CN112834735B - 用于测量皮肤健康代谢物的非侵入性方法 - Google Patents

用于测量皮肤健康代谢物的非侵入性方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于诊断受试者的皮肤健康的非侵入性方法，所述方法包括收集来自所述受试者的皮肤样品；检测在上皮细胞样品/皮肤细胞样品中的一种或多种小分子生物标记的含量；基于检测到的小分子生物标记的含量诊断所述受试者是否具有皮肤病症，其中所检测到的小分子为选自以下的至少一种化合物：由氨基酸代谢生成的化合物、由二肽代谢生成的化合物、由核酸生成的化合物、由脂质代谢生成的化合物、由碳水化合物代谢生成的化合物、和它们的混合物、以及另外在表1中列出的小分子生物标记。本发明还公开了一种评估用于皮肤健康的产品的功效的非侵入性方法。

Description

用于测量皮肤健康代谢物的非侵入性方法
本申请是是申请号为201810613253.4、发明名称为“用于测量皮肤健康代谢物的非侵入性方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于测量来自皮肤样品的一种或多种小分子和/或代谢物生物标记的量的方法以及这些生物标记的量的关联与相关性，因为它直接与哺乳动物皮肤健康的改善相关联。
背景技术
头皮/皮肤是显著的器官系统，由起到对环境侵袭的第一道防线功能的多个特化组织构成。虽然早期的研究主要集中于皮肤的阻隔功能，已经变得清楚的一点是这个器官是动态的：对甚至是环境中微小的变化感测并响应从而帮助保持内稳态。环境影响诸如太阳辐射、污染、或者甚至皮肤护理产品的施涂导致复杂的级联事件，它们最终导致数百或者数千个基因表达的改变。基因表达的这些改变一般被翻译成催化化学反应的蛋白质生成的改变(或积聚、释放、改性等等)，最终导致细胞响应。随着这些化学反应的进行，常常留下代谢副产物作为已经发生了何种化学过程的指示。与给定皮肤病症例如头皮屑相关联的那些小分子生物标记的表达谱分析可提供有价值的信息，用于了解病症以及开发用于诊断和/或改善皮肤病症目的的产品。
头皮屑是一种常见的慢性复发性头皮病症，具有片状剥落、瘙痒和过敏的病征和症状。头皮屑的发病机理是复杂的，并且好像是头皮、微生物区系和宿主免疫系统相互作用的结果。针对这种病症的许多之前的工作已经集中于检查一些表面水平的现象。传统的基于专家观察的评估及基于自我观察的评估与基于大型仪器的在生理水平上的表皮结构和功能的评估相结合。新的生物分子学能力达到了病理生理的理解深度，而非之前用传统研究方法达到的理解深度；然而，对导致这种病症的关键症状的分子事件的清晰了解仍未出现。为了解释这些关键分子事件，可通过剥除皮肤表面的胶带、随后通过化学或生物分析方法，来非侵入性地获得生物分子取样。组胺最近被鉴定为头皮瘙痒的敏感生物标记。需要另外的生物标记以允许更详细的头皮屑病症的病理生理描述，以及用作指示头皮屑治疗方案程度和完成度的相关量度。可非侵入性取样的生物标记将使得它们可最大程度上用于常规的临床评估。
为了鉴定用于头皮屑病症的生物标记，使用一种代谢物表达谱方法来辨别在来自无头皮屑受试者、头皮屑受试者、和用去头皮屑洗发剂治疗过的头皮屑受试者的头皮胶带剥除提取物之间的差别。这种代谢物表达谱方法(代谢物组学)提供每个受试组的细胞过程的独有特征。虽然基因组学和蛋白质组学快速描绘出生物系统中可能发生的事件，可将代谢物组学认为是生物系统响应于遗传和环境变化的扩大的输出，代谢物组学为我们提供系统生理学的有价值信息。代谢物组学表达谱与基因组学和蛋白质组学认识的成功整合将能够更彻底地理解生物系统，包括在皮肤病学方面的应用。
非侵入性取样方法对皮肤/头皮护理中的生物标记应用是重要的。胶带剥除已经被成功地用于收集来自皮肤/头皮的小分子，用于后续的代谢物表达谱分析。
发明内容
本发明的实施例涉及用于诊断受试者皮肤健康状态的非侵入性方法，该方法包括收集来自受试者的皮肤样品；检测在上皮细胞样品/皮肤细胞样品中的一种或多种小分子生物标记的含量；基于检测到的小分子生物标记的含量诊断受试者是否具有皮肤病症，其中检测到的小分子为选自以下的至少一种化合物：由氨基酸代谢生成的化合物、由二肽代谢生成的化合物、由核酸生成的化合物、由脂质代谢生成的化合物、由碳水化合物代谢生成的化合物、和它们的混合物、以及另外在表1中列出的小分子生物标记。
附表说明
表1a、b、c、d、e：代谢物的倍数变化在头皮屑和非头皮屑、以及经去头皮屑治疗的头皮屑之间具有显著的统计学差异。
表2a和b：具有显著差异的氨基酸生物标记和它们的代谢物。
表3a和b：具有显著差异的二肽代谢物/生物标记。
表4：具有显著差异的核酸代谢物/生物标记。
表5a和b：具有显著差异的脂质生物标记和它们的代谢物/生物标记。
表6：具有显著差异的杂项生物标记，包括碳水化合物和它们的代谢物、辅因子、以及其它。
表7a和b：具有显著差异的未知结构分子/生物标记。
表8：自我评估和专家分级结果
具体实施方式
尽管说明书通过特别指明并清楚地要求保护本发明的权利要求作出结论，据信，本发明通过下列具体实施方式将更好地理解。
