CN112794898A - 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，公开了一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其应用。以SARS‑CoV2受体结合域（RBD）为探针，使用流式细胞术筛选新冠肺炎康复患者的B淋巴细胞，制备出单克隆抗体与RBD的亲和常数为4.03 nM。用X射线晶体衍射解析抗体与RBD复合物的三维结构发现抗体与宿主细胞受体（ACE2）的结合表位重叠，能够竞争性阻断RBD与ACE2的结合，抑制病毒侵染宿主细胞，也能够应对新冠病毒发生某些遗传突变，其阻断假病毒（累加B.1.1.7突变株基因和D614G）感染宿主细胞的半数有效浓度（IC50）为0.12 ng/mL，具有诊断、治疗和预防新冠肺炎的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的病原体是新型冠状病毒(SARS-CoV2)，可引起严重的急性呼吸系统疾病。根据世界卫生组织报告，疫病已经扩散到了216个国家和地区，导致大量人员伤亡。COVID-19的临床特征包括发热、干咳和疲劳、呼吸衰竭，甚至导致死亡。到目前为止，用于预防的疫苗和治疗新型冠状病毒肺炎的特效药物大部分仍处于临床试验或特定条件下的紧急使用阶段，安全性和有效性需进一步验证。
SARS-CoV2属冠状病毒科 (Coronaviridae) 冠状病毒属 (Coronavirus)，是一类有包膜的单股正链RNA病毒。病毒基因编码包含多个结构蛋白，如S蛋白、N蛋白、M蛋白和E蛋白等；S蛋白、M蛋白和E蛋白参与病毒细胞囊膜的形成，而N蛋白则参与病毒的核酸装配。研究表明，S蛋白是病毒入侵宿主细胞的关键蛋白，承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，决定了病毒的宿主范围和特异性，可通过其受体结合域（RBD）的基因重组或突变实现不同宿主间传播，并导致较高的死亡率和传染率。与当年的萨斯病毒（SARS-CoV）一样，两种冠状病毒都是通过其RBD与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，诱导病毒囊膜与宿主细胞膜发生融合，实现病毒对宿主细胞的侵染。RBD与ACE2结合的表位在遗传上相对保守，是病毒的弱点和广谱性中和抗体的重要作用位点以及抗体药物筛选的关键靶点。
新型冠状病毒肺炎的康复患者体内存在多种抗体，能够中和病毒并阻止进一步感染，康复患者血浆疗法在重症患者的治疗过程中展现了良好的效果。但是由于康复患者血浆来源有限，难以大规模制备，且存在批间差异和其它疾病传染风险等因素，使得这一疗法不能够大范围的推广应用。鉴于康复患者血浆的主要有效成分是中和抗体，而全人源单克隆抗体成分单一、安全性强、抗病毒机制明确、易规模化制备，将是新冠肺炎治疗药物研发的重要方向。
发明内容
为研制治疗和预防COVID-19的高效全人源单克隆抗体药物，本发明提供了一种在观察新型冠状病毒S蛋白RBD三维结构的基础上，设计筛选探针，目的是更为有效地从新型冠状病毒肺炎康复患者的外周血中筛选特异性记忆B淋巴细胞，单细胞巢式PCR技术获得单一B淋巴细胞表达抗体的重链和轻链基因序列，然后通过基因工程手段，构建表达抗体的稳定细胞系，在体外规模化制备该单克隆抗体。使用X射线晶体衍射解析抗体Fab与RBD复合物的三维结构，发现抗体与RBD大部分结合表位与ACE2的结合表位高度重叠，能够竞争性地阻断RBD与ACE2结合，抑制病毒侵染宿主细胞。由于RBD与ACE2结合表位遗传上较为保守，本发明所述抗体能够有效应对新冠病毒发生某些遗传突变，具有良好的广谱性，在不同假病毒感染hACE2人源化细胞模型上验证单克隆抗体的安全性、有效性和广谱性。所述单克隆抗体在本申请中被命名为“YK-CoV2-02”。
本发明的第一个目的是提供了一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体YK-CoV2-02，所述的单克隆抗体由重链和轻链组成；所述的重链和轻链具有如下序列：
重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次自N末端的第26~33位、第51~57位、第98~107位所示；轻链的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，其中，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次自N末端的第27~32位、第50~52位、第89~99位所示。
