CN112791061A - 一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法 - Google Patents

一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明为一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法。一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法，包括：(1)制备介孔二氧化硅；(2)将抗癌药物负载到介孔二氧化硅；(3)采用生物素修饰红细胞膜；(4)将生物素修饰后的红细胞膜包裹负载抗癌药物的介孔二氧化硅。本发明的技术方案通过红细胞膜的包裹使其合成的纳米粒子可以有效的躲避生物屏障，进行全身的血液循环，实现纳米粒子在肿瘤中的高效蓄积；再通过修饰生物素来进行主动的靶向进一步提高了其在肿瘤部位的聚集，从而极大的提高了药物载体的生物相容性、在人体中的循环时间，靶向作用提高载体在肿瘤区域的聚集效果，可用于癌细胞中药物的递送。

Description

一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法
技术领域
本发明具体涉及一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法。
背景技术
癌症是导致人类死亡的主要原因之一，全球每年约有880万人死于癌症，每7分钟就有一个人被确诊为癌症。因此，寻找更加有效的癌症治疗方法已经成为人们需要攻坚的主要课题。目前，化疗和放疗是现阶段治疗癌症的的两种主流治疗方式，但因低效率和严重的副作用，限制了它们的进一步发展。
在纳米肿瘤治疗中，通过化学方法合成纳米材料，来作为药物载体，降低了药物对人体的副作用，可实现高效杀死肿瘤细胞的目的。但是，当纳米粒子进入体内，机体的非特异性免疫系统会对其进行表面物质识别。当机体识别到其为外来物质时，激发了免疫系统，免疫蛋白进行黏附后由巨噬细胞进行吞噬消除，导致药物载体发挥的作用大大降低。因此仿生纳米药物载体得到越来越多的关注。天然细胞如红细胞、白细胞、血小板等具有的长循环性和靶向特异性，使其自身在人体内有效循环的同时，在正常条件下不被免疫系统清除。所以，仿生纳米药物载体致力于赋予人工合成载体具有一些天然细胞的性质，从而减少免疫系统的攻击，实现长循环性能。
根据研究表明，在肿瘤微环境下，癌细胞的外表面pH显弱酸性，在接入靶向物质，如带有-NH-的生物素、叶酸等物质进行识别，可以达到精准、高效、主动靶向的效果。因此，开发具有高的生物相容性、长循环以及靶向特性的药物载体，将是提高肿瘤治疗效果的有效途径。
介孔二氧化硅具有较高的孔隙率、高比表面积、热稳定性，载药量大、结构稳定、生物相容性好、无毒副作用的特点，但其在体内循环时间较短，不能充分发挥作用，且单一介孔二氧化硅负载后进入人体，经过免疫系统的清除，只有极少量的纳米粒子在肿瘤组织积累。
有鉴于此，本发明提出一种新的具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体及其制备方法，提高了药物载体的生物相容性和在人体中的循环时间，具有的靶向作用提高载体在肿瘤区域的聚集效果，可用于癌细胞中药物的递送。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法，利用层级化结构设计，弥补了传统药物利用率低、毒副作用强的缺陷，实现了药物精准释放和纳米载体的长循环，从而达到高效治疗癌症的目的。
为了实现上述目的，所采用的技术方案为：
一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备介孔二氧化硅；
(2)负载抗癌药物：将所述的介孔二氧化硅和抗癌药物加入到水中，并搅拌12h后，得负载抗癌药物的介孔二氧化硅；
(3)修饰红细胞膜：将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素与破碎的红细胞膜，在4℃下搅拌12h后，用微型挤出机通过200nm滤膜连续挤出，得生物素修饰后的红细胞膜；
(4)将所述的生物素修饰后的红细胞膜和所述的负载抗癌药物的介孔二氧化硅加入到PBS溶液中，充分分散后，用微型挤出机过滤，得到具有生物素修饰红细胞膜包覆的介孔二氧化硅纳米粒子。
进一步地，所述的制备介孔二氧化硅的方法为：
