CN112834684A - 基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,针对麻黄、苦杏仁、炙甘草、桂枝、泽泻、白术、柴胡、黄芩、生姜、紫菀、款冬花、射干、细辛、枳实、陈皮、藿香等成分的各种展开剂,进行组合测试,以实现少数鉴别展开剂组即可同时检测多种中药成分,在保证鉴定效果的基础上以优化和简便生产的过程。本发明在确定鉴别展开剂组的情况下,进一步调整和优化试剂萃取参数等工艺参数,并在不同质控环境下验证所优化的展开剂的稳定性和重复性。本发明具有简化质量检测工艺、保留精确定量分析的效果、提高检测效率的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,具体是为制备“清肺排毒汤” 的工艺和制剂提供所涉及中药材的鉴别、工艺参数的控制、成品质量分析的质量控制方法, 以及涉及根据该质量控制方法所生产清肺排毒汤的方法。
背景技术
清肺排毒汤来源于中医经典方剂组合,包括麻杏石甘汤、射干麻黄汤、小柴胡汤、五苓 散,性味平和。该方的主要药物组成是:麻黄9g、炙甘草6g、杏仁9g、生石膏15~30g(先煎)、桂枝9g、泽泻9g、猪苓9g、白术9g、茯苓15g、柴胡16g、黄芩6g、姜半夏9g、 生姜9g、紫菀9g、冬花9g、射干9g、细辛6g、山药12g、枳实6g、陈皮6g、藿香9g。
为了对中药组分进行有效地质量监控,必须对原料成分进行鉴别和有效含量的测定。其 中,薄层鉴别法是药物质量标准建立中常用的方法,鉴别时将适宜的固定相涂抹在玻璃板、 塑料或铝片上,从而形成均匀的薄层,展开后根据比移值(Rf)与适宜的对照物按同法所得 的色谱图的比移值(Rf)进行对比,从而完成药品的鉴别、含量的测定。
《中国药典》规定了在进行薄层鉴别时,应分别吸取测试药和标准对照品,分别点于同 一硅胶G薄层板上,在对应的鉴别展开剂上,进行展开,取出,晾干,然后喷显色剂。只有 当测试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的颜色斑点,才可认定所生产的测 试药品中含有对应的药物活性成分。
例如,对于所制备的中药颗粒中,《中国药典》规定鉴别麻黄成分以氯仿-甲醇-浓氨水 (20∶5∶0.5)作为展开剂。但现有文献中,张素华(薄层扫描法测定桂麻合方中麻黄碱,2007) 报道了氯仿-甲醇-浓氨水(10∶2∶0.1)展开效果较好,麻黄碱的Rf值为0.35,分离良好。张君 (“风寒感冒颗粒麻黄薄层色谱鉴别方法研究”,2011)报道了以甲醇:乙酸乙酯:氨水(5:15: 2)为展开剂。
《中国药典》规定鉴别枳实成分以正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)作为展开剂。但现有文 献中,刘振华(枳实消痞丸的薄层色谱鉴别,2010)报道可以以环已烷:丙酮=10:3为展开剂。
《中国药典》规定鉴别黄岑成分以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10:3:1:2)作为展开剂。 但现有文献中,蒋宇(黄连上清片中黄芩的薄层鉴别与黄芩苷的含量测定,2018)报道了以 乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶7∶1∶1)为展开剂。
《中国药典》规定鉴别生姜成分以石油醚(60~90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2:1:1)作为展开剂。但现有文献中(薄层扫描法同时测定生姜中6-姜醇和6-生姜酚,《国外医学.植物药分册》,2008)报道也可以正己烷-乙醚(4:6,v/v)为展开剂,李丽(薄层扫描法测定生姜中 6-姜醇的含量,2004)报道也可以正己烷-丙酮-乙酸乙酯(100:70:10)为展开剂。
《中国药典》规定鉴别细辛成分以石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯(3:1)作为展开剂。但现有文献中,李艳玲(痛舒片中三七及灯盏细辛的薄层鉴别,2006)报道也可以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:1:1)为展开剂。于玲(灯盏细辛药材的薄层色谱鉴别,2011)报道也可以甲苯-乙 酸乙酯-甲酸(1:7:1)为展开剂。
《中国药典》规定鉴别射干成分以三氯甲烷-丁酮-甲醇(3:1:1)作为展开剂。但现有 文献中,陆汉豪(射干及其混淆品鸢尾的薄层鉴别,1996)报道也可以苯:乙酸乙酯(8:5)为展开剂;黄明生(射干、川射干、白射干薄层色谱及含量测定研究,1997)报道也可以氯仿-甲醇-甲酸(10∶1∶0.1)为展开剂。
《中国药典》规定鉴别桂枝成分以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(17:3)为展开剂作为展开剂。但现有文献中,袁祥慧(五苓片中桂枝、茯苓的薄层色谱鉴别,2010)报道也可 以环己烷-乙醚-冰乙酸(5:5:0.1)为展开剂。
《中国药典》规定鉴别款冬花成分以石油醚(60~90℃)-丙酮(6:1)为展开剂作为展 开剂。但现有文献中,禄晓艳(款冬花药典质量标准探究,2015)报道也可以选择石油醚(60~ 90℃)-乙酸乙酯(4∶1,v/v)为新的展开体系;并与药典提供的石油醚-丙酮(6∶1,v/v)展开 体系进行了比较,其中前者为单次展开,后者为同向二次展开。
《中国药典》规定鉴别陈皮成分以乙酸乙酯-甲醇-水(100:17:13)为展开剂,展至3cm, 取出,晾干,再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)的上层溶液为展开剂,二次展开, 展至约8cm。
《中国药典》规定鉴别紫菀成分以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(9:1)为展开剂。但现有文献中,丁锤(3种来源藏紫菀药材的形态学与薄层色谱鉴别研究,2015)报道以95%乙醇-甲酸-水(2:0.15:1)为展开剂。王绍忠(清热利咽合剂中麻黄、甘草、紫菀、麦冬的 薄层色谱鉴别,2006)报道以石油醚(60~90e)-醋酸乙酯(9:1)为展开剂。
《中国药典》规定鉴别泽泻成分以环己烷-乙酸乙酯(1:1)为展开剂。但现有文献中, 王秀芹(地黄丸类中成药泽泻薄层鉴别方法研究,2018)报道以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶ 7∶1)或环己烷-乙酸乙酯(1∶1)为展开剂。巩丽萍(泽泻薄层色谱鉴别研究,2006)报道以 环己烷-醋酸乙酯-丙酮(4:2:1)为展开剂。
《中国药典》规定鉴别甘草成分以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)为展开剂。 但现有文献中,李敏(四季感冒片中甘草薄层鉴别方法研究,2015)和李玉平(清肺颗粒中 甘草的薄层鉴别方法研究,2015)中,均报道用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)作为展开剂。
《中国药典》规定鉴别柴胡成分以乙酸乙酯-乙醇-水(8:2:1)为展开剂。但现有文献 中,“薄层色谱法定性鉴别小柴胡颗粒中的柴胡、甘草”报道了以氯仿-甲醇-水(80:25:2)为展开 剂。李云静(解郁安神胶囊中柴胡的薄层色谱鉴别,2017)报道以乙酸乙酯:乙醇:水的比 例为(9:2:1)为展开剂。
《中国药典》规定鉴别白术成分以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(50:1)为展开剂。但现有文献中,欧阳罗丹(白术薄层鉴别方法的改进,2019)报道了以环己烷:异丙醇(20:1,v/v),欧洲药典为乙酸乙酯:庚烷(5∶95,v/v)为展开剂。
《中国药典》规定鉴别苦杏仁成分以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)5~ 10℃放置12小时的下层溶液为展开剂。但现有文献中,李吉来(苦杏仁和桃仁中苦杏仁甙的 薄层扫描测定,1992)报道以水饱和氯仿:甲醇(2:1)为展开剂。“薄层扫描法测定麻黄汤冲 剂中苦杏仁甙含量的研究”报道以正丁醇:醋酸:水(95:5:25)为展开剂。
由此可见,除了不需要进行薄层分析的生石膏成分之外,大部分成分的薄层鉴别方法所 用的展开剂或是成分不同,或是含量不同,因此需要逐一鉴别。
然而,清肺排毒汤是由4种古方合并调整而成,其中药味多达20余种。如果对于成品的 颗粒中的不同药味成分进行逐一鉴别,那么几乎进行20次薄层鉴别试验,这显然不利于快速 生产抗疫药物和同时监控产品质量的需要。
此外,由于清肺排毒汤属于新近摸索确定的药方,暂时没有统一的生产标准,因此各个 厂家根据实际情况进行生产,导致生产工艺各不相同,这可能对于中药制剂的标准化生产和 抗击疫情带来一定的不利影响。
因此,目前需要一种快速和简便对清肺排毒汤的产品质量进行质量监控的方法,以及需 要基于该质量监控方法所带来的规范化生产方法。
发明内容
本发明第一目的是提供一种对清肺排毒汤制剂进行质量检测或监控的方法,步骤包括:
(1)取“清肺排毒汤”颗粒,加水溶解后,加入萃取剂进行萃取,合并萃取液,该方的主 要药物组成是:麻黄9g、炙甘草6g、杏仁9g、生石膏15~30g(先煎)、桂枝9g、泽泻9g、 猪苓9g、白术9g、茯苓15g、柴胡16g、黄芩6g、姜半夏9g、生姜9g、紫菀9g、冬花 9g、射干9g、细辛6g、山药12g、枳实6g、陈皮6g、藿香9g;
(2)将萃取液水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液;另用相同方法平行制备阳性 对照和阴性对照溶液;
(3)分别吸取供试品溶液、阳性对照和阴性对照溶液,分别置于同一硅胶G薄层板上, 在薄层鉴别展开剂上展开,取出;
(4)加入显色溶液,用热风加热至斑点显色清晰,并置于紫外光下检视;
(5)比较供试品、阳性对照、阴性对照的斑点,如果供试品和阳性对照在相应位置上出 现相同颜色斑点,且阴性无干扰斑点,则判断供试品中含有预期与阳性对照质量相同或相近 的药物成分;其中,
对于麻黄和枳实,以正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)上层溶液为展开剂;
对于黄芩和生姜,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10:3:1:2)为展开剂;
对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀,以乙酸乙酯-甲醇-水(100:17:13)为展开剂进行第一次展开后,而后以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)的上层溶液为展开剂进行第二次展开;
对于泽泻,以氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6:3.5:0.5)为展开剂;
对于柴胡和甘草,以三氯甲烷-甲醇-水(13:6:1)为展开剂。
进一步的,对于麻黄和枳实,步骤(1)和(2)加入氨水和用正丁醇萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一另一实施方案中,步骤(4)中喷以0.5%茚三酮乙醇溶液,105℃烘至斑点清晰。在一个具体实施方案中,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶解,加入1ml氨水,用正丁醇萃取2次,每次10ml,合并萃取液, 水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和阴性对照药材 各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,分别加入1ml氨 水,用正丁醇萃取2次,每次15ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照 药材溶液。
