下，连续发酵48小时，停罐，即完成发酵过程，得到二次发酵液。

(4)将二次发酵液过滤

将步骤(3)所得的二次发酵液使用碟式离心机进行过滤，其中搅拌转速9000rpm，操作温度20℃，分离时间20分钟，得到作为菌泥的乳酸菌和酵母菌的混合菌体以及作为上清液的发酵的桦树汁滤液产物。将分离得到的上清液打入无菌储存罐；菌泥用5倍体积上清液重悬，获得混合菌重悬液。

(5)破碎混合菌体，过滤获得可溶性混合菌溶胞物

将步骤(4)所得混合菌重悬液进行高压细胞破碎，利用高压细胞破碎设备，在1200巴、1升/分钟流速的条件下进行破碎。而后使用离心机过滤，即得到可溶性的混合菌溶胞物。

(6)将混合菌溶胞物与发酵桦树汁滤液混合过滤

将步骤(5)所得混合菌溶胞物与步骤(4)所得发酵桦树汁上清液混合，而后进一步使用离心机过滤，获得最终发酵的二次发酵的桦树汁滤液产物。

取二次发酵的桦树汁滤液产物，测试其中的总酚、多糖、氨基酸、γ-谷维醇含量，结果如表1所示。同时，测试对人原代角质形成细胞的保湿和屏障修复相关蛋白表达的影响，结果如表2所示。测试对湿疹模型小鼠的炎症因子的影响，结果如表3所示。

表1:二次发酵的桦树汁的总酚、多糖、氨基酸、γ-谷维醇含量

以上结果表明，与未发酵的桦树汁原液相比，通过二次发酵桦树汁获得营养物质增加的二次发酵桦树汁产物。通过向桦树汁中添加谷物粉后，得到的二次发酵桦树汁产物中的营养物质显著增加，尤其是其中的氨基酸含量和γ-谷维醇含量。

表2:二次发酵的桦树汁对人原代角质形成细胞的保湿和屏障修复相关蛋白表达的影响

注：**表示与空白对照相比为极显著，P值小于0.01。

表2给出了二次发酵的桦树汁对人原代角质形成细胞的角质转谷酰胺酶TGM1、表皮紧密连接蛋白(ZO-1和CLDN1)、丝聚蛋白FLG和水通道蛋白AQP3的影响的结果。其中的结果表明，对比空白对照，未发酵的桦树汁原液可以增强保湿和屏障修复相关蛋白的表达，而二次发酵的桦树汁显示了显著更好的保湿和修复屏障的功效。

表3:二次发酵的桦树汁对湿疹模型小鼠的炎症因子的影响

	IL-4(pg/ml)	IL-13(pg/ml)	IL-17(pg/ml)	TSLP
					造模组	55.9±0.49	35.86±2.21	60.23±1.55	89.13±2.54
正常组	20.56±0.31**	13.86±1.46**	32.77±1.46**	39.21±2.31**
					阳性药物组	30.11±1.48**	16.34±0.53**	40.56±1.96**	45.59±10.11**
桦树汁原液(未发酵)	35.29±2.03**	20.76±2.89**	45.23±3.56**	51.24±10.56**
					实施例1	32.65±0.81**	17.89±1.64**	42.62±2.98**	48.12±3.13**
实施例2	29.98±1.42**	16.95±2.13**	40.86±1.52**	45.28±2.27**
					实施例3	28.50±1.69**	16.09±0.75**	36.50±2.71**	43.31±1.39**
实施例4	27.41±2.14**	14.33±1.82**	34.39±1.88**	42.53±2.47**
					实施例5	28.07±1.48**	14.62±1.29**	35.11±1.57**	42.37±1.64**

注：**表示p<0.01(与造模组比较)

表3给出了利用2,4-二硝基氟苯(DNFB)致敏和激发建立小鼠的湿疹模型、1％氢化可的松软膏作为阳性对照，二次发酵的桦树汁对炎症因子Th2型细胞因子白介素-4(IL-4)、白介素-13(IL-13)、白介素-17(IL-17)以及TSLP产生的影响的结果。其中的结果表明，对比正常组，未发酵的桦树汁原液有显著的抗炎功效，但还未达到阳性药物的效果；而对比正常组和阳性药物组，二次发酵的桦树汁具有显著的抗炎功效。

实施例6：抗湿疹精华液

采用实施例1中制备的二次发酵的桦树汁滤液产物来制备抗湿疹精华液，其配方如下：

序号	成分	重量％
			1	二次发酵的桦树汁	77.41
2	聚谷氨酸钠	0.05
			3	黄原胶	0.05
4	尿囊素	0.1
			5	羟苯甲酯	0.2
6	PEG-60氢化蓖麻油	0.2
			7	水解透明质酸钠	0.2
8	海藻糖	0.5
			9	PEG/PPG-17/6共聚物	1
10	甜菜碱	2
			11	双丙甘醇	3
12	PEG-8	5
			13	甘油	6
14	丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物	0.05
			15	卡波姆	0.2
16	甘油三(乙基己酸)酯	0.5
			17	聚二甲基硅氧烷	1
18	鲸蜡醇乙基己酸酯	2
			19	氨丁三醇	0.14
20	苯氧乙醇	0.4