本发明可包含下列因素、由其组成、或基本上由其组成：本文所述的本发明的基本要素和限定条件、以及本文所述的任何附加或任选成分、组分或限定条件。
除非另外指明，所有百分比、份数和比率均基于本发明组合物的总重量。所有与所列成分相关的此类重量均基于活性物质的含量计，并因此不包括可能包含在可商购获得的材料中的载体或副产物。
本发明的各个实施例中的组分和/或步骤，包括可任选加入的那些，详细描述于下文。
所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考；任何文献的引用不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。
除非另外特别说明，所有比率都是重量比率。
除非另外特别说明，所有温度是摄氏度。
除非另外指明，所有包括数量、百分比、分数和比例的量被理解为由词“约”所修饰，并且量不旨在显示有效数字。
除非另外说明，“一个”和“所述”是指“一个或多个”。
本发明中“包括”指可加入其它不影响最终结果的步骤和成分。该术语包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/过程可包括本文所述的本发明元素和限制，以及本文所述的任何附加或任选成分、组分、步骤或限制、由本文所述的本发明元素和限制，以及本文所述的任何附加或任选成分、组分、步骤或限制组成，和基本上由本文所述的本发明基本元素和限制，以及本文所述的任何附加或任选成分、组分、步骤或限制组成。
本文“有效的”是指一定量的受试品活性足够高以使待治疗病症发生显著积极的改善。受试品活性的有效量将随着待治疗的具体病症、病症严重程度、治疗持续时间、并发治疗的性质、以及类似因素而发生改变。
如本文所用，术语“差异含量”的代谢物可包括任何提高的或降低的含量。在一个实施例中，差异含量是指含量增加了：至少5％；至少10％；至少20％；至少30％；至少40％；至少50％；至少60％；至少70％；至少80％；至少90％；至少100％；至少110％；至少120％；至少130％；至少140％；至少150％；或更多。在另一个实施例中，差异含量是指含量减少了：至少5％；至少10％；至少20％；至少30％；至少40％；至少50％；至少60％；至少70％；至少80％；至少90％；至少100％。代谢物以具有统计学上显著的差异含量表达(即，P值等于小于0.2，其使用Student T-test、Welch's 2样品T-test、Matched Pair T-test或Wilcoxon’srank-sum Test进行测定)。
如本文所用，术语“代谢物”是指由代谢产生的、或特定代谢过程中必需的、或参与特定代谢过程的任何物质。该术语不包括大分子，诸如大蛋白质(例如具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000的分子量的蛋白质)；大核酸(例如具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000的分子量的核酸)；或大多糖(例如具有超过2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、或10,000的分子量的多糖)。术语代谢物包括信号分子和化学反应中的中间体，该化学反应将来源于食物的能量转变成可利用的形式，包括但不限于：糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、抗氧化剂、维生素、辅因子、脂质、在细胞过程中形成的中间体、以及其它小分子。
在本发明的一个实施例中，检测到的代谢物可为选自以下的小分子生物标记：由氨基酸代谢生成的化合物；由二肽代谢生成的化合物、由核酸代谢生成的化合物；在脂质代谢中生成的化合物；在碳水化合物代谢中生成的化合物；在能量循环中的中间体、以及酶辅因子。在另一个实施例中，代谢物可包括在表1a-1e、2a-2b、3a-3b、4、5a-5b、6和7a-7b中列出的一种或多种化合物。
术语“皮肤”是指脊椎动物的外蒙皮，其由两层细胞组成，分别是厚的内层(真皮)和薄的外层(表皮)。表皮是皮肤外部的非血管层。它由从内到外的五层上皮构成：(1)基底层(表皮基底层)；(2)棘层(表皮棘层)；(3)颗粒层(表皮颗粒层)；(4)透明层(表皮透明层)；和(5)角质层(表皮角质层)。
术语“样品”指来自受试者皮肤或表皮的任何制备物。
术语“非侵入性”指不需要将器械或装置插入皮肤或身体孔口进行诊断或治疗的过程。