本发明所述的全人源单克隆抗体YK-CoV2-02是通过SARS-CoV2的S蛋白RBD特异性探针标记-流式分选-单细胞巢式PCR技术从新冠肺炎康复患者的血液中筛选获得的。抗体与RBD的亲和常数为4.03 nM。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述的单克隆抗体YK-CoV2-02的基因，包括编码所述单克隆抗体YK-CoV2-02的重链可变区的多核苷酸序列或其互补序列；以及，编码所述单克隆抗体YK-CoV2-02的轻链可变区的多核苷酸序列或其互补序列。
进一步地，编码所述单克隆抗体YK-CoV2-02的重链可变区的多核苷酸序列由SEQID NO.3所示。
进一步地，编码所述单克隆抗体YK-CoV2-02的轻链可变区的多核苷酸序列由SEQID NO.4所示。
本发明的第三个目的是提供一种表达载体，含有所述单克隆抗体YK-CoV2-02的基因。
本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞，含有所述的基因，或含有所述的表达载体。
进一步地，所述的宿主细胞为CHO细胞、HEK293细胞、酵母细胞或植物细胞。
宿主细胞用于抗体的瞬时表达和稳定细胞系的构建，实现所述抗体的科研和产业化生产。
本发明的第五个目的是提供所述的单克隆抗体YK-CoV2-02在COVID-19的治疗和预防药物中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种新型冠状病毒的药物组合物，包含安全有效剂量的所述的单克隆抗体YK-CoV2-02，所述的单克隆抗体YK-CoV2-02特异性中和冠状病毒或其突变株病毒。
本发明的第七个目的是提供一种用于诊断CoVID-19的诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒中含有所述的中和抗体YK-CoV2-02。
本发明公开了一种所述单克隆抗体YK-CoV2-02的Fab与RBD蛋白复合物晶体进行X射线衍射，解析复合物三维结构的蛋白质晶体学的方法，发现所述抗体与RBD结合表位与大部分ACE2的结合表位重叠率为65%，由于RBD与ACE2结合表位遗传上较为保守，能够精准识别RBD遗传保守的ACE2结合表位，即病毒的弱点，所述抗体能够有效应对新型冠状病毒发生遗传变异，具有良好的广谱特征。
本发明公开了一种构建SARS-CoV2假病毒感染细胞的方法，整合两种近期出现的SARS-CoV-2变异病毒株（20A.EU1和B.1.1.7）刺突（S）蛋白的突变序列，以及对胞浆区肽段的19个氨基酸进行局部缺失突变，构建突变型S蛋白表达质粒，转染293T细胞进行表达，用Western blot和流式细胞术检测确认S蛋白的表达。将S蛋白表达质粒与其它慢病毒包装质粒共转染293T细胞进行假病毒的包装，用包装好的假病毒分别感染293T-hACE2细胞和Huh-7细胞，并进行假病毒的组织半数感染量（TCID50）检测。建立以突变型SARS-CoV-2假病毒感染293T-hACE2细胞为基础的检测体系，用于评价抗体药物中和性能的应对病毒发生基因突变的能力。单克隆抗体YK_CoV2_01对D614G和近期出现的累加B.1.1.7突变株基因和D614G病毒株均具有较高的中和活性，能够有效抑制病毒感染宿主细胞，抑制感染宿主细胞的半数有效浓度（IC50）为0.12 ng/mL。本发明的结果显示，所述抗体在COVID-19的诊断、治疗和预防药物中具有广泛的应用前景。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
在对本发明所述的单克隆抗体YK-CoV2-02进行理化学、生物学、免疫学和病毒学的分析过程中发现所述抗体具有：（1）高亲和力和高中和活性，采用大分子相互作用仪测定所述抗体与RBD结合的亲和常数（KD）为4.03 nM。（2）作用机制明确：晶体结构衍射结果显示单克隆抗体YK-CoV2-02与RBD高度特异性结合，且抗体的结合区域与ACE2的结合表位覆盖率为65%，能够通过特异性竞争阻断病毒与宿主细胞结合，发挥抗病毒效应。（3）良好的广谱特征：晶体结构显示所述抗体能够精准识别RBD遗传保守的ACE2结合表位，有效应对新型冠状病毒发生遗传变异。在D614G突变SARS-COV2假病毒感染细胞模型上，所述中和抗体抑制病毒侵染的半数有效浓度（IC50）为0.57 ng/mL，对近期出现在英国伦敦的突变株（B.1.1.7）也均具有较高的中和活性，在D614G和B.1.1.7基因突变累加的假病毒感染细胞模型上，所述抗体抑制病毒感染宿主细胞的半数有效浓度IC50达到0.12 ng/mL。（4）稳定性好：所述抗体的重链和轻链基因来源于同一人类B淋巴细胞，天然配对，已知人体内IgG1抗体的半衰期是21～28天，理论上公开的单抗具有相近的人体内半衰期。（5）本发明的单克隆抗体为全人源，在临床应用上不需要进行人源化改造以降低人抗鼠抗体反应，且具有高亲和力和高中和活性，具有良好的成药性，针对新型冠状病毒肺炎具有广泛诊断、治疗和预防应用前景。
