CN108524469A - 一种主动靶向生物膜纳米制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药学及生物学领域，涉及一种主动靶向生物膜纳米制剂的制备方法，以及构建的脑靶向分子修饰的生物膜纳米制剂。尤其涉及结合膜插入法与“链霉亲和素‑生物素”策略将靶向分子修饰到生物膜表面制备主动靶向生物膜纳米制剂的方法，及制备的DCDX修饰的红细胞膜制剂，以及其在脑部疾病影像和靶向治疗中的应用。经试验结果表明，本发明的方法制备的主动靶向生物膜纳米制剂具有普适性的优点，所构建的DCDX修饰的红细胞膜制剂可增加药物的入脑量，在脑部疾病的诊断和治疗中具备良好的应用前景。

Description

一种主动靶向生物膜纳米制剂的制备方法
技术领域
本发明属于药学及生物学领域，涉及一种主动靶向生物膜纳米制剂的制备方法，以及构建的脑靶向分子修饰的生物膜纳米制剂。尤其涉及结合膜插入法与“链霉亲和素-生物素”策略将靶向分子修饰到生物膜表面制备主动靶向生物膜纳米制剂的方法，及制备的DCDX修饰的红细胞膜制剂，以及其在脑部疾病影像和靶向治疗中的应用。
背景技术
近年来，生物膜包覆药物的纳米制剂作为一种新型的纳米药物递送系统在药学领域得到广泛的研究与报道。作为一种新型的仿生制剂，生物膜包覆药物的纳米制剂在兼具了传统纳米药物优点的同时，明显增强了该制剂在临床用药的安全性。
目前对生物膜包覆纳米药物的制剂研究主要集中在抗肿瘤研究方面，且这种包覆抗肿瘤药物的生物膜制剂主要基于生物膜的长循环功能及肿瘤部位EPR效应特点的被动靶向研究，而对主动靶向的生物膜制剂研究甚少。其进展缓慢的主要原因是作为内源性的仿生膜，生物膜表面各种化学敏感的生物学特性限制了常规的化学修饰法在生物膜表面的应用。现有技术中主动靶向生物膜制剂的制备，主要是通过脂质插入法实现，即将具有脂质插入功能的靶向分子通过共孵育手段直接插入到生物膜的脂质层中，但该法有其局限性：1)生物膜表面带有较强的负电荷，由于静电作用的缘故，限制了带正电荷的靶向分子的修饰；2)由于生物膜是具有双分子层的脂质结构，同样限制了脂溶性靶向分子的修饰。
“链霉亲和素-生物素”系统在生物学领域具有广泛的应用。由于链霉亲和素与生物素之间存在很强的结合力，其结合常数约为1×10-15mol/L，故两者之间的结合可视为不可逆结合；此外，一分子链霉亲合蛋白可与四分子生物素结合，因而“链霉亲和素-生物素”系统亦具有生物学放大效应。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种主动靶向生物膜纳米制剂的制备方法，进一步利用该方法制备脑靶向分子修饰的生物膜纳米制剂，实现生物膜纳米制剂的脑靶向递送功能，
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种主动靶向生物膜纳米制剂的制备方法，进一步利用该方法制备脑靶向分子修饰的生物膜纳米制剂，实现生物膜纳米制剂的脑靶向递送功能。
本发明一方面提供了一种主动靶向生物膜纳米制剂的制备方法。
本发明进一步提供了一种脑靶向分子修饰的生物膜纳米制剂，可以实现生物膜纳米制剂的脑靶向递送。
本发明结合传统生物膜靶向制剂的脂质插入法与“链霉亲和素-生物素”策略，将链霉亲和素通过脂质插入法修饰到生物膜表面，为生物素提供结合位点，同时作为分子量约为58KD的蛋白，亲和素可以屏蔽生物膜表面电荷对靶向分子的影响；然后，通过“链霉亲和素-生物素”方式，将生物素化的靶向分子结合到生物膜纳米制剂的表面，制备获得具有主动靶向功能的生物膜纳米制剂。
进一步，本发明利用所述方法制备了脑靶向分子修饰的生物膜纳米制剂，实现了生物膜纳米制剂的脑靶向递送功能，在脑部疾病诊治方面的具有良好的应用前景。