进一步的,对于黄芩和生姜,步骤(1)和(2)加入盐酸后,用乙酸乙酯萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案中,步骤(4)中喷以2%香草醛硫酸溶液,105℃烘至斑点清晰。在一个具体实施方案中,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶解,加入1ml盐酸,用乙酸乙酯萃取2次,每次10ml,合并萃取液, 水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和阴性对照药材 各0.3g,加乙酸乙酯20ml,超声波处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣用1ml,残渣用1ml 甲醇溶解作为对照药材溶液。
进一步的,对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀,步骤(1)和(2)加入乙酸 乙酯萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案 中,步骤(4)中在于对照药材色谱相应的位置上,显相同的荧光斑点,喷以三氯化铝试液, 置紫外光灯下检视。在一个具体实施方案中,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶 解,乙酸乙酯萃取2次,每次10ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试 品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和阴性对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分 钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,分别用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水 浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。
进一步的,对于泽泻,步骤(1)和(2)加入石油醚(60~90℃)萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案中,步骤(4)中喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,在紫外光下检视。在一个具体实施方案中,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶解,用石油醚(60~90℃)萃取2次,每次20ml, 合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和 阴性对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml, 用石油醚(60~90℃)萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解 作为对照药材溶液。
进一步的,对于柴胡和甘草,步骤(1)和(2)加入乙酸乙酯或正丁醇萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案中,步骤(4)中喷以1%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液,热风吹至斑点显色清晰,分别在日光和紫外光下 检视。在一个具体实施方案中,所述步骤(2)中取甘草阳性0.5g,加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴 蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。在另一具体实施方案中,取柴胡对照药材1.0g,加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用正丁醇萃取2次,每次20ml, 合并萃取液,用氨试液洗涤2次,弃去,收集正丁醇层,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作 为柴胡对照药材溶液。
进一步的,所述硅胶G薄层板选自德国Merck硅胶G板或青岛海洋化工硅胶G板。在一个优选实施方案中,所述硅胶G薄层板选自德国Merck硅胶G板。
本发明第二目的是提供一种清肺排毒汤的生产方法,步骤包括将二十一味药加水煎煮两 次,滤过,合并煎液,滤液减压浓缩至清膏,加入麦芽糊精适量,干燥或粉碎,制成清肺排 毒汤颗粒,对所制备的颗粒进行质量监控,并根据质量监控结果指导产品规范化生产,其中 该方法包括以下步骤:
(1)取“清肺排毒汤”颗粒,加水溶解后,加入萃取剂进行萃取,合并萃取液;
(2)将萃取液水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液;另用相同方法平行制备阳性 对照和阴性对照溶液;
(3)分别吸取供试品溶液、阳性对照和阴性对照溶液,分别置于同一硅胶G薄层板上, 在薄层鉴别展开剂上展开,取出;
(4)加入显色溶液,用热风加热至斑点显色清晰,并置于紫外光下检视;
(5)比较供试品、阳性对照、阴性对照的斑点,如果供试品和阳性对照在相应位置上出 现相同颜色斑点,且阴性无干扰斑点,则判断供试品中含有预期与阳性对照质量相同或相近 的药物成分;其中,
对于麻黄和枳实,以正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)上层溶液为展开剂;
对于黄芩和生姜,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10:3:1:2)为展开剂;
对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀,以乙酸乙酯-甲醇-水(100:17:13)为展开剂进行第一次展开后,而后以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)的上层溶液为展开剂进行第二次展开;
对于泽泻,以氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6:3.5:0.5)为展开剂;
对于柴胡和甘草,以三氯甲烷-甲醇-水(13:6:1)为展开剂。
进一步的,对于麻黄和枳实,步骤(1)和(2)加入氨水和用正丁醇萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一另一实施方案中,步骤(4)中喷以0.5%茚三酮乙醇溶液,105℃烘至斑点清晰。在一个具体实施方案中,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶解,加入1ml氨水,用正丁醇萃取2次,每次10ml,合并萃取液, 水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和阴性对照药材 各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,分别加入1ml氨 水,用正丁醇萃取2次,每次15ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照 药材溶液。
进一步的,对于黄芩和生姜,步骤(1)和(2)加入盐酸后,用乙酸乙酯萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案中,步骤(4)中喷以2%香草醛硫酸溶液,105℃烘至斑点清晰。在一个具体实施方案中,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶解,加入1ml盐酸,用乙酸乙酯萃取2次,每次10ml,合并萃取液, 水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和阴性对照药材 各0.3g,加乙酸乙酯20ml,超声波处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣用1ml,残渣用1ml 甲醇溶解作为对照药材溶液。
进一步的,对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀,步骤(1)和(2)加入乙酸 乙酯萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案 中,步骤(4)中在于对照药材色谱相应的位置上,显相同的荧光斑点,喷以三氯化铝试液, 置紫外光灯下检视。在一个具体实施方案中,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶 解,乙酸乙酯萃取2次,每次10ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试 品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和阴性对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分 钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,分别用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水 浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。
进一步的,对于泽泻,步骤(1)和(2)加入石油醚(60~90℃)萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案中,步骤(4)中喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,在紫外光下检视。在一个具体实施方案中,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶解,用石油醚(60~90℃)萃取2次,每次20ml, 合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和 阴性对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml, 用石油醚(60~90℃)萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解 作为对照药材溶液。
进一步的,对于柴胡和甘草,步骤(1)和(2)加入乙酸乙酯或正丁醇萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案中,步骤(4)中喷以1%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液,热风吹至斑点显色清晰,分别在日光和紫外光下 检视。在一个具体实施方案中,所述步骤(2)中取甘草阳性0.5g,加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴 蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。在另一具体实施方案中,取柴胡对照药材1.0g,加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用正丁醇萃取2次,每次20ml, 合并萃取液,用氨试液洗涤2次,弃去,收集正丁醇层,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作 为柴胡对照药材溶液。
进一步的,所述硅胶G薄层板选自德国Merck硅胶G板或青岛海洋化工硅胶G板。在一个优选实施方案中,所述硅胶G薄层板选自德国Merck硅胶G板。
进一步的,所述清肺排毒颗粒的制备步骤包括称取以下重量份的中药组分:
加水煎煮两次,每次1小时,滤过,合并煎液,滤液减压浓缩至相对密度1.03~1.05(70℃) 的清膏,加入麦芽糊精适量,干燥,或粉碎,制成颗粒1000g。
进一步的,其中第一次加10倍量水,浸泡0.5小时,煎煮1.0小时;第二次加10倍量水, 煎煮1.0小时,合并煎液,滤过;
进一步的,其中将滤液75℃±5℃减压浓缩,至密度为1.03~1.05(70℃)的清膏,10000rpm/min离心;
