CN112778134B - 绿原酸钙盐倍半水合物及用途 - Google Patents

绿原酸钙盐倍半水合物及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种如式(I)所示的绿原酸钙盐倍半水合物及结晶形式，以及其作为活性成分制备的产品在防治疾病和保健中的应用。
Figure DDA0002266427660000011

Description

绿原酸钙盐倍半水合物及用途
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种绿原酸钙盐倍半水合物及其用途。
背景技术
绿原酸(Chlorogenic acid)，又名咖啡单宁酸或咖啡鞣酸，是由咖啡酸(caffeicacid)与奎宁酸(金鸡纳酸，quinic acid)缩合形成缩酚酸，是植物体有氧呼吸代谢的产物。绿原酸化学名为5-氧-咖啡酰奎宁酸(5-O-caffeoylquinic acid)，分子式：C16H18O9，分子量：354.31，结构式如下所示。
Figure BDA0002266427640000011
绿原酸是一种重要的生物活性物质，现有技术公开了其具有多种用途：
1、抗肿瘤：如预防和治疗鼻咽癌(CN200610021897.1)；预防和治疗小细胞肺癌(CN200710140602.7)；预防和治疗膀胱癌(CN201210086313.4)；预防和治疗室管膜瘤(CN201410468334.1)；预防和治疗少突胶质瘤(CN201410468312.5)；预防和治疗宫颈癌(CN200610021591.6)；预防和治疗女性器官肿瘤(CN200610021909.0)；预防和治疗肺母细胞瘤(CN201510078820.7)；预防和治疗原发性皮肤T细胞淋巴癌(CN201510079639.8)；治疗黑色素瘤(CN201510079033.4)；治疗卵黄囊瘤(CN201510053341.X)；治疗绒毛膜癌(CN201510080133.9)；CN201710719094.1、CN201710714132.4、CN201810206147.4、CN201710719622.3等中国专利还公开了绿原酸和其他药物联合用药具有抗肿瘤、抗癌、治疗肿瘤多药耐药性等作用；
2、治疗自身免疫性疾病：中国专利CN201510568417.2公开了绿原酸能够激活机体的免疫相关信号通路；还具有如治疗红斑狼疮(CN201510078874.3)；增加免疫功能(CN200510088025.2)；治疗白癜风(CN201410778100.7)；治疗银屑病(CN201410490695.6)等作用；
3、抗氧化、抗衰老、抗肌肉骨骼老化：如抗缺氧(ZL200710128491.8)；治疗和/或预防眼部炎症(CN201710051216.4)；肌营养不良疾病(CN201510580291.0)；治疗早衰症(CN201510072776.9)等；
4、保护心血管：治疗心肌病(CN201510078634.3)等；
5、其他用途：中国专利CN200680024175.X公开了绿原酸具有增加骨髓细胞的功效；中国专利CN200910246627.4公开了绿原酸具有治疗血小板减少症、贫血的功效；中国专利CN200910246134.0公开了绿原酸对脾脏造血干细胞损伤有保护、修复作用；中国专利CN200910246630.6公开了绿原酸具有治疗骨髓纤维化的功效；中国专利CN201510078953.4公开了绿原酸可以治疗荨麻疹；中国专利CN201510063970.0公开了绿原酸具有治疗骨硬化病的功效；中国专利CN201510568285.3公开了绿原酸能够激活机体的WNT信号通路；中国专利CN201510123289.0公开了绿原酸具有促进成纤维细胞增殖的作用；中国专利CN201110386854.4、CN201310210438.8、CN200510088023.3等公开了绿原酸具有保肝作用；中国专利CN200610021590.1公开了绿原酸具有雌激素样或促雌激素样作用；中国专利CN201510078629.2公开了绿原酸具有治疗病理性黄疸的作用；中国专利CN201510079127.1公开了绿原酸可以用于治疗癫痫；中国专利CN200910246133.6公开了绿原酸可以治疗骨髓感染；中国专利CN201510078986.9公开了绿原酸可以治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症；中国专利CN201510079049.5公开了绿原酸可以治疗帕金森病；中国专利CN201610149050.5的公开了绿原酸可以抑制LAG-3靶点等等。
绿原酸虽然具有很好的药理活性，但由于其口服吸收差、胃肠道首过效应大，半衰期短、易被肠道菌群降解等因素，造成生物利用度极低(＜1％)，较难制成口服制剂发挥药效。非肠道给药特别是注射给药可以解决其生物利用度低的问题，但由于其半衰期较短、药效持续时间短，一日内需要多次给药血药浓度不平稳，又影响其药效的发挥。且CN201410680646.9提到绿原酸对Lewis肺癌、H22肝癌、EMT-6乳腺癌、人脑胶质瘤小鼠移植瘤均有明显的抑制作用，但抑瘤效果并不是和剂量成正相关，相反达到一定剂量后，随着剂量升高，药效逐步下降。因此体内血药浓度过高，药物的抑瘤作用反而可能下降，因此在血药浓度维持在一定范围内更利于药效的发挥。
为能充分发挥本品的应用价值需要寻找一种可以实现一日一次的平稳释放的注射给药系统，但由于新型的缓释注射给药制剂(缓释微球、植入剂等)载药量低、工业化技术难度大等原因限制了其成药性。不加辅料的混悬型肌内注射/皮下给药作为药物储库成为了最优选的给药方案。储库中的药物可缓慢溶解释放进入血循环，维持体内平稳的血药浓度，避免了注射给药血药浓度的剧烈波动(开始阶段血药浓度过高，由于药物半衰期短，血药浓度快速下降)，从而更好的发挥绿原酸对肿瘤的抑制作用。但由于绿原酸及其它盐/配位化合物本身的溶解度较好(均大于10mg/ml左右)，限制其制成混悬型注射给药系统的可能性。