将正戊醇、TEOS加入到环己烷中，搅拌均匀后，加入CTAB和去离子水并搅拌，再在120℃下反应2h，然后用去离子水洗涤、干燥、煅烧，得白色粉末的介孔二氧化硅。
再进一步地，所述的正戊醇、TEOS、环己烷、CTAB和去离子水得质量比为2:4:30:2.44:30。
再进一步地，所述的干燥温度为70℃，煅烧温度为550℃，煅烧时间为6h。
进一步地，所述的步骤(2)中，介孔二氧化硅、抗癌药物和水的质量比为5:1：20；
所述的步骤(3)中，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素与红细胞膜的质量比为1:5。
进一步地，所述的抗癌药物为抗癌药物DOX。
进一步地，所述的红细胞膜的制备：将红细胞分散在pH为7.4的PBS中，胀破后，离心分离，得破碎的红细胞膜。
进一步地，所述的步骤(4)中，所述的生物素修饰后的红细胞膜、所述的负载抗癌药物的介孔二氧化硅和PBS溶液的质量比为1:1:40；
所述的步骤(4)中，采用超声分散处理0.5h。
进一步地，所述的步骤(4)中，用脂质体挤出器过滤后，进行冷冻干燥。
本发明的另一个目的在于提供一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体，采用上述的制备方法制备而成，是一种长循环和缓释协同的靶向抗癌药物载体，可以高效的杀死肿瘤细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明技术方案制得生物素修饰红细胞膜包裹的载药介孔二氧化硅纳米粒子，具有以下的优点：(1)采用的介孔二氧化硅由正硅酸乙酯和十六烷基三甲基溴化铵，再通过高温煅烧制得，其具有大的比表面积以及丰富孔道结构，主要用于提高药物载体的载药量。(2)红细胞膜的包裹使其合成的纳米粒子可以有效的躲避生物屏障，进行全身的血液循环，实现纳米粒子在肿瘤中的高效蓄积。(3)生物素的修饰使得药物载体进行主动靶向，进一步提高了其在肿瘤部位的聚集。本发明展现了提高载体生物相容性、长循环以及在肿瘤部位的聚集，可用于肿瘤部位药物的递送。
附图说明
图1为Bio-RBCm@MSN-DOX、RBCm@MSN-DOX、RBCm、MSN-DOX的透射电镜图，a为Bio-RBCm@MSN-DOX透射电镜图，比例尺为200纳米；b为Bio-RBCm@MSN-DOX的高倍透射电镜图，比例尺为10纳米；c为挤出的红细胞膜囊泡的透射电镜图，比例尺为200纳米；d为RBCm@MSN-DOX的透射电镜图，比例尺为200纳米；
图2为Bio-RBCm@MSN-DOX、RBCm@MSN-DOX、RBCm vesicle、MSN-DOX粒径分布图；
图3为MSN载药情况；
图4释药情况；其中，a为Bio-RBCm@MSN-DOX、MSN-DOX、DOX在pH＝5的PBS溶液中随时间变化的释药情况；b为Bio-RBCm@MSN-DOX、MSN-DOX在pH＝7.4的PBS溶液中随时间变化的释药情况；
图5a为MSN、Bio-RBCm@MSN的生物相容性；b为MSN-DOX、Bio-RBCm@MSN-DOX的细胞毒性。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
下面将结合具体的实施例，对本发明一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法做进一步的详细介绍：
本发明针对目前临床药物的有效利用率低的问题，致力于设计一种具有靶向长循环多级仿生纳米药物载体来提高药物有效利用率。常规治疗下，癌症药物进入体内，大部分被肝脏、肾脏代谢，少量药物进入肿瘤，缺乏药物高效的运输途径。现阶段，纳米载体药物有望成为解决这一问题的突破口，构建精准靶向、长循环的纳米系统来杀灭肿瘤具有较高的研究意义，急需进一步的创新和完善。针对传统抗癌药物长循环性能差的问题，本发明的技术方案以多级纳米核壳结构为研究对象，利用介孔二氧化硅孔道可调，生物相容性好的特点，载抗癌药物实现缓释，利用纳米膜负载技术将红细胞膜包覆在介孔二氧化硅上，以减少免疫系统的攻击，实现长循环性能。多级结构具有可设计的物理和化学性能，修饰靶向基团后，可制备出长循环和缓释协同的靶向抗癌药物载体，从而高效的杀死肿瘤细胞。该方法制备工艺简单，具有个性化纳米载体的特点。具体的技术方案为：
一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备介孔二氧化硅。