进一步的,取上述离心后的清膏,加入适量麦芽糊精(每个处方量制成总量为40g,离心 后的清膏含固量约为处方量10.5%),溶解,混匀,喷雾干燥,得浸膏粉;
进一步的,取浸膏粉,加适量粘合剂(水),沸腾制粒,整粒,制成颗粒1000g;
进一步的,将颗粒分装成10g/袋,复合膜包装。
进一步的,所述质量监控包括对产品的质量进行检测和评价,并判断产品质量是否合格, 从而确定是否继续或中断产品的生产过程,并指导产品规范化生产。在具体的实施方案中, 在完成整粒工序后,随机抽取样品,使用前述展开剂组进行薄层层析鉴别,以确定是否继续 或中断产品的生产过程。
本发明第一原理在于,在《中国药典》公布的多种中药成分的薄层鉴别展开剂的基础上, 进行大胆摸索尝试,舍去不需要或对产品质量影响较小的部分成分的质量监控,针对主要的 麻黄、苦杏仁、炙甘草、桂枝、泽泻、白术、柴胡、黄芩、生姜、紫菀、款冬花、射干、细辛、枳实、陈皮、藿香等成分的各种展开剂,进行组合测试,以实现少数鉴别展开剂组即可同时检测多种中药成分,在保证鉴定效果的基础上以优化和简便质量监控的过程。
本发明第二原理在于,在确定鉴别展开剂组的情况下,进一步调整和优化试剂萃取参数 等工艺参数,并在不同质控环境下(如高温低温、高湿低湿等)验证所优化的展开剂的稳定 性和重复性。
本发明第三原理在于,以上述确定的质量监控的结果,引入清肺排毒汤的生产中,从而 提供能满足产品质量的标准化生产方法。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明参考《中国药典》收载的处方中主要药材的标准、相关中药制剂的有关标准以及 文献资料,进行大胆摸索尝试,舍去不需要或对产品质量影响较小的部分成分的质量监控, 选取不同于《中国药典》推荐的标准方法,针对主要的麻黄、苦杏仁、炙甘草、桂枝、泽泻、 白术、柴胡、黄芩、生姜、紫菀、款冬花、射干、细辛、枳实、陈皮、藿香等成分的各种展 开剂,进行组合测试,以实现少数鉴别展开剂组即可同时检测多种中药成分,在保证鉴定效果的基础上以优化和简便质量监控的过程。
由于清肺排毒汤是今年应对新冠疫情而紧急改造的中药合方,目前没有任何关于该复杂 的合方的TLC法检测质量的相关报道,因此本发明是国内首次进行系统性的TLC检测质量 的发明研究。
虽然TLC法检测中药质量是较为成熟的方法,检测手段较为常规,但面对待检药味数量 如此多,且短时间内急需重大研究突破的质控方法,本发明仍然付出了大量时间、物质,并 创造性进行了分组薄层层析法测试,因此具有很高的技术前瞻性。
本发明通过大量的试验数据证明,《中国药典》的标准方法并不适于检测这种多组分的组 合物的薄层分析,因此需要逐一摸索和验证。因此,发明人采用以下的研究思路进行大量试 验筛选:
对于个别药味仍然使用已有的展开剂,但本发明创造性将该药味(例如黄岑)与其他药 味进行组合,通过研究模式,筛选得到使用同一展开剂能够同时区分多种药味的技术效果;
对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀的多组分,本发明通过大量试验摸索,出 乎意料地发现可以选用二次展开剂系统来清晰的检测以上成分。试验发现,该二次展开剂系 统能一次分析检测6种成分,且各成分彼此不干扰,有效地节省了检测时间和成本;
对于成分相近难以在同一展开剂进行分析的某些组分,本发明通过试验,或是在不增加 额外展开剂组合的情况下,将这些组分分别适用不同的展开剂进行层析鉴定(如陈皮和枳实), 或是通过试验证明这些组分具有同分异构体的高度相似性,从而只需选择分离效果最好的一 种(例如紫菀和白术)即能完成鉴定;
对于泽泻等具有中国药典推荐的展开剂和层析方法,本发明通过试验,发现选用不同的 展开剂,配合改良的供试品,能取得更好的检测效果。
通过以上创造性的筛选思路,并通过大量的对比试验,本发明能够舍去不必要的层析分 离的组分,并能实现全组分的精确定量定性分析。该展开剂系统重复性好,在高温、低温环 境下稳定性高,检测质量高,节省了检测成本和时间,同时能获得稳定的质量检测效果。
此外,本发明的质量检测方法中,涉及大量具体的检测数据点值,虽然导致保护范围较 为狭窄,但是通过各种具体检测数据点值,排除了效果较差或不足的不合格产品,这非常适 合于建立稳定的质量控制标准,符合中药生产的需要。
应当指出的是,本发明舍弃了石膏的检测,以及白术、藿香、杏仁等成分,并提出仅有 5种展开剂组,即可对于13种成分进行质量监控和评价,并建立了足以评价清肺排毒汤20 种成分的质量标准监控方法,有效地提高了生产过程。
附图说明
图1-图12,:实施例3中对现有展开剂系统进行摸索确定的展开结果图;
图13-图21:实施例4中对摸索的展开剂系统进行供试品和对照的验证结果图;
图22-图28:实施例5对确定的展开剂系统分析低温因子的影响的结果图;
图29-图35:实施例6对确定的展开剂系统分析高湿因子的影响的结果图;
图36-图42:实施例7对确定的展开剂系统分析低湿因子的影响的结果图;
图43:实施例8涉及质量检测的制备清肺排毒汤的流程示意图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的保护内容不局限 于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点 都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试 剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明 没有特别限制内容。
实施例1、试验设备和原料
1.仪器与试药
1.1仪器
薄层自动成像仪(CAMAG TLC VISUALIZER2,瑞士CAMAG公司)、薄层板加热板(CAMAG TLC PLATE HEATERⅢ,瑞士CAMAG公司)、电子天平(METTLER ME2002E, 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、电子天平(METTLER MS 204TS,梅特勒-托利多仪 器(上海)有限公司)、超声波清洗器(KQ-300DE,昆山市超声仪器有限公司)、医用离心机 (湘仪H1850湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、恒温水浴锅(HWS-26型)、平面色谱点 样仪(SPDY-1A,南京迈科理特科学仪器有限公司)、硅胶G薄层预制板(青岛海洋化工厂)、 硅胶G薄层预制板(德国Merck)
1.2试药与试剂
黄芩对照药材(批号:120955-201309)、6-姜辣素对照品(批号:111833-201806)、枳实 对照药材(批号:120936-201606)、麻黄对照药材(批号:121051-201606)、苦杏仁对照药 材(批号:121554-201804)、细辛对照药材(批号:121204-201606)、桂枝对照药材(批号:121191-201605)、款冬花对照药材(批号:121449-201816)、射干对照药材(批号: 120994-201801)、陈皮对照药材(批号:120969-201510)、紫菀对照药材(批号:120956-200505)、 柴胡对照药材(批号:120992-201509)、炙甘草对照药材(批号:120904-201519)及泽泻对 照药材(批号:121081-201803)均采购于中国药品生物制品鉴定研究院,其余试剂均为分析纯。
清肺排毒汤颗粒(批号:2020033001、2020033002、2020033003)由广东志道医药科技 有限公司提供。
2.溶液制备
2.1供试品溶液制备
(1)取“清肺排毒汤”颗粒2g,加20ml水溶解,加入1ml氨水,用正丁醇萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为麻黄和枳实供试品溶液。
(2)取“清肺排毒汤”颗粒2g,加20ml水溶解,加入1ml盐酸,用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为黄芩和生姜供试品溶液。
(3)取“清肺排毒汤”颗粒2g,加20ml水溶解,用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀的供 试品溶液。
(4)取“清肺排毒汤”颗粒2g,加20ml水溶解,用石油醚(60~90℃)萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为泽泻的供试品溶液。
(5)取“清肺排毒汤”颗粒2g,加20ml水溶解,用乙酸乙酯或正丁醇萃取2次,每次20ml, 合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为柴胡和甘草的供试品溶液
2.2对照药材、对照品溶液制备
(1)取麻黄、枳实和柴胡对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,分别加入1ml氨水,用正丁醇萃取2次,每次20ml,合并萃取液, 水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为麻黄和枳实对照药材溶液。
(2)取甘草、细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮、紫菀和黄芩等对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮、 紫菀和黄芩对照药材溶液。
(3)取泽泻对照药材0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用石油醚(60~90℃)萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml 甲醇溶解作为泽泻对照药材溶液。
(4)取6-姜辣素对照品,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。
(5)取柴胡和甘草对照药材各0.5g,分别加水适量,用正丁醇萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为泽泻对照药材溶液。
2.3阴性对照药材溶液制备
按照处方比例,称取缺少麻黄、枳实、黄芩、生姜、炙甘草、桂枝、细辛、射干、柴胡、泽泻及款冬花等药味的处方,按标准的制法煎煮,按上述供试品制备方法,分别制备缺麻黄、 枳实、黄芩、生姜、炙甘草、桂枝、细辛、射干、柴胡及款冬花等药味的阴性对照溶液,缺陈皮、枳实双阴性(按陈皮供试品制备方法)以及缺紫菀、白术双阴性对照溶液(按紫菀供试品制备方法)。
实施例2、根据《中国药典》,摸索和筛选不同的提取溶剂(即萃取剂)
参考《中国药典》2015年版一部“甘草”、“黄芩”、“干姜”、“枳实”、“射干”、“细辛”、“陈 皮”、“广藿香”以及“小柴胡胶囊”等鉴别项下方法,考察用乙酸乙酯、正丁醇萃取以及不同处 理方法处理清肺排毒汤颗粒。
1、供试品溶液制备方法
(1)取颗粒供试品(批号:2020033001)加水20ml溶解,加乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并乙酸乙酯萃取液,水浴蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,得供试品溶液1。
(2)取上述剩余水层,加正丁醇萃取2次,每次20ml,合并正丁醇萃取液,水浴蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,得供试品溶液2。
(3)取颗粒供试品(批号:2020033001)加水20ml溶解,加正丁醇萃取2次,每次20ml, 合并正丁醇萃取液,水浴蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,得供试品溶液3。
(4)取颗粒供试品(批号:2020033001)加水20ml溶解,加HCl 1ml,用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并乙酸乙酯萃取液,水浴蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,得供试品溶液 4。