更具体的，本发明通过结合传统的脂质插入法与“链霉亲合素-生物素”策略的制备方法，将具有脂质插入功能的链霉亲和素插入生物膜纳米制剂表面，如红细胞膜、血小板膜、巨噬细胞膜、肿瘤细胞膜、干细胞膜等具有脂质结构的生物膜，再使生物素化靶向分子与链霉亲和素结合将靶向分子修饰在到生物膜纳米制剂，制备得到具有主动靶向功能的生物膜纳米制剂。
本发明中，通过共价键连接形成链霉亲和素-聚乙二醇-磷脂复合物，。其中聚乙二醇的分子量范围是1000～20000，优选分子量为2000和3400；磷脂为各种天然的或合成的磷脂，优选二硬脂酸磷脂酰胆碱。
本发明中，通过共价连接将生物素与靶向分子连接形成生物素化靶向分子，生物素与靶向分子间的距离可通过不同长短的PEG链进行改善，如PEG1000、PEG2000、PEG3400、PEG5000，以PEG2000、PEG3400为最佳。
本发明中，进一步利用所述的的方法制备了脑靶向多肽分子DCDX修饰的红细胞膜纳米制剂(DCDX-RBCNP)。
本发明的DCDX-RBCNP可包载诊断或治疗药物，如荧光物质香豆素6、FAM，近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、DiD，抗肿瘤药物阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替佐米、小白菊内酯等。
本发明的DCDX-RBCNP可增加所载药物的脑内递送，用于脑部疾病的诊断和治疗。
本发明提供了一种主动靶向生物膜纳米制剂的制备方法以及以此方法制备的DCDX-RBCNP用于脑部疾病诊疗的基础。本发明的试验结果表明：制备的DCDX修饰的红细胞膜制纳米剂粒径约为70nm左右，。受体结合实验证明其可与乙酰胆碱受体结合，表明通过该法制备，DCDX不仅成功嫁接在红细胞膜表面，而且可以避免电荷因素的影响，保持与受体的结合活性；DCDX-RBCNP与未修饰的红细胞膜制剂(RBCNP)的具有相似的稳定性，即该靶向分子嫁接后对红细胞膜制剂的稳定性亦无任何影响；与RBCNP相比，DCDX-RBCNP被脑毛细血管内皮细胞的摄取明显增加，并且顺利跨越体外血脑屏障(BBB)模型；体内活体成像实验表明，DCDX-RBCNP的脑内分布比RBCNP明显提高；载阿霉素(DOX)的DCDX-RBCNP可显著延长原位瘤模型裸鼠的中位生存期；实验结果说明，DCDX-RBCNP可实现体内的脑靶向，证明了本发明的主动靶向生物膜纳米制剂制备方法的有效性与优越性。
本发明的实施例中公开了：
DCDX-RBCNP的制备与表征
将链霉亲和素巯基化，与Mal-聚乙二醇-磷脂缩合形成链霉亲和素-聚乙二醇-磷脂复合物，将链霉亲和素-聚乙二醇-磷脂复合物加入至红细胞膜包覆纳米粒的制备体系中，通过脂质插入过程得到链霉亲和素修饰的红细胞膜包覆纳米粒，Mal-PEG-NH2依次与生物素活泼酯和巯基化DCDX反应得生物素化DCDX，再与链霉亲和素修饰的红细胞膜包覆纳米粒孵育得DCDX-RBCNP；
激光散射粒度仪表征粒径、粒径分布、Zeta电势，以及制剂稳定性；透射电镜观察其形貌，并以免疫金胶法考察表面靶分子修饰。
DCDX-RBCNP体内外靶向性评价
制备载荧光素DiI或DiD的DCDX-RBCNP，考察体外原代细胞对DCDX-RBCNP/DiI的摄取情况以及DCDX-RBCNP/DiD跨血脑屏障体外模型的情况，
通过正常小鼠和荷原位脑胶质瘤模型裸鼠尾静脉分别注射DCDX-RBCNP/DiD和RBCNP/DiD，活体成像法考察制剂在正常小鼠和荷瘤裸鼠脑内以及荷瘤裸鼠脑肿瘤组织的分布。
DCDX-RBCNP药动学评价