术语“粘合剂装置”指通过将粘合剂或粘附材料用于基底以移除皮肤的表皮层的装置。例如，可使用粘合带诸如(聚丙烯酸酯粘合剂；CuDerm；Dallas TX)、Durapor、SebutapeTM(丙烯酸类聚合物膜；CuDerm；Dallas,TX)、TegadermTM、Duct胶带(333Duct Tape,Nashua胶带产品)、/>Tape(3M Scotch 810,St.Paul,Minn.)、DiamondTM(The Sellotape Company；Eindhoven,the Netherlands)、SentegaTM(聚丙烯胶带，Sentega Eiketten BV,Utrecht,The Netherlands)来给皮肤取样。所述粘合剂可为任何常用的压敏型粘合剂或那些在皮肤上快速固化的粘合剂(诸如氰基丙烯酸酯)。所述粘合剂可位于柔性的或固体的背衬上以使取样更容易。恒压装置(例如Desquame PressureInstrument,CuDerm；Dallas,TX)可用于在取样期间向粘合剂装置施压。
来自组织的样品可通过本领域熟知的任何数目的装置进行分离。用于分离样品的侵入性方法包括使用针(例如在血液取样期间)、以及不同组织的活组织检查、起泡技术和激光穿孔。由于这些技术的侵入性本质，存在提高的死亡率和发病率风险。此外，侵入性技术能够非故意地影响皮肤状态，这可能导致不精确的或虚假的结果。此外，侵入性技术难以对大群体实施。侵入性技术可能导致受试者不适并可能导致感染或其它副作用的风险增大。本发明提供用于测量皮肤的小分子的非侵入性方法。
术语“客观地”指无成见或偏见的。另选地，任何专家或自我评估本质上是“客观的”。
术语“归一化”和/或“归一化的”指一组头皮屑患者接近正常群体状态的程度。
术语“标准化”和/或“标准化的”指相对于在对应的粘合剂或粘合剂制品上测得的蛋白质的量的小分子值。非限制性实例将为ng小分子/μg可溶解蛋白质。
术语“基线”指在研究开始时收集的信息，从中测量研究中存在的变化。基线样品可来自头皮屑患者或无头皮屑患者。
在本发明的另一个实施例中，存在许多可使用的另选的“非侵入性”取样方法。
SebutapeTM：这是一种非侵入性方法，其中SebutapeTM(丙烯酸类聚合物膜；CuDerm；Dallas,TX)仅有非常轻微的粘性，并且可被施用并在不引起不适的情况下从甚至看得见红肿的皮肤移除。通过这种技术回收/测定的生物标记已经包括蛋白质(例如细胞因子)、肽(例如神经肽)、和小分子(例如一氧化氮)介质。在历史上，制造并售卖这种胶带用于皮脂收集并且因此能够用于脂质分析。
胶带是聚丙烯酸酯粘合剂，也由CuDerm制造。它可用于回收与SebutapeTM相同的生物标记，但是也移除某些表皮结构蛋白质(例如角质、包膜素)。杯擦洗(Cup Scrubs)：杯擦洗(Cup Scrubs)通常在缓冲液和非离子表面活性剂的存在下直接从皮肤表面提取蛋白质。杯擦洗(Cup Scrubs)主要用于回收可溶解的生物标记诸如细胞因子，但是也可用于回收小的有机分子。从杯擦洗中能够回收并定量比胶带剥除法多得多的细胞因子。这可能是由于多个原因。(a)由于存在洗涤剂并且它们是液体，杯擦洗法最可能地取样与胶带剥除法不同的蛋白质组。(b)用杯擦洗法，不必在收集样品后进一步提取细胞因子，因为它们已经存在于溶液中。
毛发拔除：拔除毛发是通常使用镊子从拔除对象身上通过机械拔出去除人或动物毛发的方法。毛发拔除的毛囊区域通常在缓冲液和非离子表面活性剂存在的情况下进行提取以回收可溶解生物标记诸如细胞因子，并且也能够用有机溶剂提取以回收小的有机分子。
动物(即，狗)收集方法：D-SquameTM胶带样品从狗皮肤上通过分开它们的毛皮(无剃刮)来收集。可从胶带中分析与皮肤炎症、分化和屏障完整性相关的多种生物标记，其包括总蛋白质、可溶解蛋白质、皮肤多个分析物特征(皮肤MAP)、皮肤细胞因子和角质层脂质(神经酰胺、胆固醇、脂肪酸)。
在本发明的一个实施例中，本发明提供非侵入性地获取用于分离小分子的样品的方法和分析。
在一个实施例中，粘合剂装置的使用可用于实现此类取样。在准备此类用于头皮屑取样的取样研究中，在基线随访中有资质的分级人员将完成每个受试者的头皮附着鳞屑评分(ASFS)分级并且最高的片状剥落八分体将被鉴定用于胶带剥除取样。最高的片状剥落八分体将被进行基线取样并且在用产品治疗期间和之后的不同时间点取样。将在每个时间点上从每个受试者中收集胶带剥除样品(例如基线且在第三周)。
按需重复所述胶带剥除取样过程附加的若干次，在之前的取样区域顶部的相同位置处放置各胶带盘。在收集样品后将/>胶带置于标记板中的适当标记的孔中。
在取样后进行提取和定量程序。在本发明的一个实施例中，定量来自胶带样品提取物的小分子可经由LC/MS/MS或GC/MS/MS分析进行。在本发明的这一实施例中，在准备代谢物表达谱技术时进行样品提取。
将胶带样品板从-80℃冷冻机中取出，在样品收集后它们被储存在冷冻机中并置于干冰上。将胶带条插入预先标记的聚丙烯收集管中，粘合面朝内。将包含甲醇和水的提取缓冲液加入每个收集管，并且随后在冰上超声处理15分钟进行提取。如果需要的话，将另外的胶带置于包含提取溶液的收集管中，并且重复提取过程作为浓缩样品的手段。从胶带剥除物中分离各提取溶液并将每个样品的等分试样置于预先标记的聚丙烯收集管中，并冻存在-80℃下用于代谢物表达谱分析。另一份等分试样指定用BCATMProteinAssay Kit进行可溶解蛋白质分析。对于这一分析，取出由甲醇和水组成的等分试样在柔和氮气流下干燥。将样品重悬在合适的含水缓冲液(例如PBS/SDS(1X PBS+0.2％SDS)中并分析可溶解蛋白质。