(5)取颗粒供试品(批号:2020033001)加水20ml溶解,用正丁醇萃取2次,每次20ml, 合并正丁醇萃取液,用氨试液洗涤2次,每次20ml,合并正丁醇层,水浴蒸干,残渣加甲醇 1ml溶解,得供试品溶液5。
2、药材对照溶液制备
按处方量,取处方中麻黄9g、炙甘草6g、桂枝9g、泽泻9g、白术9g、柴胡16g、黄芩6g、生姜9g、紫菀9g、款冬花9g、射干9g、细辛6g、枳实6g、陈皮6g、藿香9g,分别加 1000ml水,煎煮1小时,滤过。滤液浓缩至400ml备用。
(1)麻黄药材对照溶液:取上述麻黄煎煮液20ml,用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并乙酸乙酯萃取液,水浴蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,得麻黄药材对照溶液1;剩余水层,加氨水2ml,用正丁醇萃取2次,每次20ml,合并正丁醇液,水浴蒸干,残渣加甲醇1ml使 溶解,作为麻黄药材对照溶液2。
(2)取其余药材煎煮液20ml,分别用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并乙酸乙酯萃取液,水浴蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,分别得各自药材对照溶液1;剩余水层,用正丁醇 萃取2次,每次20ml,合并正丁醇液,水浴蒸干,残渣加甲醇1ml使溶解,作为各自药材对 照溶液2。
实施例3、分析摸索不同的薄层鉴别展开剂
参考《中国药典》2015年版一部“甘草”、“黄芩”、“干姜”、“枳实”、“苦杏仁”、“射干”、 “细辛”、“陈皮”、“广藿香”以及“小柴胡胶囊”等鉴别项下方法,对以下已有的展开剂进行研究 模式:
(1)“甘草”鉴别展开剂:乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2);
(2)“黄芩”鉴别展开剂:甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10:3:1:2);
(3)“干姜”鉴别展开剂:石油醚(60~90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2:1:1);
(4)“枳实”鉴别展开剂:正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5);
(5)“射干”鉴别展开剂:三氯甲烷-丁酮-甲醇(3:1:1);
(6)“细辛”鉴别展开剂:石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯(3:1);
(7)“陈皮”鉴别展开剂:乙酸乙酯-甲醇-水(100:17:13)为展开剂,展至3cm,取出,晾干,再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)的上层溶液为展开剂,二次展开,展至 约8cm;
(8)“广藿香”鉴别展开剂:石油醚(Ⅰ)-乙酸乙酯-冰醋酸(95:5:0.2);
(9)“小柴胡胶囊”鉴别展开剂:氯仿-甲醇-水(13:6:1)。
分组实施例:
实施例3.1以“甘草”鉴别展开剂,分别选取各测试样品和供试品,以乙酸乙酯-甲酸- 冰醋酸-水(15:1:1:2)展开
在Merck预制板的展开结果,如图1所示,其中A为未显色365nm下检视;B为10% 硫酸乙醇显色365nm下检视;C为10%硫酸乙醇显色自然光下检视,T:25℃,RH:60%。
各条带示意:
1.桂枝 2.陈皮 3.细辛 4.射干 5.甘草 6.白术 7.黄芩 8.苦杏仁 9.泽泻 10.紫菀 11.款冬花 12.藿香 13.枳实 14.麻黄 15.生姜 16.柴胡 17.供试液4 18.供试液5
分析表明:
①365nm紫外下显色前白术、紫菀、枳实亮蓝色荧光斑点相互有干扰,枳实、麻黄各有 一个蓝色荧光斑点无干扰。
②该展开剂在硫酸乙醇自然光显色条件下,各成分出现严重的拖尾干扰带,同时365nm 紫外下显色后甘草、白术、紫菀、枳实亮蓝色荧光斑点相互有干扰,枳实有1个蓝色荧光斑 点无干扰,甘草有2个黄虑色荧光斑点无干扰。
综上,现有的甘草鉴别展开剂用于既不能用于TLC分析甘草成分之外,也不能用于TLC 分析甘草成分之外的其他药味,因此不适宜作为联合检测之用的展开剂。
实施例3.2以“生姜”鉴别展开剂,石油醚(60~90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2:1:1)展开
在Merck预制板的展开结果,如图2所示,其中A为未显色254nm下检视;B为未显 色365nm下检视;C为5%香草醛硫酸显色。
条带示意:
1.桂枝 2.陈皮 3.细辛 4.射干 5.甘草 6.白术 7.黄芩 8.苦杏仁 9.泽泻 10.紫菀 11.款冬花 12.藿香 13.枳实 14.麻黄 15.生姜 16.柴胡 17.供试液4 18.供试液5
分析表明:
①射干在254nm下有一个斑点,没有干扰,供试液应选用供试液1,其他药材均不可鉴 别。
②生姜在254nm、365nm下未显示任何结果,仅仅在香草醛显色较为清晰。
③黄岑在254nm、365nm下显示较为明显的单一带,且在香草醛显色条件下能清晰分离 多条无拖尾的干扰带。
综上,虽然该展开剂在香草醛显色条件下可以鉴别生姜,在254nm、365nm下未显示任 何结果,这对于最终的香草醛显示没有指示作用。同时,其他药味或是有重带,或是单带不 突出。
然而,出乎意料的是,该展开剂在香草醛显色条件下能同时鉴别生姜和黄岑,是否预示 着该两种成分可以使用同一展开剂。
实施例3.3以“黄芩”鉴别展开剂,甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10:3:1:2)展开
根据实施例(2)和图2的结果,选用黄芩鉴别展开剂检测黄岑和生姜,同时检测陈皮、 苦杏仁和藿香成分。
在Merck预制板的展开结果,如图3所示,其中A为未显色254nm下检视;B为未显 色365nm下检视;C为5%香草醛硫酸显色日光下检视,T:25℃,RH:60%。
条带示意:
1.黄芩药材对照 2.生姜药材对照 3.陈皮药材对照 4.供试品溶液1 5.供试品溶液2 6.苦杏仁药材对照 7.藿香药材对照
分析表明:
①黄芩、生姜可以鉴别,基本可以分离,其中生姜在5%香草醛硫酸显色日光显示清晰的 单一条带。
②供试品背景干扰较大,供试品处理需要进一步优化。
③陈皮、苦杏仁和藿香存在大量的拖尾干扰带,无法采用这个展开系统。
因此,综合考虑到实施例(2)-(3)的展开剂对于生姜和黄岑的展开效果更好,更符合 减少展开剂组合的发明构思,因此确定生姜的展开剂不使用药典推荐的展开剂,而使用黄岑 的展开剂。
实施例3.4以“枳实”鉴别展开剂:正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)展开
16种药味和两种供试液的层析结果,如图4-1所示,其中A为未显色254nm下检视;B为未显色365nm下检视,T:25℃,RH:60%。
各条带示意:
1.桂枝 2.陈皮 3.细辛 4.射干 5.甘草 6.白术 7.黄芩 8.苦杏仁 9.泽泻 10.紫菀 11.款冬花 12.藿香 13.枳实 14.麻黄 15.生姜 16.柴胡 17.供试液4 18.供试液5
分析表明:
①254nm下检视,枳实和黄岑较为清晰,干扰带少,但其他药味成分较为模糊,且难以 分离
②365nm下检视,意味发现麻黄条带非常清晰,且没有干扰带,但枳实的干扰带较多, 同时黄岑带拖尾严重,预示不适合该展开剂。
因此,需要对枳实进行茚三酮乙醇显色复核,同时分析麻黄成分的复核效果。
结果如图4-2所示,A为未显色254nm下检视;B为0.5%茚三酮乙醇显色自然光下检视, T:25℃,RH:60%。
各条带示意:
1.枳实1(加氨水正丁醇萃取) 2.枳实2(加氨水乙酸乙酯萃取)
3.麻黄1(加氨水正丁醇萃取) 4.麻黄2(加氨水乙酸乙酯萃取)
5.供试品(加氨水氯仿萃取) 6.供试品(加氨水乙酸乙酯萃取)
7.供试品2 8.供试品(加氨水正丁醇萃取)
分析表明:
①茚三酮乙醇显色,相比于加氨水乙酸乙酯萃取,加氨水正丁醇萃取的枳实、麻黄的层 析结果更为清晰,结果均优于加氨水乙酸乙酯或氨水正丁醇萃取的供试品对照结果。
②麻黄的茚三酮乙醇显色结果出乎意料地优于枳实的茚三酮乙醇显色结果。
因此,可以选用枳实的展开剂,同时对麻黄进行展开分析,并且推荐选用茚三酮乙醇显 色作为最终的层析分析手段。
实施例3.5“射干”鉴别展开剂:三氯甲烷-丁酮-甲醇(3:1:1)
结果如图5所示,其中A为未显色254nm下检视;B为未显色365nm下检视,T:25℃,RH:60%。
各条带示意:
1.桂枝 2.陈皮 3.细辛 4.射干 5.甘草 6.白术 7.黄芩 8.苦杏仁 9.泽泻 10.紫菀 11.款冬花 12.藿香 13.枳实 14.麻黄 15.生姜 16.柴胡 17.供试液1 18.供试液2
分析表明:
①在254nm下,仅仅可检测射干和枳实,其他成分或是干扰严重,或是不能显示。
②在365nm下,仅可检测白术和紫菀,但其缺乏254nm下的印证结果。
综上考虑,该射干的展开剂不符合减少展开剂组合的发明构思,因此确定射干的展开剂 不使用药典推荐的展开剂。
实施例3.6“细辛”鉴别展开剂:石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯(3:1)
结果如图6所示,其中A为未显色254nm下检视;B为365nm下检视;C香草醛显色, T:25℃,RH:60%。
1.供试液1 2.桂枝 3.陈皮 4.细辛 5.射干 6.白术 7.供试液1 8.泽泻 9.紫菀10.款冬花 11.藿香 12.枳实 13.供试液1
分析表明:
①在254nm下,仅仅可检测细辛,其他成分或是干扰严重,或是聚集一起没有向前分离 形成独立条带。
②在365nm下,细辛、桂枝、供试液1和紫菀出现分离的独立条带,但其他成分或是干 扰严重,或是聚集一起没有向前分离形成独立条带。
③在香草醛显示条件下,细辛的分离条带不清晰,但其他成分几乎无可见的分离条带。
综上考虑,该细辛的展开剂不符合减少展开剂组合的发明构思,因此确定细辛的展开剂 不使用药典推荐的展开剂。
实施例3.7针对剩余未确定展开剂的成分,选用“陈皮”鉴别展开剂:乙酸乙酯-甲醇- 水(100:17:13)为展开剂,展至3cm,取出,晾干,再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)的上层溶液为展开剂,二次展开,展至约8cm。
结果如图7-1所示,其中A为未显色254nm下检视;B为365nm下检视,T:25℃,RH:60%。
1.供试液1 2.桂枝 3.陈皮 4.细辛 5.射干 6.白术 7.供试液1 8.泽泻 9.紫菀10.款冬花 11.藿香 12.枳实 13.供试液1
分析表明:
①254nm下细辛、射干及款冬花显示比较清楚,基本没有干扰。
②365nm下细辛、款冬花以及桂枝显示比较清楚,基本没有干扰,可以作为鉴别方法。
综上,先用乙酸乙酯-甲醇-水(10:17:13)进行首次展开,能够区分细辛、射干、款冬花、桂枝,这初步预示找到符合减少展开剂组合的层析方式。
因此考虑进行二次展开。
结果如图7-2所示,其中A为未显色254nm下检视;B为未显色365nm下检视;C为三氯化铝试液显色365nm下检视,T:25℃,RH:60%。
条带示意:
1.供试液1 2.桂枝 3.陈皮 4.细辛 5.射干 6.白术 7.供试液1 8.泽泻 9.紫菀10.款冬花 11.藿香 12.枳实 13.供试液1
分析表明:
①在二次展开剂的条件下,作为对照试验的图8-2A和2-B,结果同8-1A和1-B,说明二 次展开剂在254nm和365nm下的展开效果同首次展开剂。
②图7-2C中,在三氯化铝试液显色365nm下检视条件下,紫菀条带虽有一定拖尾,但 主带非常突出分离且无拖尾,非常适于该二次展开剂。
③图7-2C中,桂枝、陈皮、细辛、射干无拖尾的干扰带,分离效果好。虽然款冬花虽有 一定拖尾,但主带非常突出分离且无拖尾,非常适于该二次展开剂。
④图7-2C中,虽然白术有清晰的分离带,但其与紫菀的结果相近,易于造成干扰,需要 分析二者的干扰成分的薄层色谱行为。
⑤图7-2B和7-2C中,陈皮和枳实由于橙皮苷等成分相同,因此二者结果相近,不易使 用同一展开剂。但在该展开剂中,陈皮的相比于枳实,条带分离清晰且无拖尾的干扰带,因 此预示着可以选用该展开剂分析陈皮。