ICR小鼠分别尾静脉注射DCDX-RBCNP/DiI或RBCNP/DiI，于一定时间点取血，测定血内荧光素含量，绘制药动学曲线。
DCDX-RBCNP的体内抗脑肿瘤药效评价
通过荷U87原位瘤模型裸鼠尾静脉分别注射DCDX-RBCNP/DOX、RBCNP/DOX、游离DOX，生理盐水，以中位生存期为指标评价载DOX红细胞膜制剂的体内抗脑肿瘤效果。
附图说明
图1显示了生物素-PEG3500-DCDX的核磁表征
由1H-NMR(DMSO-D6)图谱可见，各共振峰为:δ7.957(m,4H,-CONH-),δ7.862(s,1H,-CONH-),δ7.239(m,4H,guanidino),δ6.799(m,2H,guanidino),δ6.564(m,Ph,2H),δ6.694(s,Ph,1H),δ6.428-6.236(m,Ph,1H),δ4.581(t,1H),δ4.449(t,1H),δ4.326(m,2H),δ4.125(m,1H),δ3.680(m,3H),δ3.507(s,318H,-OCH2CH2 O-),δ3.393(s,7H),δ3.193-3.179(m,6H),δ3.006(m,2H),δ2.906-2.860(m,3H),δ2.331-2.239(m,3H),δ1.734(m,3H),δ1.534-1.236(m,8H)。
图2显示了红细胞膜包覆纳米粒的电镜表征
标尺为50nm。由图可知，DCDX修饰前后红细胞膜包覆纳米粒粒径在70nm左右，其中接有烟碱型乙酰胆碱受体蛋白的超小金纳米粒在DCDX-RBCNP表面均匀分布，而RBCNP没有该现象，说明DCDX成功修饰到了红细胞膜包覆纳米粒表面并保持其与受体结合的能力。
图3显示了红细胞膜包覆纳米粒在PBS溶液中的粒径稳定性
图为三种纳米粒在PBS溶液中孵育不同时间后的粒径变化。由图可知，PLGA纳米粒在PBS溶液中易发生聚集，而两种红细胞膜包覆纳米粒在48小时内粒径均未发生明显改变，说明红细胞膜包覆的纳米粒体外稳定性良好，DCDX的修饰不影响其体外稳定性。
图4显示了红细胞膜包覆纳米粒在水中的电势稳定性
图为三种纳米粒在水中孵育不同时间后的电势变化，由图可知，三种纳米粒在48小时内电势均未发生明显改变，其中PLGA纳米粒电势保持在-33mV左右，RBCNP电势保持在-27mV左右，DCDX-RBCNP电势保持在-22mV左右。
图5显示了原代脑毛细血管内皮细胞对载DiI红细胞膜包覆纳米粒摄取的激光共聚焦照片，
标尺为10μm。由图可知，原代脑毛细血管内皮细胞对DCDX-RBCNP有明显摄取。
图6显示了原代脑毛细血管内皮细胞对载DiD红细胞膜包覆纳米粒摄取的流式结果，
由图可知，原代脑毛细血管内皮细胞对DCDX-RBCNP的摄取更多，相较于RBCNP，其摄取平均荧光强度增加约两倍，具有显著性差异。
图7显示了红细胞膜包覆纳米粒体外BBB转运
图为两种红细胞膜包覆纳米粒于不同时间点跨体外血脑屏障模型后下室的量，由图可知，在0.5小时，1小时，1.5小时和2小时，DCDX-RBCNP转运通过体外BBB模型的量明显高于RBCNP，且这种转运可被DCDX多肽本身所抑制，说明DCDX-RBCNP的跨体外BBB行为是由受体介导的。
图8显示了载DiD红细胞膜包覆纳米粒的小鼠脑及脑肿瘤内分布
图为正常小鼠、荷原位脑胶质瘤裸鼠于肿瘤接种后第7天和第14天后分别注射DCDX-RBCNP/DiD、RBCNP/DiD 24小时后脑及脑肿瘤离体成像分布结果，由图可知，DCDX-RBCNP在正常小鼠脑、荷瘤裸鼠脑及脑肿瘤区域均呈现更高的分布，其荧光半定量结果具有显著性差异。
图9显示了载DiI红细胞膜包覆纳米粒的小鼠体内药动学
