CN112795491A - 一种里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法 - Google Patents

一种里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，包括下列步骤：S1、将里氏木霉菌株接入培养基中分离得到单菌落，再进行种子培养后保藏；S2、将保藏的里氏木霉接入活化培养基中进行培养；S3、将S2中的培养液接入种子扩大培养基中进行培养；S4、将S3中的培养液接入发酵培养基中进行液体深层发酵，得到含酸性纤维素酶的发酵液。本发明对培养基成分、发酵条件进行优化，用槐糖进行诱导产酶，把里氏木霉产纤维素酶分为两个阶段，增菌期补料速度尽量拉大，使菌体快速增殖到30％湿重，在达到此菌体密度后降低补料速度进入诱导产酶期，葡萄糖快速被消耗，使低浓度的槐糖转运进胞内发挥强诱导作用，从而在发酵液中获得高活力的酸性纤维素酶。

Description

一种里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法。
背景技术
酸性纤维素酶是一种复合酶，指能在酸性条件下参与纤维素降解的多组分酶的总称，根据其酶系可分为：内切-β-1，4-葡聚糖酶，外切-β-1，4-葡聚糖酶，β-1，4-葡萄糖苷酶三大类，广泛应用于饲料工业、制浆造纸、纺织工业、食品酿造、生物能源及废水处理等各个领域中。微生物发酵产酸性纤维素酶，由于其培养简单、价格低廉、来源广、产量高等优点而被广泛应用于工业化生产。产酸性纤维素酶的微生物中里氏木霉是一种安全的纤维素酶生产菌，研究的比较深入。
近年来，我国采用微生物发酵产酸性纤维素酶研究的比较多，但是菌体表达量没有得到明显的提升，酸性纤维素酶活力上不去，较国外纤维素酶制剂相差较远，致使我国工业生产中用到的酸性纤维素酶主要依赖于进口。因此提高微生物产酸性纤维素酶的表达量是我们一直努力的重点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，通过对培养基成分、发酵条件优化，从发酵液中获得较高活力的酸性纤维素酶。
本发明是这样实现的：
本发明提供一种里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，包括下列步骤：
S1、将里氏木霉菌株接入培养基中培养分离得到单菌落，再进行种子培养后保藏；
S2、将保藏的里氏木霉接入活化培养基中进行活化培养；
S3、将S2中的培养液接入种子扩大培养基中进行扩大培养；
S4、将S3中的培养液接入发酵培养基中进行液体深层发酵，得到含酸性纤维素酶的发酵液。
进一步地，所述液体深层发酵具体步骤为：
在发酵罐中装入发酵培养基，接入扩大培养后的种子液，全程采用氨水调控pH4.5±0.1、28℃恒温发酵；当溶液下降后开始上升时开始添加补料，调节补料速度控溶氧20-40％；发酵初始通气量1.0m3/h，搅拌转速200rpm/min；溶氧低于60％开始升风升转，直至发酵条件最大通气量2.0m3/h，搅拌转速500rpm/min。
进一步地，所述补料的制备方法为：65％的葡萄糖溶液添加1％葡萄糖转苷酶，在pH 4.5，温度50℃的条件下反应100h制备槐糖溶氧，在上述反应液中添加玉米浆0.75％，磷酸二氢钾1.4％，硫酸镁0.3％，硫酸锰0.05％，氯化钙0.5％，吐温80 0.3％，115℃灭菌30min，冷却备用。
进一步地，步骤S4发酵培养的条件为：25-35℃液体发酵，搅拌转速200-500r/min，通气量0.5-1.0vvm，全过程用氨水调控pH4.5-5.0；所述补料中还添加有乳糖来诱导产酶。
进一步地，分离菌落的培养基配制：酵母浸粉0.5-1.5％，葡萄糖1-2.5％，磷酸二氢钾0.3-1.0％，氯化钙0.01-1％，琼脂粉0.5-1.0％，pH自然，115℃灭菌30min。
进一步地，种子培养的培养基配制：葡萄糖1.5-3.0％，玉米浆1-2.5％，硫酸铵0.25-0.5％，磷酸二氢钾1.0-2.5％，氯化钙0.03-0.5％，硫酸镁0.2-0.5％，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至4.5-5.0，然后再加入PPG 1-2滴/瓶；115℃灭菌30min。