实施例3.8紫菀与白术干扰成分色谱行为考察
根据实施例(7)的结果,分析紫菀和白术的干扰成分色谱行为,并确定合适的展开剂和 待检成分。
结果如图8所示,其中8-A为石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯(3:1);8-B为乙酸乙酯-甲醇-水(100:17:13);8-C为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)(二次展开);8-D为三氯甲 烷-丁酮-甲醇(3:1:1)。
分析表明:选取4种薄层展开条件,紫菀与白术的主要斑点在Rf0.1~0.3、Rf0.4~0.6及 Rf0.7~0.9三个范围中均重合,但两者荧光强度不同,考虑可能是同分异构体,
因此,不能同一展开剂体系来同时检测紫菀和白术。
结合实施例(7)和图7的结果,由于紫菀的条带相比于白术更加突出和分离性,因此确 定选用紫菀适用于二次展开剂系统。
综上,确定对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀,以乙酸乙酯-甲醇-水(100:17:13)为展开剂进行第一次展开后,而后以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)的上 层溶液为展开剂进行第二次展开
实施例3.9“广藿香”鉴别展开剂:石油醚(Ⅰ)-乙酸乙酯-冰醋酸(95:5:0.2);
结果如图9所示,其中A为未显色365nm下检视;B为三氯化铁显色日光下下检视,T:25℃,RH:60%。
条带示意:
1.供试液1 2.桂枝 3.陈皮 4.细辛 5.射干 6.白术 7.供试液1 8.泽泻 9.紫菀10.款冬花 11.广藿香 12.枳实 13.供试液1
分析表明:
①365nm下,仅有桂枝、供试液1呈现清晰的分离条带,其余成分均团聚一起无法分离, 因此只能检出桂枝,无法检出其他药材成分;
②三氯化铁显色后,藿香药材对照以及供试品成分均团聚一起无法分离,因此未能检出 任何呈现分离的斑点。
综上,由于本品生产工艺系水煎煮,并未另外提取挥发油,因此有可能藿香无法检出, 不能鉴别。同时,该展开剂系统不能用于层析分析其他成分。
实施例3.10“小柴胡胶囊”鉴别展开剂:氯仿-甲醇-水(13:6:1)
结果如图10所示,其中A为未显色254nm下检视;B为未显色365nm下检视;C为二 甲氨基苯甲醛硫酸乙醇显色365nm下检视;D为二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇显色日光下检视,T:25℃,RH:60%。
条带示意:
1.柴胡 2.供试液5 3.甘草 4.供试液3 5.射干 6.供试液1
分析表明:
①柴胡、甘草在四种显示条件下均呈现清晰的分离条带,且主要条带互相不干扰;
②射干在二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇显色显示条件下,虽然也能清晰分离,但显色效果不 如柴胡、甘草。
结论:该展开剂可以分离柴胡和甘草、射干。但由于柴胡和甘草、射干的可分离成分较 多,为避免射干的成分干扰检测结果,同时考虑到射干已经可以被纳入二次展开剂的检测组, 因此推荐使用该展开剂检测柴胡和甘草。
实施例3.11使用不同于中国药典中鉴别泽泻的展开剂:氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6:3.5:0.5)
《中国药典》2015版关于泽泻薄层分析:以环己烷-乙酸乙酯(1:1)为展开剂;
结果如图11所示,其中A为未显色254nm下检视;B为未显色365nm下检视;C为10%硫酸乙醇显色365nm下检视,T:25℃,RH:60%。
条带示意:
1.供试液5 2.桂枝 3.陈皮 4.细辛 5.射干 6.甘草 7.白术 8.黄芩 9.苦杏仁10.泽泻 11.紫菀 12.款冬花 13.藿香 14.枳实 15.麻黄 16.生姜 17.柴胡 18.供试液3
分析表明:
①在254nm和365nm显示条件下,射干、黄岑、款冬花能显示分离的斑点,但泽泻未能 显示分离的斑点,仅有对照显示多个斑点;
②在10%硫酸乙醇365nm显色条件下,泽泻药材出现多个分离的斑点,虽然对照也出现 多个斑点,但拖尾干扰带较严重,需要调换供试液1进一步验证。
结论:该展开剂可以分离射干、黄岑、款冬花。但由于射干、黄岑、款冬花的可分离成 分较多,为避免这些成分干扰检测结果,同时考虑到其已经可以被纳入前文已经确定展开剂 的检测组,因此推荐使用该展开剂进一步验证泽泻。
实施例3.12泽泻供试品制备验证
结果如图12所示,其中A为采用供试品1进行验证;B为改进供试品制备方法后,T:25℃,RH:60%。
条带示意:
1.供试品1 2.药材对照 3.阴性对照
分析表明:
①经上述试验结果,采用供试品1进行验证,结果显示不能鉴别。
②根据蔡玉荣(活络通口服液质量标准的研究,中国医药科学2015,5(7):50)报道的方 法,取颗粒供试品(批号:2020033001)加水20ml溶解,加石油醚(60~90℃)萃取2次,每次20ml,合并萃取液,蒸干,残渣加甲醇1ml溶解,得供试品溶液Ym。对照药材、阴性 对照同法制备,结果显示可以鉴别。
综上,对于泽泻,推荐使用改良的展开剂,同时需要采用改良的供试品溶液Ym,能取 得良好的检测效果。
实施例4、对清肺排毒汤验证优化的展开剂组的重复验证
综上所述,本发明测试了麻黄、炙甘草、桂枝、泽泻、柴胡、黄芩、生姜、紫菀、款冬花、射干、细辛、枳实、陈皮的五组展开剂。
至于未确定展开剂的药材成分,或是与其他成分属于同分异构体,不易于进行区分,因 此不便进行分析(例如白术和紫菀);
或是由于制备工艺的原因,导致未提取有效的药材成分(例如广藿香);
或是属于不可鉴定分析的无机物质(例如生石膏);
或是属于佐药成分,不属于重点检测的主药(例如山药);
或是属于成分和药效相近,难以在同一展开剂系统中进行分析(例如茯苓和猪苓)。
按照上述确定的展开剂组合,对清肺排毒汤进行测试品和阴阳性对照的重复性验证试验。
实施例4.1验证麻黄和枳实的展开剂:正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)上层溶液
取本品颗粒2g,加20ml水溶解,加入1ml氨水,用正丁醇萃取2次,每次10ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液。另取麻黄和枳实对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,分别加入1ml氨水,用 正丁醇萃取2次,每次15ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为麻黄和枳实 对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验,吸取上述三种 溶液各2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)上层溶液为展 开剂,预饱和30分钟,展开,取出,晾干,喷以0.5%茚三酮乙醇溶液,105℃烘至斑点清晰, 供试品色谱在与麻黄对照药材和枳实对照药材色谱相应的位置上。
结果如图13所示,T:25℃,RH:64%。
条带示意:
1.麻黄阴性对照 2.麻黄药材对照 3.供试品(批号:2020033001) 4.供试品(批号:2020033002) 5.供试品(批号:2020033003) 6.枳实药材对照 7.枳实阴性对照
分析表明:
①在该展开剂的分析下,阳性对照主带突出,无任何干扰带。阴性对照无干扰,说明系 统无检测误差;
②麻黄、枳实供试品虽然有一定拖尾,但阴性对照相比无干扰,并且主带与阳性对照相 比,具有相同的突出主带。
结论:三种供试品均可使用该展开剂同时检测麻黄、枳实药材成分,且检测结果准确, 能清晰区分阴性对照的干扰带。
实施例4.2、验证黄芩和生姜的展开剂:甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10:3:1:2)
取本品颗粒2g,加20ml水溶解,加入1ml盐酸,用乙酸乙酯萃取2次,每次10ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液。取黄芩对照药材粉末0.3g,加乙酸乙酯20ml,超声波处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。另取6-姜辣素对照品,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色 谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验,吸取上述供试品溶液及对照药材溶液各 2μl,6-姜辣素对照品溶液4μl,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10:3:1:2)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视,供试品 色谱中,在与黄芩对照药材色谱相应的位置上,显相同的斑点,喷以2%香草醛硫酸溶液,在 105℃加热至斑点显色清晰。
结果如图14所示,T:25℃,RH:64%。
条带示意:
1.黄芩阴性对照 2.黄芩药材对照 3.供试品(批号:2020033001) 4.供试品(批号:2020033002) 5.供试品(批号:2020033003) 6.生姜阴性对照 7. 6-姜辣素
分析表明:
①在紫外光灯(254nm)下检视,阳性对照主带突出,无任何干扰带。阴性对照无干扰, 说明系统无检测误差;
②在紫外光灯(254nm)下检视,三种供试品的条带分型相同,但与黄岑阳性对照相比, 多了一条清晰突出的主带;
③在2%香草醛硫酸溶液105℃加热后显示,三种供试品的条带分型相同,并且前述多出 的清晰突出的主带,与6-姜辣素阳性对照完全相同。
结论:三种供试品均可使用该展开剂同时检测黄岑、生姜药材成分,且检测结果准确, 尤其对于生姜成分能准确鉴定。
实施例4.3、验证细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀的展开剂
取本品颗粒2g,加20ml水溶解,用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液。另取细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀 等对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,分 别用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照 药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验,吸取上述溶液各2~5μl, 分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-水(100:17:13)为展开剂,展至约 3cm,取出,晾干,再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)的上层溶液为展开剂,二 次展至约8cm,取出,晾干,置紫外光灯(254nm)下检视,供试品色谱中,在与射干和款 冬花对照药材色谱相应的位置上,显相同的斑点,置紫外光灯(365nm)下检视,供试品色 谱中,在与桂枝、细辛、款冬花、陈皮和紫菀等对照药材色谱相应的位置上,显相同的荧光 斑点,喷以三氯化铝试液,置紫外光灯(365nm)下检视。结果如图15-图19所示。
陈皮鉴别的结果如图15所示,其中A为显色前365nm检视;B为三氯化铝显色后365nm 检视。
条带示意:
1.陈皮双阴性对照 2.陈皮药材对照 3.供试品(批号:2020033001) 4.供试品(批号:2020033002) 5.供试品(批号:2020033003)
分析表明:
①阴性和阳性对照条带分型多,但彼此无干扰,说明可用于比对分析供试品。
②与阳性对照相比,在下方的相同位置,供试品也呈现相同颜色和大小的条带,说明供 试品中含有预期的药材成分。
③与阴性对照相比,在上方的相同位置,供试品出现多条相同亮度和大小的条带,说明 供试品中含有一些与阴性对照相同的成分。