上述说明仅是本发明技术方案和部分结果的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1.流式细胞术分选与RBD特异性结合的记忆B型淋巴细胞，其中， A显示圈定人血单个核细胞群， B显示从A圈定的细胞中选择Aqua Blue- CD3- CD8a-CD14-D19+ CD20+ IgGhiIgMlo CD27+的细胞， C显示从B中圈定的细胞中进一步选择Ag(+)+Ag(-)-的细胞。
图2.抗体轻重链基因的PCR扩增产物核酸琼脂糖凝胶电泳图谱。
图3.单克隆抗体YK-CoV-02可变区序列检索结果输出图， A为重链， B为轻链。
图4.单克隆抗体YK-CoV-02的分离纯化图， A为Superdex 200 分子筛柱分离纯化层析图谱， B为SDS-PAGE检测图谱。
图5.使用大分子相互作用仪Gator测定抗体Fab对RBD 的结合亲和力的检测结果。
图6.使用大分子相互作用仪Gator测定单克隆抗体Fab竞争性阻断RBD与受体ACE2结合的试验结果。
图7.单克隆抗体YK-CoV-02抑制D614G突变假病毒感染hACE2细胞的试验结果。
图8.单克隆抗体YK-CoV-02抑制D614G和B.1.1.7两个病毒株的基因突变累加假病毒感染hACE2细胞的试验结果。
图9.X-射线晶体衍射解析抗体Fab与RBD 复合物三维结构，其中， A为抗体Fab与RBD复合物整体的三维结构； B为抗体Fab和受体ACE2在RBD上的结合表位及其重叠区域的显示图；其中，HC：重链；LC：轻链；虚线所包围的表面为ACE2在RBD上的结合表位，实线所包围的表面为抗体在RBD上的结合表位。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：全人源抗新型冠状病毒单克隆抗体的筛选和制备
1.1探针的标记
将所需的SARS-CoV2相关特异性正负探针进行荧光染料偶联标记，过程如下：
1.1.1利用AviTag融合蛋白生物素化试剂盒（Avidity，BirA500）进行探针的生物素标记。按照说明书所述步骤配制反应体系，并于30 °C条件下孵育30 min。
1.1.2使用30 kDa超滤管将反应产物与1× PBS（pH 7.4）进行交换，去除多余的生物素。
1.1.3以20 min的间隔逐步添加1/5摩尔当量的链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）或链霉亲和素-别藻蓝蛋白（SA-APC）至生物素标记的探针中，直到SA-PE或SA-APC与生物素标记探针的摩尔比达到1：1，在4 °C下轻轻摇动进行孵育，分别制备带有荧光素标记的正负探针：Ag(-)-SA-APC 和 Ag(+)-SA-PE。
1.2流式细胞术分选抗原特异性单一B淋巴细胞
采用Ficoll-Hypaque密度梯度（1.077 g/L）离心法分离康复患者的PBMC，具体步骤如下：
1.2.1将新鲜静脉血（肝素抗凝）与同等体积的1×PBS进行稀释。
1.2.2按照外周血与Ficoll体积比为10：3的比例将Ficoll轻轻加至离心管底部，将稀释后的血样平铺到分离液液面上方，保持两液面界面清晰。
1.2.3室温条件下，用水平转子以900×g，加速度设为4a，降速度设为0a，离心30min。
1.2.4离心结束后，吸出中间白膜层置于新的离心管，并加入10倍体积的1×PBS，室温以600×g离心10 min，弃上清，重复清洗一遍。
1.2.5用RPMI1640培养基将1×PBS重悬备用，并进行活细胞计数。
采用流式细胞分选技术从PBMC中分选出抗原特异性单一B淋巴细胞，具体步骤如下：
1.2.6用1×PBS清洗细胞，并重悬至细胞密度为1×106 cell/mL，按照1 μL/mL的比例添加Aqua Blue染料，4 ℃条件下避光孵育30 min，以600×g离心10 min，弃上清，重复清洗一遍。