上述抗湿疹精华液如下制备：

1.将原料3用原料11分散均匀；

2.将原料1投入乳化锅，边搅拌边撒入原料14和原料15，待原料14和原料15完全溶胀后，加入原料2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和原料13，边搅拌边升温至80℃，高速均质5分钟，保温10分钟；

3.边搅拌边降温至50℃，加入原料16、17和原料18，高速均质5分钟；

4.边搅拌边降温至50℃，加入原料19和原料20；

5.边搅拌边降温至40℃；

6.检验合格后出料。

在本实施例中，选择20名3-15岁轻度湿疹儿童和20名中度湿疹儿童进行为期3周的治疗。其中10轻度和10名中度湿疹儿童使用所述抗湿疹精华液，每日涂抹2-3次，每次100-200克，其余患者使用不含桦树汁的精华液(对照产品，其配方与上表中完全相同，但全部桦树汁被水替代)，连续三周，第14天进行疾病程度评分。结果表明，相比于对照产品，所述抗湿疹精华液显著改善皮肤状况(p<0.05)，第21天进一步显著改善(p<0.01)。这表明，所述抗湿疹精华液可治疗轻至中度湿疹。

实施例7：抗湿疹乳液

采用实施例2中制备的发酵的桦树汁滤液产物来制备抗湿疹乳液，其配方如下：

上述抗湿疹乳液如下制备：

1.将原料5用原料10分散均匀。

2.将原料1投入乳化锅，边搅拌边撒入原料12，待原料12完全溶胀后再投入原料2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。

3.边搅拌边升温至80℃，高速均质5分钟，保温10分钟。

4.加入原料13和原料14，高速均质5分钟，保温10分钟。

5.边搅拌边降温至60℃，加入原料15。

6.降温至50℃，加入原料16和原料17，慢速均质3分钟。

7.边搅拌边降温至40℃。

8.检验合格后出料。

在本实施例中，选择20名3-15岁轻度湿疹儿童和20名中度湿疹儿童进行为期3周的治疗。其中10轻度和10名中度湿疹儿童使用所述抗湿疹乳液，每日涂抹2-3次，每次100-200克，其余患者使用不含桦树汁的乳液(对照产品，其配方与上表中完全相同，但全部浓缩桦树汁被桦树汁原汁替代)，连续三周，第14天进行疾病程度评分。结果表明，相对于对照产品，所述抗湿疹乳液显著改善皮肤状况(p<0.05)，第21天进一步显著改善(p<0.01)。这表明，所述抗湿疹乳液可治疗轻至中度湿疹。

实施例8：抗湿疹面霜

采用实施例3中制备的发酵的桦树汁滤液产物来制备抗湿疹面霜，其配方如下：

序号	成分	重量％
			1	二次发酵的桦树汁	62.2
2	聚谷氨酸钠	0.1
			3	水解透明质酸钠	0.1
4	黄原胶	0.2
			5	尿囊素	0.2
6	羟苯甲酯	0.2
			7	氢化卵磷脂	0.5
8	泛醇	0.5
			9	甜菜碱	3
10	丁二醇	4
			11	甘油	6
12	卡波姆	0.2
			13	羟苯丙酯	0.1
14	植物甾醇/辛基十二醇月桂酰谷氨酸酯	1
			15	微晶蜡	1
16	C10-18脂酸甘油三酯类	2
			17	鲸蜡硬酯基葡糖苷、鲸蜡硬脂醇	2
18	鲸蜡硬脂醇	2
			19	PEG-100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯	3
20	辛酸/癸酸甘油三酯	4
			21	椰油醇-辛酸酯/癸酸酯	5
22	聚二甲基硅氧烷	2
			23	氨丁三醇	0.2
24	苯氧乙醇	0.5

上述抗湿疹面霜如下制备：

1.将原料4用原料11分散均匀；

2.将原料7用原料10加热溶解；

3.将原料1投入水相锅，边搅拌边撒入原料12，待原料12号完全溶胀后加入原料2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，升温至80℃；

4.将原料13、14、15、16、17、18、19、20、21、22投入油相锅，升温至80℃；

5.将水相锅中的原料抽入乳化锅，高速均质5分钟；

6.将油相锅中的原料抽入乳化锅，高速均质5分钟，保温10分钟；

7.边搅拌边降温至50℃，投入原料23和24，慢速均质3分钟；

8.边搅拌边降温至40℃；

9.检验合格后出料。

在本实施例中，选择20名3-15岁轻度湿疹儿童和20名中度湿疹儿童进行为期3周的治疗。其中10名轻度和10名中度湿疹儿童使用所述抗湿疹面霜，每日涂抹2-3次，每次100-200克，其余患者使用不含桦树汁的护肤霜(对照产品，其配方与上表中完全相同，但全部桦树汁被水替代)，连续三周，第14天进行疾病程度评分。结果表明，相比于对照产品，所述抗湿疹面霜显著改善皮肤状况(p<0.05)，第21天进一步显著改善(p<0.01)。这表明，所述抗湿疹面霜可治疗轻至中度湿疹。