结论:该联合展开剂可检测陈皮药材成分,但供试品中含有多达21种药材成分,出现的 条带分型较多,需要仔细比对阳性、阴性对照即可鉴别陈皮。
紫菀的鉴别结果如图16所示,其中A为显色前365nm检视;B为三氯化铝显色后365nm 检视,T:25℃,RH:64%。
条带示意:
1.紫菀双阴性对照 2.紫菀药材对照 3.供试品(批号:2020033001) 4.供试品(批号:2020033002) 5.供试品(批号:2020033003)
分析表明:
①阴性和阳性对照条带分型多,但彼此无干扰,说明可用于比对分析供试品。
②与阳性对照相比,在上方的相同位置,供试品也呈现相同大小的条带,说明供试品中 含有预期的药材成分。
③与阴性对照相比,在下方的相同位置,供试品出现多条相同颜色和大小的条带,说明 供试品中含有一些与阴性对照相同的成分。
结论:该联合展开剂可检测陈皮药材成分,但需要仔细比对阳性、阴性对照。
射干、细辛鉴别结果如图17所示,其中A为254nm检视射干鉴别薄层图谱;B为365nm检视细辛鉴别薄层图谱,T:25℃,RH:64%。
条带示意:
1.射干阴性对照 2.射干药材对照 3.供试品(批号:2020033001) 4.供试品(批号:2020033002) 5.供试品(批号:2020033003) 6.细辛阴性对照 7.细辛药材对照
分析表明:
①射干阳性对照条带远小于阴性对照,且上方、下方各有一个突出的主带,与阴性对照 无干扰,说明可用于比对分析供试品;细辛阳性对照条带远小于阴性对照,且下方各有一个 突出的主带,与阴性对照无干扰,说明可用于比对分析供试品;
②与射干阳性对照相比,在上方、下方的相同位置,供试品也呈现相同大小的条带,说 明供试品中含有预期的药材成分;与细辛阳性对照相比,在下方的相同位置,供试品也呈现 相同大小的条带,说明供试品中含有预期的药材成分;
③与射干阴性对照相比,在最下方的相同位置,供试品出现多条相同亮度和大小的条带, 说明供试品中含有一些与阴性对照相同的成分;与细辛阴性对照相比,在上方的相同位置, 供试品出现多条相同亮度和大小的条带,说明供试品中含有一些与阴性对照相同的成分
结论:该联合展开剂可检测射干、细辛药材成分,但需要仔细比对阳性、阴性对照。
桂枝鉴别的结果如图18所示。
条带示意:
1.桂枝阴性对照 2.桂枝药材对照 3.供试品(批号:2020033001) 4.供试品(批号:2020033002) 5.供试品(批号:2020033003)
分析表明:
①阴性对照条带分型多,但阳性对照在最上方仅有1条主带,彼此无干扰,说明可用于 比对分析供试品。
②与阳性对照相比,在最上方的相同位置,供试品也呈现相同颜色和大小的条带,说明 供试品中含有预期的药材成分。
③与阴性对照相比,在除最上方之外的相同位置,供试品出现多条相同亮度和大小的条 带,说明供试品中含有大量与阴性对照相同的成分。
结论:该联合展开剂可检测桂枝药材成分,结合阳性对照,能够准群鉴别桂枝成分。
款冬花鉴别的结果如图19所示,其中A为三氯化铝显色前254nm检视;B为三氯化铝显色后365nm检视,T:25℃,RH:64%。
条带示意:
1.款冬花阴性对照 2.款冬花药材对照 3.供试品(批号:2020033001) 4.供试品(批号:2020033002) 5.供试品(批号:2020033003)
分析表明:
①阴性对照条带分型多,但阳性对照仅在中部和下方有1条主带,彼此无干扰,说明可 用于比对分析供试品。
②与阳性对照相比,在中部和下方的相同位置,供试品也呈现相同颜色和大小的条带, 说明供试品中含有预期的药材成分。
③与阴性对照相比,在除了以上之外的相同位置,供试品出现多条相同亮度和大小的条 带,说明供试品中含有大量与阴性对照相同的成分。
结论:该联合展开剂可检测桂枝药材成分,结合阳性对照,能够准群鉴别桂枝成分
实施例4.4、验证泽泻的展开剂:氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6:3.5:0.5)
取本品颗粒2g,加20ml水溶解,用石油醚(60~90℃)萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液。另取泽泻对照药材0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用石油醚(60~90℃)萃取2次,每 次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验,吸取上述供试品溶液和对照药材溶液各2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6:3.5:0.5)为展开剂,展开,取出, 喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,在紫外光(365nm)下检视,供试品 色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性无干扰。
泽泻鉴别的结果如图20所示。
条带示意:
1.泽泻阴性对照 2.泽泻药材对照 3.供试品(批号:2020033001) 4.供试品(批号:2020033002) 5.供试品(批号:2020033003)
分析表明:
①阴性和阳性对照条带分型多,但彼此无干扰,说明可用于比对分析供试品。
②与阳性对照相比,在下方的相同位置,供试品也呈现相同颜色和大小的条带,说明供 试品中含有预期的药材成分。
③与阴性对照相比,在除了以上之外的相同位置,供试品出现多条相同亮度和大小的条 带,说明供试品中含有大量与阴性对照相同的成分。
结论:该联合展开剂可检测泽泻药材成分,但供试品中含有多达21种药材成分,出现的 条带分型较多,需要仔细比对阳性、阴性对照即可鉴别。
实施例4.5、验证柴胡和甘草的展开剂:三氯甲烷-甲醇-水(13:6:1)
取甘草对照药材0.5g,加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为甘草对 照药材溶液。另取柴胡对照药材1.0g,加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩 至20ml,用正丁醇萃取2次,每次20ml,合并萃取液,用氨试液洗涤2次,弃去,收集正丁 醇层,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为柴胡对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》 2015年版四部通则0502)试验,分别吸取鉴别(1)、(2)项下供试品溶液、柴胡对照药材以 及甘草对照药材溶液各2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13:6:1) 为展开剂,展开,取出,晾干,喷以1%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液,热风吹至 斑点显色清晰,分别在日光和紫外光(365nm)下检视,供试品(1)色谱中,在与柴胡对照 药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点;供试品(2)色谱中,在与甘草对照药材色谱相 应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性无干扰。
甘草、柴胡鉴别的结果如图21所示,T:25℃,RH:64%。
条带示意:
1.甘草阴性对照 2.甘草药材对照 3.供试品(批号:2020033001) 4.供试品(批号:2020033002) 5.供试品(批号:2020033003) 6.柴胡阴性对照 7.柴胡药材对照 8.供试品(批号:2020033001) 9.供试品(批号:2020033002) 10.供试品(批号:2020033003)
分析表明:
①甘草阳性对照条带远小于阴性对照,且上方、中部各有一个突出的主带,与阴性对照 无干扰,说明可用于比对分析供试品;柴胡阳性阴性对照条带分型多,但彼此无干扰,说明 可用于比对分析供试品。;
②与甘草阳性对照相比,在中部的相同位置,供试品也呈现2条相同大小的条带,说明 供试品中含有预期的药材成分;与柴胡阳性对照相比,在中部的相同位置,供试品也呈现多 条相同大小的条带,说明供试品中含有预期的药材成分;
③与甘草阴性对照相比,供试品基本上没有相同位置的条带,说明二者成分相差很大; 与柴胡阴性对照相比,在上方和下方的相同位置,供试品各出现1条相同亮度和大小的条带, 说明供试品中含有一些与阴性对照相同的成分。
结论:该联合展开剂可检测甘草、柴胡药材成分,并且其与阴性对照的相同成分较少, 利于甘草和柴胡的鉴别。
实施例5、对上述监控方法进行温度因子的稳定性测定
5.1低温下麻黄、枳实鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在4℃环境下温度因子对上述麻黄、枳实展开剂 组合的鉴别效果的影响。
结果如图22所示。
条带示意:
1.麻黄对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.枳实对照药材
分析表明:与实施例4.1相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显 差异。
5.2低温下黄芩、生姜鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在4℃环境下温度因子对上述黄芩、生姜展开剂 组合的鉴别效果的影响。
结果如图23所示,其中A为显色前365nm检视;B为显色后365nm下检视。
条带示意:
1.黄芩对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5. 6-姜辣素对照品
分析表明:与实施例4.2相比,姜辣素在显色前365nm检视未有可见斑点。黄岑在显色 后365nm检视出现可见斑点,其余阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
5.3低温下桂枝、紫菀鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在4℃环境下温度因子对上述桂枝、紫菀展开剂 组合的鉴别效果的影响。
结果如图24所示,其中A为显色前365nm检视;B为三氯化铝试液显色后365nm下 检视。
条带示意:
1.桂枝对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.紫菀对照药材
分析表明:与实施例4.3相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显 差异。
5.4低温下射干、款冬花鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在4℃环境下温度因子对上述射干、款冬花展开 剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图25所示,其中A为显色前254nm检视;B为显色前365nm下检视;C为三氯 化铝试液显色后365nm下检视。
条带示意:
1.射干对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.款冬花对照药材
分析表明:与实施例4.3相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显 差异。
5.5低温下陈皮、细辛鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在4℃环境下温度因子对上陈皮、细辛展开剂组 合的鉴别效果的影响。
结果如图26所示。
条带示意:
1.陈皮对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.细辛对照药材
分析表明:与实施例4.3相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显 差异。
5.6低温下泽泻鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在4℃环境下温度因子对泽泻展开剂组合的鉴别 效果的影响。
结果如图27所示。
条带示意:
1.泽泻对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003)
分析表明:与实施例4.4相比,与阳性对照相比,在下方的相同位置,供试品也呈现相 同颜色和大小的条带,说明与阳性对照的条带保持一致,没有明显差异。
5.7低温下甘草、柴胡鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在4℃环境下温度因子对甘草、柴胡展开剂组合 的鉴别效果的影响。
结果如图27所示,其中A为显色后日光下检视;B为显色后365nm下检视。
条带示意:
1.甘草对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.柴胡对照药材 6.供试品(批号:2020033001) 7.供试品(批号:2020033002) 8.供试品(批号:2020033003)
分析表明:与实施例4.5相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显 差异。
实施例6、对上述监控方法进行高湿因子的稳定性测定
6.1高湿因子下麻黄、枳实鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在RH:88%环境下湿度因子对上述麻黄、枳实展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图29所示,其中条带示意:
1.麻黄对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.枳实对照药材
分析表明:与实施例4.1相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显 差异。
6.2高湿因子下黄芩、生姜鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在RH:88%环境下湿度因子对上述黄芩、生姜展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图30所示,其中A为显色前365nm检视;B为显色后365nm下检视。
条带示意:
1.黄芩对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5. 6-姜辣素对照品
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
6.3高湿因子下桂枝、紫菀鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在RH:88%环境下湿度因子对上述桂枝、紫菀展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图31所示,其中A为显色前365nm检视;B为三氯化铝试液显色后365nm下检视。
条带示意:
1.桂枝对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.紫菀对照药材
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
6.4高湿因子下射干、款冬花鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在RH:88%环境下湿度因子对上述射干、款冬花 展开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图32所示,其中A为显色前254nm检视;B为显色前365nm下检视;C为三氯 化铝试液显色后365nm下检视。
条带示意:
1.射干对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4供试品(批号:2020033003) 5.款冬花对照药材
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
6.5高湿因子下陈皮、细辛鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在RH:88%环境下湿度因子对上述陈皮、细辛展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图33所示.
条带示意:
1.陈皮对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.细辛对照药材
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
6.6高湿因子下泽泻鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在RH:88%环境下湿度因子对上述泽泻展开剂组 合的鉴别效果的影响。
结果如图34所示.
条带示意:
1.泽泻对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003)
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
6.7高湿因子下甘草、柴胡鉴别试验
按照实施例4的相同方法和湿度,测试在RH:88%环境下湿度因子对上述甘草、柴胡展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图34所示,其中A为显色后日光下检视;B为显色后365nm下检视。
条带示意:
1.甘草对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.柴胡对照药材 6.供试品(批号:2020033001) 7.供试品(批号:2020033002) 8.供试品(批号:2020033003)
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
实施例7、对上述监控方法进行低湿因子的稳定性测定
7.1低湿因子下麻黄、枳实鉴别试验
按照实施例4的相同方法和温度,测试在RH:32%环境下湿度因子对上述麻黄、枳实展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图36所示。
条带示意:
1.麻黄对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.枳实对照药材
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
7.2低湿因子下黄芩、生姜鉴别试验
按照实施例4的相同方法和温度,测试在RH:32%环境下湿度因子对上述黄芩、生姜展 开剂组合的鉴别效果的影响
结果如图37所示,其中A为显色前365nm检视;B为显色后365nm下检视。
条带示意:
1.黄芩对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5. 6-姜辣素对照品
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
7.3低湿因子下桂枝、紫菀鉴别试验
按照实施例4的相同方法和温度,测试在RH:32%环境下湿度因子对上述桂枝、紫菀展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图38所示,其中A为显色前365nm检视;B为三氯化铝试液显色后365nm下检视。
条带示意:
1.桂枝对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.紫菀对照药材
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
7.4低湿因子下射干、款冬花鉴别试验
按照实施例4的相同方法和温度,测试在RH:32%环境下湿度因子对上述射干、款冬花 展开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图39所示,其中A为显色前254nm检视;B为显色前365nm下检视;C为三氯 化铝试液显色后365nm下检视。
条带示意:
1.射干对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.款冬花对照药材
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
7.5低湿因子下陈皮、细辛鉴别试验
按照实施例4的相同方法和温度,测试在RH:32%环境下湿度因子对上述陈皮、细辛展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图40所示。
条带示意:
1.陈皮对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.细辛对照药材
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
7.6低湿因子下泽泻鉴别试验
按照实施例4的相同方法和温度,测试在RH:32%环境下湿度因子对上述泽泻展开剂组 合的鉴别效果的影响。
结果如图41所示。
条带示意:
1.泽泻对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003)
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
7.7低湿因子下甘草、柴胡鉴别试验
按照实施例4的相同方法和温度,测试在RH:32%环境下湿度因子对上述甘草、柴胡展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图42所示,其中A为显色后日光下检视;B为显色后365nm下检视。
条带示意:
1.甘草对照药材 2.供试品(批号:2020033001) 3.供试品(批号:2020033002) 4.供试品(批号:2020033003) 5.柴胡对照药材 6.供试品(批号:2020033001) 7.供试品(批号:2020033002) 8.供试品(批号:2020033003)
分析表明:与实施例4相比,阳性、阴性对照以及供试品的条带保持一致,没有明显差 异。
综合实施例6和实施例7的结果显示:常温低湿与常温高湿条件下,均能有效分离,不 影响相应药材的鉴别,温度对试验无影响。
实施例8、涉及质量监控过程的清肺排毒汤的制备方法
实施例8.1提取工艺的优化研究
采用正交实验,以黄芩苷转移率、出膏率为考察指标,筛选最优工艺提取条件。
选择影响提取效果的煎煮时间、煎煮次数、加水量作为主要考察因素,进行4因素3水 平正交优化试验,试验方案如表1所示。
按照处方比例称取饮片共100g,平行9份,按表2进行提取,提取液过滤,滤液量取体 积,记录。计算提取液出膏率、指标性成分含量,结果见表:
表1:正交实验因素水平表
表2:正交实验表
表3:正交实验结果
将表3中各结果进行方差分析,结果见表4。
表4:方差分析表
注:F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00;*:P<0.05,**:P<0.01;
根据极差分析和方差分析可知,三个因素对出膏率均有显著性影响,优选的方案为 A2B2C3;三个因素对黄芩苷转移率均有显著性影响,优选的方案为也A2B2C3,为节约成本, 减低能源消耗,选择A2B2C2为最优工艺,也即是煎煮2次,每次加10倍水,每次煎煮1 小时。
实施例8.2浓缩温度的筛选研究
拟考察60℃、75℃和90℃下,将提取液浓缩后,检测其指标性成分,以评价在不同浓缩 温度条件下的稳定性。
(1)样品制备
按照处方比例称取饮片共100g,照确定的清肺排毒汤提取方法制备样品,取制备所得提 取液,分取3份,每份250ml,分别于60℃、75℃和90℃下减压浓缩至50ml,再将样品稀释 至250ml,即得三个考察样品。
(2)检测分析
对浓缩后再重新稀释的3份样品进行黄芩苷含量测定,比较浓缩前后的差异。
(3)实验结果
表5:不同浓缩温度条件下样品指标性成分
黄芩苷含量(mg/g) | |
未浓缩样品 | 1.21 |
60℃浓缩 | 1.20 |
75℃浓缩 | 1.19 |
90℃浓缩 | 1.21 |
由以上结果看出,在60℃、75℃和90℃条件下进行浓缩,不同浓缩温度对甘草泻汤煎液 中的指标性成分黄芩苷含量未见影响,结果表明,在60℃~90℃条件下对样品进行浓缩,样 品保持稳定。