1.2.7将PBMC进行流式抗体染色：anti-CD3-PE-Cy7，anti-CD8a-PE-Cy7，anti-CD14-PE-Cy7，anti-CD20-PerCP-Cy5.5，anti-CD19-FITC，anti-IgG-APC-H7，anti-IgM-BV421，anti-CD27- PE-CF594，Ag(-)-SA-APC和Ag(+)-SA-PE，每5×106个PBMC细胞各加入2μL上述抗体，4 ℃条件下避光孵育40 min后，使用含2％BSA的PBS重复洗涤两次，利用BDFACSAria™ III Cell Sorter流式分选细胞仪，使用B淋巴细胞特异的细胞表面标记物(Aqua Blue- CD3- CD8a-CD14-D19+ CD20+ IgGhiIgMlo CD27+Ag(+)+Ag(-)-)分选B淋巴细胞，直接将单个B淋巴细胞分选至96孔板中，每孔中预先加入含有 20 U RNA酶抑制剂及2 μL的1×PBS，-80 ℃冻存备用。流式分选的结果见图1， A显示圈定单个核淋巴细胞群； B显示从A圈定的细胞中选择Aqua Blue- CD3- CD8a-CD14-D19+ CD20+ IgGhiIgMlo CD27+的B淋巴细胞；C显示从B中圈定的细胞中进一步选择Ag(+)+Ag(-)-的B淋巴细胞。
1.3利用单细胞-PCR技术扩增全人源单克隆抗体可变区基因
1.3.1反转录PCR，参考说明书 (TaKaRa，6210A)，程序简单介绍如下：通过流式细胞分选仪得到38个B淋巴细胞，向每个反应体系中同时加入4 μL的5×缓冲液， 1.1 μL的dNTP，1 μL的反转录酶，1 μL的Oligo dT引物，用水补齐至20 mL，反转录PCR反应条件为：65℃保温5min后，冰上迅速冷却，接着以42 ℃反转录60 min，随后95 ℃预变性5 min，冰上冷却。
1.3.2巢式PCR
取反转录产物4ul为模板，进行PCR反应扩增重链可变区、κ轻链可变区和λ轻链可变区，可采用表1所示的相关引物进行扩增。
表1.巢式PCR引物
续表1
续表1
续表1
PCR反应体系中包含：25 μL的2× DNA聚合酶缓冲液，表1所示引物各0.5 pM，2 μL的模板（第一轮PCR的模板为反转录产物，第二轮PCR的模板为第一轮的PCR产物），用水补齐至50μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，接着94 ℃变性30 s，58 ℃（H、λ链）或60 ℃（κ链）退火30 s，72 ℃ 延申45 min，50个循环，最后72 ℃再延伸10 min。
1.3.3琼脂糖凝胶电泳与序列分析
单一B淋巴细胞中重链和轻链基因均扩增成功的克隆，被认为是配对成功的单克隆抗体，取5 μL的第二轮PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中泳道1为重链可变区VH的PCR产物，扩增片段约450 bp，泳道2为轻链可变区的PCR产物，扩增片段约405 bp。取配对的阳性克隆连接到T载体上进行测序，测序获得的抗体可变区序列用Vector NTI软件及登录IMGT网站进行基因分析，结果如图3所示，其中A为重链基因分析结果， B为轻链基因分析结果。
1.4抗SARS-CoV2病毒全人源单克隆抗体真核表达载体的构建
1.4.1分别将上述轻链/重链基因插入pcDNA3.1(+/-)表达载体（购自Invitrogen™公司）的单克隆酶切位点，构建抗SARS-CoV2病毒全人源单克隆抗体的表达载体。
1.4.2用上述连接产物转化DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素的平板上37 ℃培养过夜。
1.4.3挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件：94 ℃预变性3 min，94℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，28个循环，最后72 ℃再延伸5 min。
1.4.4取5 μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链或轻链基因的转化子。结果显示，本发明构建的新型冠状病毒单克隆抗体重链/轻链的重组表达载体其序列正确。
1.5单克隆抗体的瞬时表达和纯化
1.5.1使用Expi293表达系统（Thermo Fisher Scientific，A14635）进行单克隆抗体的表达，按照说明书所述步骤进行细胞转染操作，转染后持续监测细胞状态，当细胞活率下降至70%时，收取细胞培养上清，5000 rpm离心40 min后，使用0.22 μm瓶颈过滤器过滤收集上清。
1.5.2使用体积为15 mL的现装Protein A亲和层析柱进行亲和层析纯化，上样前使用8个柱体积的1×PBS缓冲液进行平衡，待电导显示到基线后进样，上样结束后，使用8个柱体积的1×PBS缓冲液洗涤色谱柱至基线平稳，使用洗脱缓冲液分次洗脱目的蛋白，待OD280近基线后，停止收集，并向最终洗脱液中分别补入1 mL的1M Tris（pH 9.0），使用截留分子量30 kDa的超滤管将洗脱得到的蛋白超滤浓缩，Nanodrop检测其浓度。