由图可知，两种红细胞膜包覆纳米粒的小鼠血内药动学行为无明显差异，说明DCDX修饰后不影响红细胞膜包覆纳米粒的体内稳定性。
图10显示了原位脑胶质瘤模型裸鼠的生存曲线
由图可见，生理盐水组、游离阿霉素组、RBCNP/DOX组和DCDX-RBCNP/DOX中位生存时间分别为22、22.5、23.5和28.5天，结果表明，与其余各组相比，DCDX-RBCNP/DOX可显著延长原位脑胶质瘤模型裸鼠的生存时间。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。
实施例1
链霉亲和素-PEG3400-DSPE与生物素-PEG3500-DCDX的合成与表征
链霉亲和素-PEG3400-DSPE的合成如下：20mg链霉亲和素溶于2mL硼酸盐缓冲液(pH7.6)，加入10倍过量的Traut试剂于室温反应2h，4℃超滤纯化得巯基化链霉亲和素。5mg的Mal-PEG3400-DSPE溶于1mL二氯甲烷中，旋蒸成膜，加入上述反应得到的巯基化链霉亲和素溶液，于37℃反应1h，透析纯化后冷冻干燥即得；
生物素-PEG3500-DCDX的合成如下：0.41mmoL生物素溶于1mL二氯甲烷，加入0.615mmoLN-羟基琥珀酰亚胺和0.615mmoL 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，于氮气保护下室温搅拌12h，反应溶液滴入10mL乙醚中沉淀得生物素活泼酯。100mg MAL-PEG-NH2溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺，加入11.2mg生物素活泼酯，于氮气保护下室温反应8h，反应溶液滴至冰乙醚中沉淀得生物素-PEG3400-MAL。50mg巯基化的DCDX多肽溶于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.6)，加入80.2mg生物素-PEG3400-MAL，室温反应2h，反应液透析纯化后冷冻干燥得生物素-PEG3500-DCDX，核磁表征其结构如图1所示。
实施例2 DCDX-RBCNP的制备与表征
1)DCDX-RBCNP的制备
取雄性ICR小鼠全血，离心(1000g/min，4℃)5min，弃去上层血清与白细胞层，用1×PBS洗涤下层红细胞后，于4℃在0.25×PBS中重悬30分钟，离心(15000g/min，4℃)7min去除血红蛋白，所得到的浅红色红细胞膜重悬并保存于双蒸水中；
称取10mg聚乳酸-乙醇酸(PLGA)，溶于1mL丙酮中，滴加入3mL双蒸水，真空干燥2小时后得到PLGA纳米粒(NP)；
将红细胞膜混悬液100W超声3min，得到红细胞膜囊泡。将40μL链霉亲和素-PEG3400-DSPE的PBS溶液(5mg/mL)与从100μL全血中取得的红细胞膜囊泡在37℃水浴中孵育30min，再与100μL PLGA纳米粒(5mg/mL)混合后使用微型挤出器挤压过100nm核孔膜，得到链霉亲和素-红细胞膜包覆纳米粒，然后加入100μL生物素-PEG3500-DCDX的PBS溶液(0.1mg/mL)，37℃水浴中孵育10分钟，得到DCDX-RBCNP；
2)DCDX-RBCNP的表面靶向分子验证
将DCDX-RBCNP、RBCNP分别与接有烟碱型乙酰胆碱受体蛋白的超小金纳米粒(5nm)在37℃水浴中孵育2小时，电镜观察金纳米粒与两种红细胞膜包覆纳米粒的结合情况，结果如图2所示：
3)DCDX-RBCNP的体外稳定性
动态光散射法测定DCDX-RBCNP、RBCNP、NP在48小时内粒径及表面电势变化，PBS中粒径稳定性结果见附图3，水中电势稳定性结果如图4所示。