在提取过程后，代谢物表达谱技术如前文所述进行(Lawton等人，2008)。通过GC/MS/MS和LC/MS/MS以阳离子和阴离子模式分析提取物。色谱分离后，进行全扫描质谱和MS/MS光谱以记录并定量存在于样品中的所有可检测到的离子。具有已知化学结构的代谢物可通过匹配离子的色谱分离保持指数和质谱裂解标记与由可靠标准代谢物产生的参考库条目(它们的分析过程与实验样品相同)进行鉴定。Welch’s Two Sample t-tests和matched-pair t-tests用于分析数据。对于所有分析，缺失值(如果有的话)用针对特定化合物观察到的最小值进行估算(在区间归一化后加上估算值)。对天然对数转化的数据进行统计分析以减小数据中任何潜在异常值的影响。对来自表顶部列出的不同组的各生物化学平均值进行Welch’s Two Sample t-test比较，并且使用统计分析软件程序：Array Studio(Omicsoft，Inc)或来自Free Software Foundation,Inc.的“R”中的任一者或两者进行计算。
方法延伸
虽然本文描述了使用的确切过程，但在上述多个步骤中可使用许多替代方法，它们是逻辑延伸。用于从胶带剥除物中分离小分子的提取溶剂可为任何合适的含水的、有机物或有机物/含水混合物，其提供合适的回收。由于LC/MS/MS和GC/MS/MS的高选择性和敏感度，一般认为它们是用于定量分析生物基质中小的有机分子的最先进方法。然而，可使用提供所需的敏感度和选择性的任何分析技术和/或其它方法。例如，已经使用了用于评估小分子生物标记的其它方法，所述方法包括：毛细管电泳、超临界流体和其它色谱分离技术和/或它们的组合，它们具有多种不同的检测模式(例如UV/Vis、荧光、ELSD、CAD、MS和MS/MS。类似地，也已经使用无分离技术的仪器方法，包括核磁共振光谱学、质谱仪、电化学和荧光测定法。此外，也已经使用配体结合方法诸如竞争性和非竞争性酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)或者其它标记方案。在小分子分析中基于酶的测定法有长期的应用历史。使用基于细胞或组织的生物测定方法也可用作检测手段。在本发明的一个实施例中，毛发拔除引起的小分子定量可利用与用于胶带剥除样品的方法相同的碱性提取和分析方法进行。
胶带剥除提取物的蛋白质测定：
用上述适用方法测得的皮肤胶带剥除物样品上的小分子代谢物含量可用胶带剥除提取物中存在的蛋白质的量进行标准化。通过用小分子含量除以胶带剥除提取物中的蛋白质的量完成标准化。
胶带剥除提取物中的蛋白质的量或用于测定皮肤小分子含量的等同基质可使用文献中描述的多种蛋白质测定方法进行测定。此类方法的实例包括总氮测定、总氨基酸测定和基于任何比色、荧光、和化学发光方法的蛋白质测定。这些方法可涉及或可不涉及在蛋白质测定前进一步制备胶带剥除提取物的样品。下文给出了胶带剥除提取物中用于蛋白质测定的特定方法的非限制性实例。对蛋白质测定方法、它们的适用性和限制的综述在Thermo Scientific Pierce Protein Assay Technical Handbook中进行了描述，其可从下文的链接中下载，以引用方式并入本文。www.piercenet.com/Files/1601669_PAssayFINAL_Intl.pdf。关于蛋白质测定的其它信息可见于Redinbaugh，M.G.和Turley，R.B.(1986)，Adaptation of the bicinchoninic acid protein assay for use withmicrotiter plates and sucrose gradient fractions.Anal.Biochem.153，267-271，以引用方式并入本文。
将用BCATMProtein Assay Kit提取并分析取样自人皮肤的粘合带的蛋白质含量。将用常规的提取缓冲液提取取样自人皮肤的胶带剥除物。在提取后，将胶带提取物的等分试样转移到96-孔聚丙烯深孔板中并储存在2-8℃用于蛋白质测定。
BCATMProtein Assay Kit的作用机制为在碱性介质中由蛋白质将Cu2+还原成Cu1+并由二喹啉甲酸(BCA)敏感选择性比色检测Cu+1。通过一个Cu1+离子螯合两个BCA分子形成的紫色反应产物表现出在562nm波长处的强吸光度。使用酶标仪测量光密度(OD)。提高的牛血清白蛋白(BSA)的浓度(以微克每毫升(μg/mL)表示)在该测定法中用于生成校准曲线。从BSA原液中制备的合适测定QC将用于监控样品分析期间的测定法性能。
在本发明的一个另选的实施例中，可通过直接测量粘合剂或粘合剂制品上的蛋白质来完成蛋白质测定，诸如用850A(CuDerm Corporation,Dallas,Texas)测量蛋白质。
实例
代谢物表达谱小分子作用的基本过程