1.5.3将超滤得到的抗体用Superdex 200的分子筛柱子进一步纯化，将分子筛纯化的收集峰合并，用截留分子量30 kDa的超滤管浓缩，Nanodrop检测其浓度。
1.5.4纯化后的单抗用SDS-PAGE检测，结果见图4， A为凝胶过滤层析纯化抗体的结果， B为SDS-PAGE检测结果，其中1泳道为非还原SDS-PAGE检测结果，2泳道为还原SDS-PAGE检测结果。在还原电泳中，预期重链和轻链的分子量分别为50 kDa和25 kDa，泳道M为分子量标记，在非还原电泳中，预期全分子单抗的分子量为150 kDa，符合预期。
实施例2：单克隆抗体YK-CoV-02与RBD蛋白的结合活性分析
利用Gator非标记生物分子分析仪进行抗体与抗原的结合活性分析
2.1.利用GNTi细胞表达RBD，依次经镍柱纯化和分子筛纯化后，按照DSB-X™ 生物素蛋白标记试剂盒（Invitrogen™，D20655）说明书所示步骤将RBD进行生物素化标记。
2.2将生物素化的RBD进行600倍稀释，取3 μL的RBD加入2000 μl HBS-EP缓冲液中混合，将稀释后的RBD以每孔200 μL的量装载至96孔样品板中。
2.3利用HRV 3C蛋白酶将单克隆抗体切成Fab片段，利用亲和层析与分子筛纯化所得到的抗体Fab，将抗体Fab稀释1000倍后，继续按照1：3进行梯度稀释，共4个稀释度（36.2nM, 12.1 nM, 4.02 nM和1.34 nM），每个稀释度样本取200μL进行检测，同时取200 μL的HBSEP缓冲液作为空白对照，并在样品孔列的两边加入一列的HBS-EP缓冲液作为基线。
2.4检测过程中，每个实验先在探针板的HBS-EP缓冲液中基线平衡120 s，然后循环上样200 s，在样品列的前面基线运行120 s，在样品中运行600 s作为结合，在样品列的后一列的HBSEP中运行400 s作为解离，拟合方法采用1:1模型拟合。
2.5分析及结果：通过软件拟合计算得到单克隆抗体YK-CoV-02与RBD 的亲和常数，见图5和表2，说明单克隆抗体YK-CoV-02与RBD具有高亲和力。
表2. 单克隆抗体YK-CoV-02与RBD 抗原的亲和力检测结果
实施例3：单克隆抗体YK-CoV-02竞争性阻断RBD与受体ACE2结合能力分析
利用Gator非标记生物分子分析仪进行抗体阻断SARS-CoV2病毒RBD与受体ACE2的结合能力分析
3.1利用Expi-CHO细胞表达受体ACE2，依次经镍柱纯化和分子筛纯化后，按照DSB-X™ 生物素蛋白标记试剂盒（Invitrogen™，D20655）说明书所示步骤将ACE2进行生物素化标记，将生物素化后的ACE2稀释至40 μg/mL，摩尔浓度570 nM。
3.2 将RBD稀释至30 μg/mL，摩尔浓度为1000 nM，将抗体稀释至0.2 mg/mL，与RBD按照摩尔比 1：1的比例混合，配制的混合液中抗体摩尔数量大于ACE2的摩尔数量。
3.3检测过程中，每个实验先在探针板的HBS-EP缓冲液中基线平衡120 s，然后循环上样200 s，在样品列的前面基线运行120 s，在40 μg/mL的biotin-ACE2内20 s即可达到最大的结合水平约为1.2 nM的响应值，在30 μg/mL的RBD中，结合400 s，其中约20 s左右到达结合的平台期，最大响应约为0.12 nM，在HBS-EP缓冲液中解离600 s，解离几乎完全。
3.4分析及结果：通过软件拟合计算得到受体ACE2与RBD的亲和常数，见图6，说明单克隆抗体YK-CoV-02可完全阻断RBD与受体ACE2的结合。
实施例4：微量中和法检测单克隆抗体针对SARS-CoV2假病毒的中和能力和广谱性分析
4 .1 SARS-CoV2假病毒准备：
为了检测单克隆抗体YK-CoV-02针对SARS-CoV2中和作用的广谱性，准备了野生型和突变型假病毒。
将编码S蛋白的基因（GenBank ID：QHD43416 .1）插入pCMV3-CF载体，同时加入20A.EU1突变株S蛋白的D614G突变，得到D614G假病毒质粒pCMV-S-CF-D614G，在D614G假病毒基础上，加入B.1.1.7突变株S蛋白的氨基酸突变序列，得到突变型假病毒质粒pCMV-S-CF-MUT，将编码人ACE2蛋白的基因（GenBank ID：59272）稳定转染入293T细胞，构建稳定表达人ACE2的细胞（hACE2细胞），将293T细胞以5×105的密度接种至T75细胞培养瓶中，置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中过夜培养，待细胞密度达到70-90%后开始转染，利用Lipofecta mine 3000（Invitrogen™，L3000001）将pCMV-S-CF-D614G或pCMV-S-CF-MUT分别与paPAX2和pCDH-EF1-CMV-copGFP共转染到293T细胞中，6 h后更换培养基，转染后24 h收集第一批病毒，并更换新的5% FBS DMEM，48 h后，再次收集上清，并与第一批收集的上清混合，2000 rpm，离心10 min，去除细胞碎片，收集上清，并用0.45 μm滤器过滤。