实施例9：抗湿疹膏剂

采用实施例4中制备的发酵的桦树汁滤液产物来制备抗湿疹膏剂，其配方如下：

/>

上述抗湿疹膏剂如下制备：

1.将原料3用原料8分散均匀。

2.将原料5用原料19溶解。

3.将原料1投入水相锅，边搅拌边加入原料2、3、4、6、7、8、升温至80℃。

4.将原料9、10、11、12、13、14、15、16、17投入油相锅，升温至80℃。

5.将水相锅中的原料抽入乳化锅，高速均质5分钟。

6.将油相锅中的原料抽入乳化锅，高速均质5分钟，保温10分钟。

7.边搅拌边降温至50℃，投入原料5、19和原料18，慢速均质3分钟。

8.边搅拌边降温至40℃。

9.检验合格后出料。

在本实施例中，选择20名3-15岁轻度湿疹儿童和20名中度湿疹儿童进行为期2周的治疗。其中10名轻度和10名中度湿疹儿童使用所述抗湿疹膏剂，每日涂抹2次，其余患者使用不含桦树汁的膏剂(对照产品，其配方与上表中完全相同，但全部桦树汁被水替代)，连续三周，第7天进行疾病程度评分。结果表明，相对于对照产品，所述抗湿疹膏剂显著改善皮肤状况(p<0.05)，第14天进一步显著改善(p<0.01)。这表明，所述抗湿疹膏剂可治疗轻至中度湿疹。

以上所述实施例的技术方案是本发明优选实施方式，在不脱离本发明原理的前提下还可以进行若干改进和变换，这些改进和变化也应视为在本发明的保护范围内。

Claims (14)

1.一种生产二次发酵的桦树汁的方法，其中所述方法包括下述步骤：

(1)采用乳酸菌作为菌种，在包含桦树汁和任选的谷物粉的培养基中，在30-45℃的温度下进行第一次发酵24-168小时，得到乳酸菌发酵液；

(2)采用酵母菌作为菌种，以所得乳酸菌发酵液为底物，在20-35℃的温度下进行第二次发酵24-48小时，得到二次发酵液；和

(3)过滤所述二次发酵液，分别得到乳酸菌和酵母菌的混合菌体以及二次发酵的桦树汁滤液产物；

其中桦树汁在所述桦树汁培养基中的含量为90％以上，基于所述桦树汁培养基的总重量；

所述乳酸菌选自嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌；和

所述酵母菌选自贝酵母菌、酿酒酵母菌、卡氏酵母菌、产朊假丝酵母菌、马克思克鲁维酵母菌和乳酸克鲁维酵母菌。

2.权利要求1所述的方法，其进一步包括如下步骤：

(4)破碎所述乳酸菌和酵母菌的混合菌体，然后进行过滤，得到可溶性菌体溶胞物；和

(5)将所得菌体溶胞物与步骤(3)得到的二次发酵的桦树汁滤液混合，过滤，得到二次发酵的桦树汁滤液产物。

3.权利要求1所述的方法，其中所述桦树汁是浓缩倍数为1.05-10.0倍的浓缩桦树汁。

4.权利要求3所述的方法，其中所述桦树汁是浓缩倍数为2.0-5.0倍的浓缩桦树汁。

5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中桦树汁在所述桦树汁培养基中的含量为94％以上，基于所述桦树汁培养基的总重量。

6.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述谷物粉选自糙米粉、燕麦粉、米糠粉、米粞粉、小麦粉、小麦胚芽粉、全豆粉、酶解燕麦粉。

7.权利要求6所述的方法，其中所述谷物粉选自米糠粉、小麦胚芽粉和酶解燕麦粉。

8.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述谷物粉在所述桦树汁培养基中的含量为0-8％，基于所述桦树汁培养基的总重量。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述谷物粉在所述桦树汁培养基中的含量为3-5％，基于所述桦树汁培养基的总重量。

10.通过权利要求1-9任一项所述的方法获得的二次发酵的桦树汁。

11.权利要求10所述的二次发酵的桦树汁在制备皮肤外用组合物中的用途。

12.权利要求11所述的用途，其中所述皮肤外用组合物是抗湿疹化妆品组合物。

13.一种皮肤外用组合物，其包含权利要求10所述的二次发酵的桦树汁。

14.权利要求13所述的皮肤外用组合物，其是抗湿疹化妆品组合物。