进一步地，步骤S1保藏方法为：用生理盐水在种子培养基上洗刮孢子，混入沙土管中，抽真空，置于-20～4℃冰箱保藏。
进一步地，活化培养基配制：葡萄糖1-3.0％，酵母浸粉1-2.5％，硫酸锰0.025-0.05％，氯化钙0.05-1％，磷酸二氢钾0.25-1.0％，硫酸铵0.05-0.1％，硫酸镁0.2-0.5％，琼脂粉0.5-1.0％，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至4.5-5.0，115℃灭菌30min，冷却、形成斜面。
进一步地，扩大培养基配制：葡萄糖2-3.0％，酵母浸粉2-3.5％，玉米浆2-4.5％，硫酸锰0.025-0.05％，氯化钙0.05-1％，磷酸二氢钾0.25-2.0％，硫酸铵0.05-0.1％，硫酸镁0.2-0.5％，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至4.5-5.0，然后再加入PPG 1-2滴/瓶；121℃灭菌30min。
进一步地，发酵培养基配制：葡萄糖2.5-5％，酵母浸粉1-2.5％，玉米浆6-8％，硫酸锰0.025-0.05％，氯化钙0.05-1％，磷酸二氢钾1.5-2.5％，硫酸铵0.5-1.0％，硫酸镁0.1-1％，吐温80 0.25-5％，PPG 0.05-0.4％，用氢氧化钠溶液调pH至4.5-5.0。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一种里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，通过对培养基成分、发酵条件优化，利用槐糖进行诱导产酶，把里氏木霉产纤维素酶人为的分为两个阶段：增菌期和产酶期，增菌期的补料速度尽量拉大，使菌体快速增殖到30％湿重左右，在达到一定菌体量后降低补料速度，使低浓度的槐糖被更好的转运进胞内发挥强诱导作用，从而在发酵液中获得高活力的酸性纤维素酶。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例中提供一种里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，包括下列步骤：
S1、将里氏木霉菌株接入培养基培养分离得到单菌落，再进行种子培养后保藏；
S2、将保藏的里氏木霉接入活化培养基中进行活化培养；
S3、将S2中的培养液接入种子扩大培养基中进行扩大培养；
S4、将S3中的培养液接入发酵培养基中进行液体深层发酵，得到含酸性纤维素酶的发酵液。
具体地，各步骤中所用培养基的配制如下：
分离菌落的培养基：酵母浸粉1.0％，葡萄糖2.0％，磷酸二氢钾1.0％，氯化钙0.5％，琼脂粉0.5％，pH自然，115℃灭菌30min；
种子培养的培养基：葡萄糖3.0％，玉米浆2.0％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾1.5％，氯化钙0.5％，硫酸镁0.5％，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至4.5-5.0，然后再加入PPG1-2滴/瓶；115℃灭菌30min；
活化培养基：葡萄糖3.0％，玉米浆2.0％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾1.5％，氯化钙0.5％，硫酸镁0.5％，琼脂粉0.5％，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至4.5，115℃灭菌30min；
扩大培养基：葡萄糖3.0％，酵母浸粉2％，玉米浆2％，硫酸锰0.025％，氯化钙0.8％，磷酸二氢钾2.0％，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.5％，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至4.5，然后再加入PPG 1-2滴/瓶；121℃灭菌30min；