实施例3 DCDX-RBCNP的体外靶向性验证
1)DCDX-RBCNP/DiI与DCDX-RBCNP/DiD的制备
DiI或DiD的载药通过将DiI或DiD与PLGA共同溶解于丙酮中制备载DiI或载DiD的PLGA纳米粒，其他制备过程同空白DCDX-RBCNP；
2)DCDX-RBCNP对原代脑毛细血管内皮细胞的体外靶向性验证
4周龄SD大鼠断头后取脑，于预冷D-Hanks溶液中迅速分离得到大脑皮层，滚去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和DNA酶于37℃消化90min，1000rpm离心8min，弃去上清，转移至20％BSA的DMEM溶液中，离心(1000g/min，4℃)20min，弃去上层液体，将底部微血管转移至DMEM培养液中，1000rpm离心5min，用含20％FBS的DMEM培养液重悬微血管段，接种于共聚焦皿或12孔板中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24小时，换含有嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养72小时后，再换含有细胞生长因子的内皮专用培养液培养72小时，得原代脑毛细血管内皮细胞；
用含10％FBS的DMEM培养液配制荧光浓度为5μM的DCDX-RBCNP/荧光素与RBCNP/荧光素溶液，将共聚焦皿或12孔板中的DMEM培养液吸出，共聚焦皿中加入DCDX-RBCNP/DiI与RBCNP/DiI溶液，12孔板中加入DCDX-RBCNP/DiD与RBCNP/DiD溶液，37℃孵育4小时，弃去培液并用PBS溶液洗涤三次后4％多聚甲醛固定，DAPI染核10min，PBS洗涤两次后共聚焦显微镜观察，细胞内化照片见附图5。或用PBS洗板两次，加入胰蛋白酶消化细胞，用DMEM培养液分散细胞后离心，弃上清，PBS洗涤两次，最后将每孔细胞分散于400μLPBS，流式细胞仪测定，结果如图6所示；
3)DCDX-RBCNP跨体外血脑屏障能力考察
同上方法得用含20％FBS的DMEM培养液重悬的微血管段，接种于预先铺有鼠尾胶原的24孔transwell中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24小时，换含有嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养72小时后，再换含有细胞生长因子的内皮专用培养液培养72小时，测得电阻超过250Ω/cm2，即体外BBB模型构建成功；
用含10％FBS的DMEM培养液配制荧光浓度为50μM的DCDX-RBCNP/DiD与RBCNP/DiD溶液，将transwell上室中的DMEM培养液或预先孵育1小时的DCDX溶液吸出，分别加入上述制剂溶液，分别于0.5小时，1小时，1.5小时，2小时取下室培养液测其荧光浓度，各制剂BBB转运结果如图7所示。
实施例4 DCDX-RBCNP的体内靶向性验证
原位脑胶质瘤模型鼠的建立：取对数生长期的U87细胞，每只裸小鼠接种5×105个细胞(分散于5μLPBS缓冲液中)。裸小鼠麻醉后，用脑立体定位仪固定，细胞接种于纹状体右部(前囟前0.6mm，侧1.8mm，深3mm)。定期观察裸小鼠状态；
将正常小鼠、上述原位脑胶质瘤模型建模7天后裸鼠及原位脑胶质瘤模型建模15天后裸鼠分别尾静脉注射150μLDCDX-RBCNP/DiD或RBCNP/DiD。24小时后水合氯醛麻醉，生理盐水心脏灌流，用活体成像仪检测脑及脑肿瘤的荧光分布，结果如图8所示。
实施例5 DCDX-RBCNP的体内药动学