(2)负载抗癌药物：将所述的介孔二氧化硅和抗癌药物加入到水中，并搅拌12h后，得负载抗癌药物的介孔二氧化硅。
(3)修饰红细胞膜：将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素与破碎的红细胞膜，在4℃下搅拌12h后，用微型挤出机通过200nm滤膜连续挤出，得生物素修饰后的红细胞膜。
红细胞膜具有生物相容性高的优点。
将生物素在5℃下搅拌12h，将其修饰于红细胞膜上，使得纳米粒子具有靶向性，从而提高负载药物的纳米粒子利用效率。
(4)将所述的生物素修饰后的红细胞膜和所述的负载抗癌药物的介孔二氧化硅加入到PBS溶液中，充分分散后，用微型挤出机过滤，得到具有生物素修饰红细胞膜包覆的介孔二氧化硅纳米粒子。
生物素修饰红细胞膜是通过脂质体挤出器将膜包裹于载体(负载抗癌药物的介孔二氧化硅)的表面，使得纳米粒子分散性良好，同时具有较好的稳定性。
优选地，所述的制备介孔二氧化硅的方法为：
将正戊醇、TEOS(正硅酸乙酯)加入到环己烷中，搅拌均匀后，加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和去离子水并搅拌，再在120℃下反应2h，然后用去离子水洗涤、干燥、煅烧，得白色粉末的介孔二氧化硅。
介孔二氧化硅是以十六烷基三甲基溴化铵为模板，在模板的表面沉积硅源正硅酸乙酯，再通过高温煅烧制得介孔二氧化硅纳米粒子。介孔二氧化硅具有大的比表面积以及丰富孔道结构，主要用于提高药物载体的载药量。
进一步优选地，所述的正戊醇、TEOS、环己烷、CTAB和去离子水得质量比为2:4:30:2.44:30。
进一步优选地，所述的干燥温度为70℃，煅烧温度为550℃，煅烧时间为6h。
优选地，所述的步骤(2)中，介孔二氧化硅、抗癌药物和水的质量比为5:1：20；
所述的步骤(3)中，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素与红细胞膜的质量比为1:5。
优选地，所述的抗癌药物为抗癌药物DOX。
优选地，所述的红细胞膜的制备：将红细胞分散在pH为7.4的PBS中，胀破后，离心分离，得破碎的红细胞膜。
优选地，所述的步骤(4)中，所述的生物素修饰后的红细胞膜、所述的负载抗癌药物的介孔二氧化硅和PBS溶液的质量比为1:1:40；
所述的步骤(4)中，采用超声分散处理0.5h。
优选地，所述的步骤(4)中，用脂质体挤出器过滤后，进行冷冻干燥。通过冷冻干燥的方式，可以提高产品的保质时间。
实施例1.
具体操作步骤如下：
(1)制备介孔二氧化硅：
2份正戊醇，4份TEOS(正硅酸乙酯)加入到30份环己烷中搅拌均匀，加入2.44份CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和30份去离子水，搅拌后转移到聚四氟乙烯反应釜中，置于120℃烘箱里反应2小时，用去离子水洗涤三次，至于70℃空气中干燥一天得到白色粉末，然后550℃马弗炉烧结6h，即可得白色粉末的介孔二氧化硅(MSN)。
(2)制备负载抗癌药物DOX的介孔二氧化硅：
将介孔二氧化硅和抗癌药物DOX加入到水中(介孔二氧化硅、抗癌药物DOX和水的质量比为5:1：20)，搅拌12h，通过静电作用负载上抗癌药物，得负载抗癌药物的介孔二氧化硅(MSN-DOX)。
通过对上清液吸光度的测定，进一步定量负载的DOX在纳米颗粒上的吸附量。
(3)制备红细胞膜：
全血采自雄性Balb/c小鼠。将采集的红细胞立即分散在PBS(pH＝7.4)中，胀破，离心分离，得到红细胞膜碎片(RBCm)。
(4)对红细胞膜进行生物素修饰：
将1份二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素(Bio-PEG-DSPE)与5份破碎的红细胞膜，在4℃下搅拌过夜，用微型挤出机通过200nm滤膜连续挤出，得生物素修饰后的红细胞膜(Bio-RBCm)。
(5)生物素修饰的红细胞膜包裹介孔二氧化硅负载的抗癌药物(Bio-RBCm@MSN-DOX)
将生物素修饰后的红细胞膜(Bio-RBCm)和负载抗癌药物的介孔二氧化硅MSN-DOX)加入到PBS溶液中(生物素修饰后的红细胞膜、负载抗癌药物的介孔二氧化硅和PBS溶液的质量比为1:1:40)，在超声浴中处理30min，充分分散后，用脂质体挤出器过滤，得到具有生物素修饰红细胞膜包覆的介孔二氧化硅纳米粒子。为了提高产品的保质期，可以进行冷冻干燥。
实施例2.