发酵培养基：葡萄糖3％，酵母浸粉1.5％，玉米浆6％，硫酸锰0.025％，氯化钙0.8％，磷酸二氢钾2％，硫酸铵0.5％，硫酸镁1％，吐温80 0.3％，PPG 0.3％，用氢氧化钠溶液调pH至4.5。
步骤S4发酵培养的条件为：28℃液体发酵，搅拌转速500rpm/min，通气量2.0m3/h，全过程用氨水调控pH4.5。
本实施例的具体步骤如下：
1)沙土管活化菌种：用灭过菌的竹签挖取4℃保藏的沙土管菌种少许，均匀涂布到装有60mL活化培养基的250mL茄子瓶中，30℃条件下生化培养箱培养7d以形成清晰的菌苔；
2)三角瓶种子培养：无菌条件下挖取上述活化斜面中的一小块菌苔接到装有150mL种子扩大培养基的500mL三角瓶中，30℃条件下200r/min震荡培养24h至瓶内液体呈现一定的浑浊度；
3)补料的制备：65％的葡萄糖溶液添加1％葡萄糖转苷酶，在pH 4.5，温度50℃的条件下反应100h制备槐糖溶氧，在上述反应液中添加玉米浆0.75％，磷酸二氢钾1.4％，硫酸镁0.3％，硫酸锰0.05％，氯化钙0.5％，吐温80 0.3％，115℃灭菌30min，冷却备用；
4)液体深层发酵：在30L发酵罐中装入18L发酵培养基，121℃灭菌30min结束后，降温至28℃，接入一瓶三角瓶种子(200ml左右)，全程采用氨水调控pH4.5±0.1、28℃恒温发酵，发酵初始通气量1.0m3/h，搅拌转速200rpm/min；溶氧低于60％开始交替升风升转，直至发酵条件最大通气量2.0m3/h，搅拌转速500rpm/min；当溶氧下降后开始上升、pH高于设定值时开始流加补料，调节补料速度控溶氧20-40％；发酵过程中每24h取发酵液样，离心取上清进行酶活检测，发酵终止条件：镜检大部分菌丝断裂溶解，放罐前两次测定活力上升缓慢。
采用该工艺步骤连续发酵三批，采用《中华人民共和国国家标准》GB/T23881-2009饲用纤维素酶活性的测定中的滤纸法对发酵产品进行检测，结构如表1所示：
表1
Figure BDA0002923530190000061
通过表1，我们可以发现在该工艺调控下，120h后酸性纤维素酶大量合成，到达168h后产酶速率变慢，发酵至1880h放罐，测定发酵液中最高酸性纤维素酶活力达到3427U/mL。
发酵过程中搅拌转速进行了优化，降转速至500rpm，减小剪切力，避免了菌丝被剪断溶解使发酵液成糊状，减少了菌丝被剪断，发酵液被打发现象；
采用槐糖诱导产酶，槐糖的诱导机制是非常复杂的，会受到多种因素的影响，如浓度和转运速率等，槐糖只有被纤维二糖透过酶转运进细胞内才会有诱导产纤维素酶的作用，而研究表明在低浓度时槐糖更倾向于被转运进胞内发挥诱导作用。所以我们也把里氏木霉产纤维素酶人为的分为两个阶段：增菌期和产酶期，增菌期的补料速度尽量拉大，使菌体快速增殖到30％湿重左右，在达到一定菌体量后降低补料速度，使低浓度的槐糖被更好的转运进胞内发挥强诱导作用；
补料中添加少量的乳糖诱导产酶，参与纤维素降解的多组分酶主要包括3大类：内切-β-1，4-葡聚糖酶、外切-β-1，4-葡聚糖酶和β-1，4-葡萄糖苷酶。里氏木霉中，所有纤维素酶的基因是协同表达的，只要有一种纤维素酶表达，其他的纤维素酶也会随着表达，但不同的诱导剂作用下，所表达的量并不完全一致，比如槐糖对β-葡萄糖苷酶的诱导能力较差，乳糖对诱导里氏木霉产生β-1，4半乳糖苷酶和纤维素酶有较好的效果。所以在补料中添加少量乳糖，更利于纤维素酶类的充分表达。
本发明优化了培养基成分和发酵条件，使得可从发酵液中获得高活力的酸性纤维素酶，解决了现有技术中产酶活性不高的问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种里氏木霉生产高活力酸性纤维素酶的发酵方法，其特征在于，包括下列步骤：
S1、将里氏木霉菌株接入培养基中培养分离得到单菌落，再进行种子培养后保藏；
S2、将保藏的里氏木霉接入活化培养基中进行活化培养；
S3、将S2中的培养液接入种子扩大培养基中进行扩大培养；
S4、将S3中的培养液接入发酵培养基中进行液体深层发酵，得到含酸性纤维素酶的发酵液。
2.如权利要求1所述的里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，其特征在于，所述液体深层发酵具体步骤为：