将ICR小鼠分别尾静脉注射150μLDCDX-RBCNP/DiI或RBCNP/DiI，于0、5、15、30min，1、2、4、8、24和48h取30μL全血，以70μLPBS稀释后测定其血中荧光含量，结果如图9所示。
实施例6载阿霉素的DCDX-RBCNP体内药效学评价
1)DCDX-RBCNP/DOX的制备
DOX的载药通过将DOX溶于水，PLGA溶于二氯甲烷中，以乳化法制备载DOX的PLGA纳米粒，其他制备过程同空白DCDX-RBCNP；
2)DCDX-RBCNP/DOX的体内药效
脑胶质瘤原位肿瘤模型裸鼠尾静脉分别注射生理盐水、游离DOX、RBCNP/DOX或DCDX-RBCNP/DOX。给药总剂量为7.5mg/Kg，分别于肿瘤种植后第7、9、11、13和15天给药，记录裸鼠的生存时间(如图10所示)，与其它各组相比，DCDX-RBCNP/Dox显著延长原位脑胶质瘤模型裸鼠生存时间。

Claims (9)

1.一种主动靶向的生物膜纳米制剂的制备方法，其特征在于，其包括，通过结合膜插入法与“链霉亲和素-生物素”方式，将具有脂质插入功能的链霉亲和素插入生物膜纳米制剂表面，再使生物素化靶向分子与其结合，制备主动靶向的生物膜纳米制剂。
2.按权利要求1所述的主动靶向的生物膜纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述的生物膜是具有脂质结构的生物膜，包括红细胞膜、血小板膜、巨噬细胞膜、肿瘤细胞膜、干细胞膜。
3.按权利要求1所述的主动靶向的生物膜纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述的具有脂质插入功能的链霉亲和素，通过共价键连接形成的链霉亲和素-聚乙二醇-磷脂复合物，其中聚乙二醇的分子量范围是1000～20000，优选分子量为2000和3400；磷脂为各种天然的或合成的磷脂，优选二硬脂酸磷脂酰胆碱。
4.按权利要求1或3所述的主动靶向的生物膜纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述的具有脂质插入功能的链霉亲和素，通过共价键连接形成的链霉亲和素-聚乙二醇-磷脂复合物，其中聚乙二醇的分子量范围是2000和3400；磷脂为二硬脂酸磷脂酰胆碱。
5.按权利要求1所述的主动靶向的生物膜纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述的生物素化靶向分子，是通过生物素与靶向分子之间的共价连接而得，两者间的距离通过不同长短的PEG链改善，选自PEG1000、PEG2000、PEG3400、PEG5000。
6.按权利要求1或5所述的主动靶向的生物膜纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述的生物素化靶向分子是PEG2000、PEG3400。
7.一种脑靶向分子修饰的生物膜纳米制剂，其特征是，脑靶向分子为D构型多肽DCDX，氨基酸序列DGDRDEDIDRDTDGDRDADEDRDWDSDEDKDF，通过膜插入法与“链霉亲和素-生物素”方式修饰获得，包括红细胞膜、血小板膜、巨噬细胞膜、肿瘤细胞膜、干细胞膜纳米制剂。
8.按权利要求7所述的脑靶向分子修饰的生物膜纳米制剂，其特征是，所述的脑靶向分子修饰的生物膜纳米制剂是红细胞膜纳米制剂。
9.按权利要求7所述的脑靶向分子修饰的生物膜纳米制剂，其特征是，所述的生物膜纳米制剂用于包载诊断或治疗脑部疾病的药物。
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