受试者由有资质的分级人员进行评估以确定他们的头皮状态。头皮屑受试者由有资质的分级人员进行评估以确定他们的可见片状剥落水平。对无头皮屑的健康头皮受试者进行基线评估以确定各生物标记的归一化水平。在这个研究中，有60个无头皮屑受试者，对它们进行基线评估。119个头皮屑患者用包含1％的ZPT的去头皮屑洗发剂治疗，115个头皮屑患者用包含1％的硫化硒的去头皮屑洗发剂治疗。对他们进行基线评估，并且在使用产品三周后再次评估。受试者在用去头皮屑洗发剂治疗前，用常规的无调理剂的非去头皮屑洗发剂洗两周。头皮屑受试者用去头皮屑洗发剂(包含1％吡啶硫酮锌或1％硫化硒的洗发剂组合物)治疗三周；从由有资质的分级人员在基线随访上测定的最高片状剥落八分体中收集胶带剥除样品。对于头皮屑受试者，在基线和三周产品治疗后获取头皮胶带剥除物。对于无头皮屑受试者，仅在基线获取头皮胶带剥除物。将胶带保存在-80℃直到进行提取。通过分开毛发，根据需要施用胶带(CuDerm Corporation)并摩擦该胶带来对含头皮屑部位取样。对于无头皮屑受试者，对无片状剥落部位取样。将胶带置于预先标记的无菌12孔板中进行贮藏。
用常规的提取缓冲液通过在冰上超声处理来提取样品。胶带样品提取物的等分试样随后被转移到预先标记的聚丙烯收集管中并冻存在-80℃下以进行代谢物表达谱分析。另一份等分试样指定用BCATMProtein Assay Kit进行可溶解蛋白质分析。对于这一分析，取出由甲醇和水组成的等分试样在柔和氮气流下干燥。将样品重悬在合适的含水缓冲液(例如PBS/SDS(1X PBS+0.2％SDS)中并分析可溶解蛋白质。
在提取后，通过Metabolon,Inc的LC/MS/MS(阳离子和阴离子模式)或GC/MS/MS平台分析样品的代谢物表达谱。化合物的有关定量值随后根据样品体积进行调节，并如上文列出的BCA蛋白质测定法所测定对提取物中的可溶解蛋白质的量进行标准化。对来自去头皮屑洗发剂治疗组的样品进行基线和三周分析，并且对无头皮屑组的样品仅进行基线分析。对代谢物进行检测，并基于在Metabolon化学参考库中匹配的已知化学结构进行鉴定。匹配已知化学结构的代谢物在它们相应的一般生物化学途径中标出。配对T检验用于分析无头皮屑(健康的)、头皮屑基线和经头皮屑治疗的受试者的差异。对经头皮屑治疗的受试者与无头皮屑受试者进行比较以确定在用去头皮屑产品治疗时的归一化程度。
结果
在代谢物表达谱方法和条件下检测胶带剥除物中的总计255种生物化学物质。这些生物化学物质将提供丰富的信息源，从而进一步了解皮肤健康状态。比较无头皮屑受试者与头皮屑受试者的统计分析显示出多种生物化学物质可用于区分健康皮肤与皮肤病症。这些生物化学物质将可用作生物标记用于诊断头皮屑病症。在基线头皮屑受试者和用去头皮屑洗发剂治疗后的头皮屑受试者之间多种生物化学物质发生显著变化。这些生物化学物质将为有用的生物标记，用于测定头皮屑病症的治疗改善程度和完全性。
表1a-1e包含列出的分子，它们在头皮屑和非头皮屑样品之间、以及在用包含吡啶硫酮锌(ZPT)或硫化硒的多种去头皮屑治疗剂治疗三周之前和之后具有任何统计学上的差异。两种治疗剂为有效的去头皮屑制剂，具有不同的去头皮屑活性物质。这组标记物表现出在头皮屑和正常头皮状况之间的差异，并且用于评估去头皮屑治疗的功效。
表2a至表7b列出各生物化学物质基于它们的代谢途径的平均值，以及在头皮屑和非头皮屑之间、去头皮屑治疗之前和之后、以及非头皮屑治疗对头皮屑治疗的比较结果的P值。
头皮过敏是头皮屑患者的常见症状。它很大程度上是由炎症和对微生物的宿主免疫响应引起的。已知炎症能够诱发细胞死亡，这导致包括蛋白质、核酸、脂质、和碳水化合物的所有类型生物分子的显著结构破坏。列出的小分子包括氨基酸、氨基酸代谢中间体(表2a-2b)、二肽(表3a-3b)、嘌呤和嘧啶代谢中间体(表4)，它们被鉴定为皮肤病症生物标记。这些分子的含量在头皮屑受试者中相对于无头皮屑受试者升高，并且在用去头皮屑洗发剂治疗后降低，指示头皮屑病症的改善。这符合相同临床受试者的自我评估数据，他们在用去头皮屑洗发剂治疗后报告出较轻的头皮过敏。这些代谢物可用作皮肤过敏的客观量度。
据信一些生物化学物质可通过产生氧化应激反应来增加炎症。例如，嘌呤代谢可用作炎性响应增加的指示(即，表4)。具体地，次黄嘌呤转化成黄嘌呤以及随后黄嘌呤转化成尿酸需要氧来活化黄嘌呤氧化酶，这是生成H2O2的主要来源。在人皮肤的情况下(例如头皮屑)，增加的氧化应激反应将导致更高水平的嘌呤降解，反映出次黄嘌呤和黄嘌呤含量提高。在从头皮屑患者的头皮获取的胶带剥除物中显著提高的腺苷、鸟嘌呤、鸟苷、肌苷、次黄嘌呤、和黄嘌呤含量表明增加的氧化应激反应，并且因此这些代谢物是用于评估氧化应激反应的有用的生物标记。例如，头皮屑患者的黄嘌呤基线含量相比于无头皮屑组具有13.72倍的黄嘌呤增加(p<0.05)，其中在用ZPT去头皮屑治疗三周后的头皮屑患者的黄嘌呤含量相比于基线显著减少(0.16倍变化(即，84％的减少)，p<0.05)，并且相比于无头皮屑组无显著不同，表明头皮屑病症已经得到改善。用硫化硒进行的另一个去头皮屑治疗具有与用ZPT治疗相似的黄嘌呤倍数变化模式。对于硫化硒治疗组，头皮屑患者的黄嘌呤基线含量相比于无头皮屑组具有15.96倍的黄嘌呤增加(p<0.05)，其中在用硫化硒去头皮屑治疗三周后的头皮屑患者中的黄嘌呤含量相比于基线显著减少(0.15倍变化(即，85％的降低)，p<0.05)。当比较经头皮屑治疗的受试者与健康受试者的黄嘌呤含量时，倍数变化从用ZPT治疗前的13.72减少到治疗后的2.19，并且从用硫化硒治疗前的15.96减少到治疗后的2.37。这代表显著的治疗后归一化。