在发酵罐中装入发酵培养基，接入扩大培养后的种子液，全程采用氨水调控pH4.5±0.1、28℃恒温发酵；当溶液下降后开始上升时开始添加补料，调节补料速度控溶氧20-40％；发酵初始通气量1.0m3/h，搅拌转速200rpm/min；溶氧低于60％开始升风升转，直至发酵条件最大通气量2.0m3/h，搅拌转速500rpm/min。
3.如权利要求2所述的里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，其特征在于，所述补料的制备方法为：65％的葡萄糖溶液添加1％葡萄糖转苷酶，在pH 4.5，温度50℃的条件下反应100h制备槐糖溶氧，在上述反应液中添加玉米浆0.75％，磷酸二氢钾1.4％，硫酸镁0.3％，硫酸锰0.05％，氯化钙0.5％，吐温80 0.3％，115℃灭菌30min，冷却备用。
4.如权利要求2所述的里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，其特征在于，步骤S4发酵培养的条件为：25-35℃液体发酵，搅拌转速200-500r/min，通气量0.5-1.0vvm，全过程用氨水调控pH4.5-5.0；所述补料中还添加有乳糖来诱导产酶。
5.如权利要求1所述的里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，其特征在于，分离菌落的培养基配制：酵母浸粉0.5-1.5％，葡萄糖1-2.5％，磷酸二氢钾0.3-1.0％，氯化钙0.01-1％，琼脂粉0.5-1.0％，pH自然，115℃灭菌30min。
6.如权利要求1所述的里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，其特征在于，种子培养的培养基配制：葡萄糖1.5-3.0％，玉米浆1-2.5％，硫酸铵0.25-0.5％，磷酸二氢钾1.0-2.5％，氯化钙0.03-0.5％，硫酸镁0.2-0.5％，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至4.5-5.0，然后再加入PPG 1-2滴/瓶；115℃灭菌30min。
7.如权利要求1所述的里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，其特征在于，步骤S1保藏方法为：用生理盐水在种子培养基上洗刮孢子，混入沙土管中，抽真空，置于-20～4℃冰箱保藏。
8.如权利要求1所述的里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，其特征在于，活化培养基配制：葡萄糖1-3.0％，酵母浸粉1-2.5％，硫酸锰0.025-0.05％，氯化钙0.05-1％，磷酸二氢钾0.25-1.0％，硫酸铵0.05-0.1％，硫酸镁0.2-0.5％，琼脂粉0.5-1.0％，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至4.5-5.0，115℃灭菌30min，冷却、形成斜面。
9.如权利要求1所述的里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，其特征在于，扩大培养基配制：葡萄糖2-3.0％，酵母浸粉2-3.5％，玉米浆2-4.5％，硫酸锰0.025-0.05％，氯化钙0.05-1％，磷酸二氢钾0.25-2.0％，硫酸铵0.05-0.1％，硫酸镁0.2-0.5％，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至4.5-5.0，然后再加入PPG1-2滴/瓶；121℃灭菌30min。
10.如权利要求1所述的里氏木霉生产高活性酸性纤维素酶的发酵方法，其特征在于，发酵培养基配制：葡萄糖2.5-5％，酵母浸粉1-2.5％，玉米浆6-8％，硫酸锰0.025-0.05％，氯化钙0.05-1％，磷酸二氢钾1.5-2.5％，硫酸铵0.5-1.0％，硫酸镁0.1-1％，吐温80 0.25-5％，PPG 0.05-0.4％，用氢氧化钠溶液调pH至4.5-5.0。
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