采用实施例1中步骤(1)的方法，制备介孔二氧化硅。由于作为药物载体，介孔二氧化硅的尺寸不能过大或过小，在100-200nn之间最好。因此，实施例1制备的介孔二氧化硅作为药物载体最佳。
对实施例1制备的介孔二氧化硅进行载药性能测试，载药量可以达到约30％，实现了介孔硅的高载药量，提高了负载效率(在现有技术中，常规的药物载体的载药量为5-8％)。采用实施例1的方法，将抗癌药物DOX负载在介孔二氧化硅上，调控不同浓度的抗癌药物DOX，最终得到载药量最大时，DOX的浓度为450μg/mL(如图3所示)，药物负载效果好，为以后的药物或其他大分子、蛋白质等负载提供了可能性。
实施例3.
实施例3的操作步骤与实施例1相同，不同点在于：实施例3的操作步骤中没有进行步骤(4)对红细胞膜进行生物素修饰，最终得到红细胞膜包覆的介孔二氧化硅纳米粒子(RBCm@MSN-DOX)。
对实施例1、3制备的Bio-RBCm@MSN-DOX、RBCm@MSN-DOX、RBCm进行透射电镜扫描，得到图1。图1中：a为合成的Bio-RBCm@MSN-DOX透射电镜图，比例尺为200纳米；b为Bio-RBCm@MSN-DOX的高倍透射电镜图，比例尺为10纳米；图c为挤出的红细胞膜囊泡的透射电镜图，比例尺为200纳米；图d为RBCm@MSN-DOX的透射电镜图，比例尺为200纳米。
图2为Bio-RBCm@MSN-DOX、RBCm@MSN-DOX、RBCm vesicle、MSN-DOX粒径分布图。由图2可知，Bio-RBCm@MSN-DOX、RBCm@MSN-DOX、RBCm vesicle、MSN-DOX的粒径分布相接近。
对Bio-RBCm@MSN-DOX、RBCm@MSN-DOX、MSN-DOX、DOX在不同pH的PBS溶液中进行释药的实验测试，结果如图4所示。图4a为Bio-RBCm@MSN-DOX、MSN-DOX、DOX在pH＝5的PBS溶液中随时间变化的释药情况；图4b为Bio-RBCm@MSN-DOX、MSN-DOX在pH＝7.4的PBS溶液中随时间变化的释药情况。由图4可知，本发明制备的Bio-RBCm@MSN-DOX在不同pH下都可以具有释药效果，且释药效果缓慢、长效。
实施例4：检测纳米粒子的靶向效果
将实施例1、3制备的Bio-RBCm@MSN-DOX、RBCm@MSN-DOX、RBCm、MSN-DOX分别与Hela细胞共孵育时，通过流式细胞仪检测DOX的荧光强度来确定纳米粒子进入肿瘤细胞的数量。在Bio-RBCm@MSN-DOX、RBCm@MSN-DOX、RBCm、MSN-DOX纳米粒子浓度相同时，检测荧光强度。
检测到Bio-RBCm@MSN-DOX组荧光强度高于RBCm@MSN-DOX、MSN-DOX两组，Bio-RBCm@MSN-DOX组检测到的荧光强度是MSN-DOX组的4.64倍，说明生物素具有较好的Hela的靶向能力。RBCm@MSN-DOX组的荧光强度是MSN-DOX组的1.71倍，红细胞膜的存在，会促使纳米粒子与肿瘤细胞进行磷脂层融合，对纳米粒子进入肿瘤细胞有部分促进作用。
实施例5：某公司测定该核壳结构纳米粒子生物相容性及细胞毒性。
(1)采用不同浓度的实施例1制备的MSN、Bio-RBCm@MSN分别与Hela细胞共孵育时，检测细胞存活率，结果如图5a所示。
由图5a可知，对Hela细胞用不同浓度的MSN、Bio-RBCm@MSN处理后，MSN条件下细胞存活率低于80％，而Bio-RBCm@MSN在浓度为80μg/mL时，细胞存活率仍大于90％，说明在细胞膜包覆及生物素靶向修饰后，生物相容性良好。
(2)采用不同浓度的实施例1制备的MSN-DOX、DOX、Bio-RBCm@MSN分别与Hela细胞共孵育时，检测细胞毒性，结果如图5b所示。
由图5b可知，在纳米粒子载药后，随Bio-RBCm@MSN-DOX浓度的增加具有较好的杀死肿瘤细胞的效果。因Bio-RBCm@MSN-DOX具有靶向效果，细胞存活率(15.38％)低于MSN-DOX(16.30％)，具有更强的细胞毒性，有效提高药物载体的生物利用率。