脂质代谢中间体
脂质具有多种生物学功能并且这也反映在它们的代谢模式中。许多脂质显示在头皮屑受试者和无头皮屑受试者以及用去头皮屑洗发剂治疗过的头皮屑受试者之间的显著差异(表5a-5b)。观察到的总体趋势是头皮屑受试者比无头皮屑受试者有更高的脂肪酸含量，并且头皮屑受试者在用去头皮屑洗发剂治疗后脂肪酸含量降低。例如，亚油酸在头皮屑受试者中显著高于无头皮屑受试者(ZPT和硫化硒基线头皮屑组分别展示出比非头皮屑组提高了2.45和1.6倍)。在用去头皮屑洗发剂治疗后，头皮屑患者中的含量降低导致在与基线头皮屑含量进行比较时，用ZPT洗发剂治疗情况下0.18的倍数变化(即，82％的降低)和用硒洗发剂治疗情况下0.22的倍数变化(即，78％的降低)；二者具有统计学上的差异。这一观察结果有点违反直觉，因为结构脂质通常在头皮屑受试者中减少，这是屏障削弱的结果。这一观察结果的一个合理的解释是由于在头皮表面取样，主要取得的样品是皮脂中的甘油三酯，它们被转化成脂肪酸，用作头皮微生物区系(鳞斑霉属(Malassezia))的食物来源。另外的一个解释是过多的脂肪酸是修复细胞损伤、包括恢复皮肤屏障完整性所必需的。因此，降低的脂肪酸含量指示头皮健康的改善以及有效的去头皮屑洗发剂的功能。
多种脂质化合物对于炎性信号在细胞和组织中的启动和传播是重要的。这些脂质信号炎性调节剂由磷脂酶A2释放自质膜磷脂。花生四烯酸的释放可由组织损伤引发，组织损伤在炎性过程的早期阶段增加。用1％的ZPT或1％的硫化硒洗发剂治疗过的头皮屑受试者具有比头皮屑基线显著更低的花生四烯酸含量。对于ZPT，观察到0.56的倍数变化(即，44％的降低，P值为<0.05)，并且对于硫化硒，观察到0.30的倍数变化(即，70％的降低，P值为<0.05)，这与头皮屑病症的炎性表型的改善一致。
脂质对头皮健康重要性的另外的证据是检测到氧化形式的亚油酸，脂肪酸13-和9-羟基十八碳二烯酸(13-HODE，9-HODE)。HODE的含量在头皮屑患者中比无头皮屑患者相对更高(倍数变化：对于ZPT洗发剂为1.93，对于硒洗发剂为1.41)。在用去头皮屑洗发剂治疗三周后，13-HODE+9-HODE的含量与匹配的基线样品相比有显著变化。13-HODE+9-HODE的倍数变化对于ZPT治疗为0.26(即，74％的降低，0.05≤p≤0.10)，并且对于硫化硒治疗为0.34(即，66％的降低，p≤0.05)。据信提高的脂质过氧化是氧化应激反应影响质膜升高的标志。包括来源于亚油酸氧化的13-HODE、9-HODE的一羟基脂肪酸的形成指示脂质过氧化和氧化应激反应。用去头皮屑洗发剂治疗头皮屑导致13-HODE/9-HODE与头皮屑样品相比显著减少。这符合较高水平的嘌呤降解的观察结果，并且共同表明头皮屑表型显示炎性和氧化应激反应组分，以及用去头皮屑洗发剂治疗提供治疗改善。
表现出不同类型的代谢模式、对于头皮健康重要的脂质的另一个示例是棕榈酰基乙醇酰胺(PEA)。与13-HODE/9-HODE不同，用去头皮屑洗发剂治疗过的头皮屑患者显示比头皮屑患者显著更高的(PEA)含量。PEA含量在头皮屑和无头皮屑组之间大致相同(ZPT倍数变化：1.44；硫化硒倍数变化：0.79；二者无统计学上的差异)。然而，在用ZPT治疗三周后，PEA含量对于ZPT洗发剂上升3.08倍，并且对于硫化硒洗发剂上升6.69倍，p≤0.05。同样地，两种去头皮屑治疗显著提高了PEA含量在三周治疗和无头皮屑组之间的倍数变化(对于ZPT和硫化硒分别为4.43和5.26倍，p≤0.05)。PEA作为一种内源性脂肪酸酰胺，已显示具有广泛多种生物学功能，涉及慢性疼痛、瘙痒和炎症。作为治疗机制的一部分，有效的去头皮屑洗发剂治疗可促进PEA的抗炎和止痒功能。这符合相同临床受试者的自我评估数据，他们在用去头皮屑洗发剂治疗后报告较轻的头皮过敏和较轻的头皮瘙痒(表8)。观察到在三周治疗和无头皮屑组之间的显著倍数变化数据(对于ZPT，倍数变化为4.43，并且对于硫化硒，倍数变化为5.26，二者p≤0.05。)假定在第三周的治疗时间点，头皮屑头皮仍表现出一些炎症，则需要额外量的PEA。
表6列出的代谢物涉及碳水化合物及它们的代谢物、能量循环中的中间体、和酶辅因子。显示的是在头皮屑和非头皮屑样品之间、或者在用包含吡啶硫酮锌(ZPT)或硫化硒的多种去头皮屑治疗剂治疗三周之前和之后展示显著差异的生物分子，两种治疗为具有不同去头皮屑活性物质的有效去头皮屑制剂。结果表明在头皮屑和正常头皮状况之间以及在头皮屑基线和治疗后的头皮屑病症之间的差异，并且用于评估去头皮屑治疗的功效。