病毒上清与Lenti-XTM Concentator（Clontech，631231）按照3：1的比例充分混合均匀，置于4℃孵育过夜，4 ℃条件下，以1500×g离心45 min，然后弃去上清，加入1/10-1/100量的DMEM或PBS重悬沉淀，最后将浓缩的病毒分装至冻存管，于-80 ℃条件下保存。
4.2 稀释抗体：将抗体用DMEM培养基稀释到需要的浓度，首孔浓度为50 μg/mL（体积为75 μL），按照1：3进行稀释，其余孔预先加入50 μL的DMEM培养基，依序从前一孔中吸取25 μL加入到下一孔并混匀，每个梯度设置两个复孔。
4.3稀释病毒：将假病毒用DMEM培养基按照所需浓度配制好，混匀后从第二排孔开始，每孔加入25 μL，轻轻混匀，37 ℃孵育1 h，首排孔设阴性对照不加病毒。
4.4将hACE2细胞稀释到4×105 cell/mL，每孔加入50 μL细胞悬液与抗体-病毒混合液混合，置于37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中培养24 h后，补加50 μL的含有10% FBS的DMEM完全培养基，放入培养箱继续培养24 h，在荧光显微镜下观察并统计病毒中和效果。
4.5统计分析：没有病毒和抗体的细胞用作空白对照，没有抗体的细胞用作病毒对照，中和百分比计算为(样品信号-空白对照信号)/(病毒对照信号-空白对照信号)×100％，使用GraphPad Prism 7进行统计分析。
4.6结果：图7显示不同抗体浓度对D614G假病毒的中和效果，图8显示不同抗体浓度对D614G和B.1.1.7突变病毒株的累加假病毒的中和效果，本发明公开的单克隆抗体YK-CoV-02抑制D614G SARS-CoV2假病毒感染hACE2细胞的半数有效浓度（IC50）为0.57 ng/mL，抑制D614G和B.1.1.7突变病毒株的累加假病毒感染hACE2细胞的IC50为0.12 ng/mL。
实施例5：单克隆抗体YK-CoV-02与RBD复合物的X射线衍射晶体结构解析
5.1制备抗体Fab和RBD复合物
5.1.1利用HRV3C蛋白酶将待检测抗体酶切成Fab片段，利用亲和层析与分子筛纯化所得到的抗体Fab。
5.1.2使用GNTi细胞表达RBD，利用镍柱纯化和分子筛纯化所得到的RBD。
5.1.3将RBD和抗体Fab按照分子量1：1.2比例混合并在冰上孵育1 h，使其相互结合形成抗体Fab和RBD 复合物，配制复合物的Endo H内切酶的酶切体系，并于室温孵育24h，利用Endo H内切酶去除所得复合物表面的糖基化修饰，将所得酶切体系依次经过Con A柱纯化系统和分子筛柱纯化系统，将去除糖基化修饰的复合物提纯，利用超滤浓缩法将复合物浓度调整至5 mg/mL。
5.2利用悬滴气相扩散法制备抗体Fab和RBD复合物晶体
5.2.1按照JCSG晶体制备系列试剂盒说明书所述的相关步骤从384个晶体生长条件中筛选出制备复合物晶体的最优条件，取0.2 μL的浓缩蛋白复合物滴加至点晶片上，同时取0.2 μL的蛋白点晶池液滴加在蛋白复合物液滴上，储液池内加50 μL相应的点晶液和3.5 μL的5 M NaCl，将晶体培养板置于22 ℃的恒温箱中培养10～20 d，通过观察蛋白晶体生长情况，选出的晶体最优生长条件的点晶液为19% PEG 3350，0.12 M柠檬酸钠pH5.5溶液。
5.2.2取0.5 μL的浓缩蛋白复合物滴加至点晶片上，同时取0.5 μL的蛋白点晶池液滴加在蛋白复合物液滴上，将点晶片倒扣至混有500 μL的蛋白点晶池液和35 μL的5 MNaCl的晶体培养板上并密封，将晶体培养板置于22 ℃的恒温箱中培养10～20 d，待晶体生长到最佳状态时，将晶体捞出放置于液氮中保存，冻存液为24.7% PEG 3350，0.16 M柠檬酸钠pH5.5，40%甘油溶液。