实施例8.3除杂方式的筛选研究
提取液除杂方式常规有2种,分别为筛网过滤和离心除杂,拟对2种除杂方式进行比较。
(1)除杂方式
除杂方式 | 参数 |
筛网过滤 | 300目 |
高速离心 | 10000rpm/min |
(2)样品
按照处方比例称取饮片共100g,照确定的清肺排毒汤提取方法制备样品,取提取液2份, 分别采用300目筛网过滤和10000rpm/min离心5分钟的方式,将除杂后的样品进行检测。
(3)检测分析
按清肺排毒汤中黄芩苷含量测定方法,对2份样品进行检测。
(4)实验结果
表6:2种除杂方式的外观性状
除杂方式 | 外观性状 | 放置是否有沉淀 |
离心 | 澄清 | 放置无沉淀产生 |
过滤 | 浑浊 | 放置产生沉淀 |
表7:2种除杂方式的指标性成分比较
除杂方式 | 黄芩苷含量(mg/g) |
离心 | 1.19 |
过滤 | 1.20 |
由以上结果看出,采用离心方式和300目筛网过滤方式进行除杂,2种除杂方式药液中 的黄芩苷含量未见显著差异,但过滤方法的样品外观浑浊,放置过程有沉淀产生,而离心样 品不存在浑浊及产生沉淀问题,说明离心除杂方式优于300目筛网过滤方式,选择离心作为 除杂方式。
实施例8.4干燥方式的筛选研究
拟喷雾干燥和减压干燥两种干燥方式,以选择合适的干燥方式。
(1)样品制备
按照处方比例称取饮片共100g,平行2份,按照提取工艺制备提取液,减压浓缩(65℃), 加入麦芽糊精,干燥。考察真空干燥与喷雾干燥对提取液指标含量的影响。
(2)检测分析
按清肺排毒汤中黄芩苷含量测定方法,对2份样品进行检测。
(3)实验结果
表7:不同干燥方式结果
干燥方式 | 黄芩苷总量(mg/g) |
喷雾干燥(165℃-175℃) | 1.53 |
减压干燥(75℃) | 1.48 |
由以上结果可以看出,喷雾干燥方式的样品中黄芩苷含量略高于减压方式的样品,原因 为喷雾干燥为瞬时高温干燥,样品受热时间短,成分受热影响小,因此,选择喷雾干燥作为 干燥方式。
实施例8.5、辅料筛选研究
中药颗粒剂常用的辅料包括可溶性淀粉、麦芽糊精、乳糖等,辅料的种类会影响成品的 成型性,稳定性和制成总量,有必要对辅料种类进行考察。拟按照生药量50g制成颗粒10g, 采用沸腾制粒方式的条件下,考察辅料对制粒工艺的影响。
表8:辅料对制粒工艺的影响
由以上结果看出,三种辅料均能制备出符合要求的产品,成品收率无显著差异。鉴于可 溶性淀粉溶解性略差,成品溶液澄明度较其余两种差;乳糖易吸潮,成本价格较高,因此, 选择麦芽糊精作为辅料。
综上所述,如图43所示,确定清肺排毒汤的制备工艺如下:
加水煎煮两次,每次1小时,滤过,合并煎液,滤液减压浓缩至相对密度1.03~1.05(70℃) 的清膏,加入麦芽糊精适量,干燥,或粉碎,制成颗粒1000g。
在一个具体实施方案中,其中第一次加10倍量水,浸泡0.5小时,煎煮1.0小时;第二 次加10倍量水,煎煮1.0小时,合并煎液,滤过;
在上述任一具体实施方案中,其中将滤液75℃±5℃减压浓缩,至密度为1.03~1.05(70℃) 的清膏,10000rpm/min离心;
在上述任一具体实施方案中,取上述离心后的清膏,加入适量麦芽糊精(每个处方量制成 总量为40g,离心后的清膏含固量约为处方量10.5%),溶解,混匀,喷雾干燥,得浸膏粉;
在上述任一具体实施方案中,取浸膏粉,加适量粘合剂(水),沸腾制粒,整粒,制成颗 粒1000g;
在上述任一具体实施方案中,将颗粒分装成10g/袋,复合膜包装。
其中,在完成整粒工序后,随机抽取样品,按照实施例4的确定的5种展开剂组合,对 麻黄、苦杏仁、炙甘草、桂枝、泽泻、白术、柴胡、黄芩、生姜、紫菀、款冬花、射干、细 辛、枳实、陈皮、藿香进行薄层层析鉴别。
根据鉴别结果,确定产品是否符合《中国药典》的质量标准。如果根据薄层层析结果判 定质量合格,则进行总混等后续工序。如果根据薄层层析结果判定不合格,则停止生产。检 查所有原料和生产工序。
Claims (10)
1.基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,其特征在于:包括将二十一味药加水煎煮两次,滤过,合并煎液,滤液减压浓缩至清膏,加入麦芽糊精适量,干燥或粉碎,制成清肺排毒汤颗粒,对所制备的颗粒进行质量检测,并根据质量检测结果指导产品规范化生产,其中该质量检测的步骤包括:
(1)取“清肺排毒汤”颗粒,加水溶解后,加入萃取剂进行萃取,合并萃取液;清肺排毒汤的药物组成如下:麻黄9g、炙甘草6g、杏仁9g、生石膏15~30g(先煎)、桂枝9g、泽泻9g、猪苓9g、白术9g、茯苓15g、柴胡16g、黄芩6g、姜半夏9g、生姜9g、紫菀9g、冬花9g、射干9g、细辛6g、山药12g、枳实6g、陈皮6g、藿香9g;
(2)将萃取液水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液;另用相同方法平行制备阳性对照和阴性对照溶液;
(3)分别吸取供试品溶液、阳性对照和阴性对照溶液,分别置于同一硅胶G薄层板上,在薄层鉴别展开剂上展开,取出;
(4)加入显色溶液,用热风加热至斑点显色清晰,并置于紫外光下检视;
(5)比较供试品、阳性对照、阴性对照的斑点,如果供试品和阳性对照在相应位置上出现相同颜色斑点,且阴性无干扰斑点,则判断供试品中含有预期与阳性对照质量相同或相近的药物成分;其中:
对于麻黄和枳实,以正丁醇:冰醋酸:水的体积比为4:1:5的溶液的上层溶液为展开剂;
对于黄芩和生姜,以甲苯:乙酸乙酯:甲醇:甲酸的体积比为10:3:1:2的溶液为展开剂;
对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀,以乙酸乙酯:甲醇:水的体积比为100:17:13的溶液为展开剂进行第一次展开后,而后以甲苯:乙酸乙酯:甲酸:水的体积比为20:10:1:1的溶液的上层溶液为展开剂进行第二次展开;
对于泽泻,以氯仿:乙酸乙酯:甲酸的体积比为6:3.5:0.5的溶液为展开剂;
对于柴胡和甘草,以三氯甲烷:甲醇:水的体积比为13:6:1的溶液为展开剂。
2.根据权利要求1所述的基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,其特征在于:其中对于麻黄和枳实,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶解,加入1ml氨水,用正丁醇萃取2次,每次10ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和阴性对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,分别加入1ml氨水,用正丁醇萃取2次,每次15ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液;步骤(4)中喷以0.5%茚三酮乙醇溶液,105℃烘至斑点清晰。
3.根据权利要求1所述的基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,其特征在于:
其中黄芩和生姜,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶解,加入1ml盐酸,用乙酸乙酯萃取2次,每次10ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和阴性对照药材各0.3g,加乙酸乙酯20ml,超声波处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣用1ml,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液;步骤(4)中喷以2%香草醛硫酸溶液,105℃烘至斑点清晰。
4.根据权利要求1所述的基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,其特征在于:其中对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀,步骤(1)和(2)加入乙酸乙酯萃取2次,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用甲醇溶解作为供试品溶液,步骤(5)中在于对照药材色谱相应的位置上,显相同的荧光斑点,喷以三氯化铝试液,置紫外光灯下检视。
5.根据权利要求4所述的基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,其特征在于:其中所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶解,乙酸乙酯萃取2次,每次10ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和阴性对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,分别用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。
6.根据权利要求1所述的基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,其特征在于:其中对于泽泻,所述步骤(1)是取成品颗粒2g,加20ml水溶解,用沸程为60℃~90℃的石油醚萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液;所述步骤(2)是另取阳性和阴性对照药材各0.5g,分别加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用沸程为60℃~90℃的石油醚萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液;步骤(4)中喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,在紫外光下检视。
7.根据权利要求1所述的基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,其特征在于:其中对于柴胡和甘草,所述步骤(2)中取甘草对照药材0.5g,加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用乙酸乙酯萃取2次,每次20ml,合并萃取液,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液;取柴胡对照药材1.0g,加水适量,回流提取60分钟,放冷,滤过,滤液浓缩至20ml,用正丁醇萃取2次,每次20ml,合并萃取液,用氨试液洗涤2次,弃去,收集正丁醇层,水浴蒸干,残渣用1ml甲醇溶解作为柴胡对照药材溶液;所述步骤(4)中喷以1%对二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液,热风吹至斑点显色清晰,分别在日光和紫外光下检视。
8.根据权利要求1所述的基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,其特征在于:其中所述硅胶G薄层板选自德国Merck硅胶G板或青岛海洋化工硅胶G板。
9.根据权利要求1-8任一所述的基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,其特征在于:其中将二十一味药加水煎煮两次,其中第一次加10倍量水,浸泡0.5小时,煎煮1.0小时;第二次加10倍量水,煎煮1.0小时,合并煎液,滤过,合并煎液,滤液在70℃减压浓缩至相对密度1.03~1.05的清膏,加入麦芽糊精适量,干燥,或粉碎,制成颗粒。
10.根据权利要求9所述的基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法,其特征在于:
其中每个处方量制成总量为40g,离心后的清膏含固量约为处方量10.5%,然后加入适量麦芽糊精,溶解,混匀,喷雾干燥,得浸膏粉;然后加适量粘合剂,沸腾制粒,整粒,制成颗粒1000g,并将颗粒分装成10g/袋,复合膜包装。
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