代谢组学技术包括两个主要的技术方面：代谢物分离和代谢物鉴定。虽然一些代谢物和小分子化合物的名称此时未知，但对于鉴定来自受试者的生物样品的代谢物或小分子化合物来说，此类名称不是必需的，因为“未命名”化合物已经通过分析技术进行充分的表征，从而允许此类鉴定。所有此类“未命名”化合物的分析表征在表7a-7b中列出。此类“未命名”代谢物和小分子化合物在本文中如下命名：使用命名“X”，后接一个特定的化合物编号。表7a-7b列出45种代谢物，它们具有在头皮屑和非头皮屑样品之间、或者在用包含吡啶硫酮锌(ZPT)或硫化硒或两种治疗剂的多种去头皮屑治疗剂治疗三周之前和之后的统计学上显著的差异。这些化合物也可用作用于区分头皮屑与非头皮屑的标记物和/或用于去头皮屑洗发剂治疗的功效指示剂。
为了评估与头皮屑相关联的病征和症状，使用调查问卷。这一信息将提供头皮健康状态的独立量度。对于自我评估的问题，头皮屑受试者回答下文列出的四个问题，这些问题与他们基线及使用产品三周后的头皮屑病征和症状的严重程度有关。受试者使用的标度根据下文描述表示为0至4。
标度：
1.自我评估标度(0-4)
0＝无，1＝轻度，2＝中度，3＝严重，4＝非常严重
2.专家分级标度(0-80)
头皮屑≥24
非头皮屑≤8
自我评估问题：
你给你今天的瘙痒严重程度评几分？
你给你今天的过敏严重程度评几分？
你给你今天的干燥严重程度评几分？
你给你今天的片状剥落严重程度评几分？
小分子生物标记与自我评估/临床症状的关系
临床受试者报告了他们在用去头皮屑洗发剂治疗三周后头皮屑病征和症状的减少(表8)。专家分级人员也报告了在用去头皮屑洗发剂治疗后片状剥落评分的显著降低。这些结果符合头皮健康的总体改善。这些相同受试者观察到的生物化学分子也符合头皮健康的总体改善。例如，过敏与炎症和宿主免疫防御反应高度相关。本发明揭示的多种分子诸如高含量的游离氨基酸、二肽、核酸以及脂质涉及头皮屑受试者体内的炎性信号，这强力支持在头皮屑患者遭受的过敏与这些炎症分子指示剂之间存在联系。这种直接关联已经提供了过敏的客观测量。客观测量常用于评估皮肤病症并且通常涉及专家评估和/或自我评估。虽然这些类型的测量是有用的，但是它们实质上存在评估员的偏好。客观测量不存在偏好的可能，因此提供较严谨的科学数据。
总体上，这些小分子生物标记可用作客观量度以允许更详细的头皮屑病症的病理生理描述，以及用作指示头皮屑治疗方案程度和完成度的相关量度。
在特定实施例中，此类性能评估可对于比较在用组合物治疗前后受试者的皮肤健康状态有利。例如，如果受试者转换并保持某一去头皮屑组合物或治疗方案，一些去头皮屑组合物可发挥更快的见效速度，这将被受试者体会到。允许客观测量受试者的特定皮肤健康有益效果的评估可允许在用特定去头皮屑组合物或治疗方案治疗前以及在受试者转换到特定去头皮屑组合物或治疗方案后比较受试者的状态。另外，此种评估可用作一种支持认证工具，其支持特定治疗或治疗方案声称提供的特定皮肤健康有益效果。例如，如果一种特定组合物或治疗方案宣称其将减少瘙痒症状，如本文所公开的评估可用于支持声称的具体健康有益效果，示出受试者的瘙痒不适情况已经减少了。可得益于去头皮屑组合物和治疗方案的皮肤健康非限制性状况包括瘙痒、片状剥落、过敏、皮肤屏障完整性、干燥、氧化应激反应和氧化损伤、自身防御、天然保护。
也可将许多分析的结果作为营销或广告信息来使用，以促进特定产品、产品组合和技术的有效性。可放置在产品包装上的可由本发明证实的广告宣传语的实例包括但不限于确立宣传语(例如，“临床证明”或“测试显示”)、用前和用后宣传语(例如，“使用后头皮屑减少到50％”)、单体宣传语、比较宣传语、因数宣传语(例如，“3倍的头皮屑减少量”)、以及预防和治疗宣传语。例如，产品包装可提及分析并可展示产品的经客观证明的有效性或比较信息。另外，还可将分析数据用于与不同的治疗方案相关的临床信息，所述治疗方案可与或可不与不同的产品或产品组结合使用。
另一个实施例包括其中标准化生物标记在施用吡啶硫酮锌洗发剂后在与施用前的生物标记的基线含量进行比较时存在变化。在另一个实施例中，标准化分子生物标记在施用硫化硒洗发剂后在与施用前的生物标记的基线含量进行比较时存在变化。在另一个实施例中，可测量生物标记，其确定与治疗后的正常群体相比皮肤健康发生至少5％的改善。在另一个实施例中，与治疗后的正常群体相比皮肤健康发生至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％和更高至100％的改善。在另一个实施例中，在头皮屑和非头皮屑(无治疗)之间可存在至少5％的差值。另外，在头皮屑和非头皮屑之间可存在至少10％的差值，在头皮屑和非头皮屑之间可存在至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，以及更高至100％或更高的差值。
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确值。相反，除非另外指明，每个这样的量纲旨在表示所述值以及该值附近的函数等效范围。例如，所公开的量纲“40mm”旨在表示“约40mm”。