5.2.3 将得到的Fab和RBD复合物晶体在上海同步辐射光源17号线站（SSRFBL17U）进行晶体衍射并收集数据，所得数据使用CCP4，Phenix，COOT和PyMol等软件进行蛋白质三维结构解析和优化修正，复合物的结构如图9所示，其中， A为抗体Fab与RBD复合物整体的三维结构； B为抗体和受体ACE2在RBD上的结合表位显示图；结果显示，本发明抗体与RBD的结合表位与ACE2结合位点的重叠率高达65%，表明本发明抗体拥有应对新冠病毒发生遗传变异的能力。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 易康生物（苏州）有限公司
<120> 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Trp Val Arg Gly Ser Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Glu Arg Ser Asn Trp Pro Ser
85 90 95
Gly Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 352
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
caggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag tctctgggtt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatcccg gtggtagcac attctacgca 180
gactccgtga agggccgatt taccatctcc agagacaatg acaattccaa gaacacgttg 240
tatcttcaaa tgaacagcct gagagccgaa gacacggccg tctattactg tgcgagagat 300
tgggtgaggg gttccaactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc ag 352
<210> 4
<211> 325
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aactacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcaggag cgtagcaact ggccttcggg gactttcggc 300
cctgggacca aagtggatat caaac 325
Claims (10)
1.一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体由重链和轻链组成；所述重链和轻链的可变区具有如下序列：
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次自N末端的第26~33位、第51~57位、第98~107位所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次自N末端的第27~32位、第50~52位、第89~99位所示。
2.一种编码权利要求1所述的单克隆抗体的基因，其特征在于，包括编码所述单克隆抗体的重链可变区的多核苷酸序列或其互补序列；以及，编码所述单克隆抗体的轻链可变区的多核苷酸序列或其互补序列。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，编码所述单克隆抗体的重链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，编码所述单克隆抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种表达载体，其特征在于，含有编码权利要求1所述的单克隆抗体的基因。
6.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2~4任一项所述的基因，或含有权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为CHO细胞、HEK293细胞、酵母细胞或植物细胞。
8.权利要求1所述的单克隆抗体在制备COVID-19治疗和预防药物中的应用。
9.一种抗新型冠状病毒的药物组合物，其特征在于，包含安全有效量的权利要求1所述的单克隆抗体，所述的单克隆抗体特异性中和新型冠状病毒或其突变株病毒。
10.一种用于诊断CoVID-19的诊断试剂盒，其特征在于，所述的诊断试剂盒中含有权利要求1所述的单克隆抗体。
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