由本发明的实施例可知，本发明利用红细胞膜上CD47蛋白的抗巨噬细胞识别的能力，制备模仿红细胞的长循环纳米载体。通过调控所加正硅酸四乙酯及表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵的比例，制备大孔介孔硅，实现纳米粒子的高载药性能。通过引入生物素，利用肿瘤附近酸性微环境实现纳米粒子的精准靶向。通过以上物质的结合及包覆，锚定，形成宏观尺度下具有多层级化结构的仿生纳米粒子，使得载药纳米载体具有靶向长循环的特性，同时可以实现药物载体的个性化，降低患者对纳米药物载体的非特异性免疫。其层级化的结构具有很大的可操作性和特异性性，可以实现不同患者特定的个性化需求。
以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备介孔二氧化硅；
(2)负载抗癌药物：将所述的介孔二氧化硅和抗癌药物加入到水中，并搅拌12h后，得负载抗癌药物的介孔二氧化硅；
(3)修饰红细胞膜：将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素与破碎的红细胞膜，在4℃下搅拌12h后，用微型挤出机通过200nm滤膜连续挤出，得生物素修饰后的红细胞膜；
(4)将所述的生物素修饰后的红细胞膜和所述的负载抗癌药物的介孔二氧化硅加入到PBS溶液中，充分分散后，用微型挤出机过滤，得到具有生物素修饰红细胞膜包覆的介孔二氧化硅纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述的制备介孔二氧化硅的方法为：
将正戊醇、TEOS加入到环己烷中，搅拌均匀后，加入CTAB和去离子水并搅拌，再在120℃下反应2h，然后用去离子水洗涤、干燥、煅烧，得白色粉末的介孔二氧化硅。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述的正戊醇、TEOS、环己烷、CTAB和去离子水得质量比为2:4:30:2.44:30。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述的干燥温度为70℃，煅烧温度为550℃，煅烧时间为6h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述的步骤(2)中，介孔二氧化硅、抗癌药物和水的质量比为5:1：20；
所述的步骤(3)中，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素与红细胞膜的质量比为1:5。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述的抗癌药物为抗癌药物DOX。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述的红细胞膜的制备：将红细胞分散在pH为7.4的PBS中，胀破后，离心分离，得破碎的红细胞膜。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述的步骤(4)中，所述的生物素修饰后的红细胞膜、所述的负载抗癌药物的介孔二氧化硅和PBS溶液的质量比为1:1:40；
所述的步骤(4)中，采用超声分散处理0.5h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述的步骤(4)中，用脂质体挤出器过滤后，进行冷冻干燥。
10.一种具有靶向长循环的多级仿生纳米药物载体，其特征在于，所述的多级仿生纳米药物载体采用权利要求1-9任一项所述的制备方法制备而成。
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