在发明详述中所有引用文献的相关部分均引入本发明以供参考。任何文献的引用不可理解为是对其作为本发明的现有技术的认可。当本文献中术语的任何含义或定义与引入本文以供参考的文献中相同术语的任何含义或定义冲突时，将以赋予本文献中那个术语的含义或定义为准。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，但是对那些本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的实质和范围的情况下可作出许多其它的改变和变型。因此，所附权利要求中旨在包括属于本发明范围内的所有这些改变和变型。
表1a：小分子的倍数变化
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*p≤0.05，比率<1
**0.05≤p≤0.10，比率≥1
***p≤0.05，比率<1
****0.05≤p≤0.10，比率≥1
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表8：自我评估和专家分级结果
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Claims (13)

1.一种检测皮肤细胞样品中的小分子生物标记的含量的物质在制备用于诊断受试者的皮肤健康的非侵入性方法的产品中的用途，所述非侵入性方法包括：
a)收集来自所述受试者的皮肤细胞样品；
b)检测在所述皮肤细胞样品中的所述小分子生物标记的含量；
c)基于检测到的小分子生物标记的所述含量诊断所述受试者是否具有头皮屑，其中所检测到的小分子生物标记为次黄嘌呤。
2.根据权利要求1所述的用途，所述方法包括：
a)将粘合剂制品施用到哺乳动物的上皮；
b)使上皮细胞粘附到所述粘合剂制品；
c)从所述哺乳动物的上皮移除所述粘合剂制品；
d)使用用于提取的标准实验室方法制备所述粘合剂制品；
e)从粘附到所述粘合剂制品的所述上皮细胞中提取小分子生物标记，其中所提取的小分子生物标记为次黄嘌呤；
f)从粘附到所述粘合剂制品的所述上皮细胞中测量所述小分子生物标记；
g)测定相比于基线样品所述上皮细胞中的所述小分子生物标记的量。
3.根据权利要求1所述的用途，所述方法包括：
a)收集来自所述受试者的皮肤细胞样品；
b)检测在所述皮肤细胞样品中的小分子生物标记的含量；
c)比较在所述皮肤细胞样品中检测到的小分子生物标记的所述含量与小分子生物标记基准含量从而产生差异含量，其中所检测到的小分子生物标记为次黄嘌呤。
4.根据权利要求1所述的用途，所述方法包括：
a)收集来自所述受试者的上皮细胞样品；
b)检测在所述上皮细胞样品中的小分子生物标记的含量；
c)比较在所述上皮细胞样品中检测到的小分子生物标记的所述含量与小分子生物标记基准含量从而产生差异含量，其中所检测到的小分子生物标记为次黄嘌呤。
5.根据权利要求2所述的用途，其中所检测到的小分子生物标记的含量通过用所述小分子生物标记的量除以所述粘合剂制品上的蛋白质的量进行标准化。
6.根据权利要求2或5所述的用途，其中小分子生物标记含量的水平在与小分子生物标记的基线含量进行比较时存在变化。
7.根据权利要求5所述的用途，其中标准化小分子生物标记在施用抗真菌毛发治疗后，在与所述施用前的小分子生物标记的基线含量进行比较时存在至少5％的偏离基线的变化。
8.根据权利要求5所述的用途，其中标准化小分子生物标记在施用去头皮屑洗发剂后，在与所述施用前的小分子生物标记的基线含量进行比较时存在至少5％的减少。
9.根据权利要求5所述的用途，其中标准化小分子生物标记在施用吡啶硫酮锌洗发剂后，在与所述施用前的小分子生物标记的基线含量进行比较时存在至少5％的减少。
10.根据权利要求5所述的用途，其中标准化小分子生物标记在施用硫化硒洗发剂后，在与所述施用前的小分子生物标记的基线含量进行比较时存在至少5％的减少。
11.根据权利要求1或2所述的用途，所述方法为客观测量哺乳动物的症状感知的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将粘合剂制品施用到哺乳动物的上皮；
b)使上皮细胞粘附到所述粘合剂制品；
c)从所述哺乳动物的上皮移除所述粘合剂制品；
d)使用用于提取的标准实验室方法制备所述粘合剂制品；
e)从粘附到所述粘合剂制品的所述上皮细胞中提取小分子生物标记；
f)从粘附到所述粘合剂制品的所述上皮细胞中测量小分子生物标记，并且；
g)测定相比于基线样品所述上皮细胞中的小分子生物标记的量。
12.根据权利要求1或2所述的用途，其中存在小分子生物标记偏离基线含量的减少，所述减少与症状感知的降低成正比例。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述皮肤细胞样品为上皮细胞样品。
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