针对以上不足，因此需要提供一种溶解度更低的绿原酸作为活性成分的相关物质来实现该目的。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明要解决的技术问题在于提供一种绿原酸半钙盐倍半水合物及其应用，本发明提供的绿原酸钙盐倍半水合物稳定性好、溶解度低、刺激性小，能够实现作为储库型注射给药的药物活性成份。
(二)技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种式(I)所示的绿原酸钙盐倍半水合物。
Figure BDA0002266427640000041
本发明提供一种绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式，其特征在于，X-射线粉末衍射图包括下列特征峰：5.570、11.172、12.539、14.034、15.869、17.973、23.278°，误差为±0.2°。
本发明提供一种绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式，其特征在于，X-射线粉末衍射图包括下列特征峰：5.570、11.172、11.810、12.539、14.034、15.869、17.074、17.973、18.871、23.278、25.922°，误差为±0.2°。
本发明提供一种绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式，其特征在于，X-射线粉末衍射图包括下列特征峰：5.570、5.997、7.926、10.057、11.172、11.810、12.539、14.034、15.869、16.323、17.074、17.973、18.871、21.346、23.278、25.922、26.344、28.163、30.235、31.687°，误差为±0.2°。
本发明的绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式的X-射线粉末衍射如图1所示。
本发明的绿原酸钙盐倍半水合物利用热重分析仪器测定的图谱表明样品中含1.5分子的结晶水。
本发明还提供一种式(I)所示的绿原酸钙盐倍半水合物的制备方法，其特征在于，将绿原酸加入水中，然后滴加碳酸氢钠水溶液并搅拌反应，然后向体系中滴加氯化钙溶液并搅拌反应，过滤，水洗，真空干燥，得到绿原酸钙倍半水合物。
本发明的式(I)所示的绿原酸钙盐倍半水合物的制备方法，其特征在于，绿原酸：碳酸氢钠：氯化钙的摩尔比例为0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2。
本发明的式(I)所示的绿原酸钙盐倍半水合物的制备方法，其特征在于，滴加氯化钙的温度为0～40℃，优选10～30℃，更优选20℃。
本发明的式(I)所示的绿原酸钙盐倍半水合物的制备方法，其特征在于，滴加氯化钙溶液并搅拌反应的时间为15min～5h，优选30min～2h，更优选1h。
本发明的式(I)所示的绿原酸钙盐倍半水合物的制备方法，其特征在于，真空干燥温度为30～70℃，优选45～65℃，最优选55℃。
本发明还提供了一种药物组合物，其特征在于，包括式(I)所示的绿原酸钙盐倍半水合物和一种或多种可药用赋形剂。
本发明的药物组合物，其在临床上可以用于口服、非肠道给药相关制剂。
本发明还提供一种式(I)所示的绿原酸钙盐倍半水合物在制备治疗和/或预防肿瘤、炎性疾病、自身免疫性疾病、抗氧化、抗衰老、抗肌肉骨骼老化或保护心血管的药物中的用途。
所述自身免疫性疾病为牛皮癣、炎症样类风湿性关节炎、狼疮、I型糖尿病、糖尿病肾病、多发性硬化症、肾小球肾炎或器官移植排斥。
所述肿瘤为黑色素瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫癌或脑瘤。
(三)有益效果
本发明的上述技术方案具有如下优点：绿原酸本身具有较强的酸性，其10mg/ml水溶液pH值约为2.5，如此大剂量口服给药会严重刺激胃肠道，带来了临床上较大的安全风险。而绿原酸钙盐倍半水合物由于其近中性的pH值，可以消除其带来的胃肠道刺激。因此，绿原酸钙盐倍半水合物是胃肠道给药的一种良好的活性成分。本发明的绿原酸钙盐倍半水合物的溶解度低于绿原酸，可以用于制备缓释注射给药制剂，提高药物的活性。另外，本发明的绿原酸钙盐倍半水合物在高温、高湿和光照条件下都具有很好的稳定性。
附图说明
图1是本发明的绿原酸钙盐倍半水合物的X-射线粉末衍射图。
图2是本发明的绿原酸钙盐倍半水合物的热失重(TG)分析图。
图3是本发明的绿原酸钙盐倍半水合物在40℃放置10天的X-射线粉末衍射图。
图4是本发明的绿原酸钙盐倍半水合物在60℃放置10天的X-射线粉末衍射图。
图5是本发明的绿原酸钙盐倍半水合物光照10天的X-射线粉末衍射图。
图6是本发明的绿原酸钙盐倍半水合物在75％湿度放置10天的X-射线粉末衍射图。
图7是本发明的绿原酸钙盐倍半水合物在92.5％湿度放置10天的X-射线粉末衍射图。
图8是本发明的绿原酸钙盐倍半水合物针对小鼠黑色素瘤B16F10的体内药效结果。
图9是比格犬口服本发明的绿原酸钙盐倍半水合物的生物利用度试验结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
用于本发明的检测设备如下：
粉末X-射线衍射分析：
日本Rigaku D/max-2550粉末X-射线衍射仪，测试条件：CuKα辐射，管流150mA，管压40kV，扫描速度8°/分，步长0.02°。
热重分析(TG)
测试仪器：瑞士Mettler TGA/DSC1热分析仪，参数设置：起始温度30℃；终止温度500℃；升温速率5K/min
实施例1
将40.0g绿原酸(113mmol)、600mL纯化水加入反应瓶内，20℃下缓慢滴加113mL碳酸氢钠水溶液(1mol/L)，滴毕，同温搅拌30min。然后向体系中缓慢滴加58ml氯化钙溶液(1mol/L)，20℃搅拌1h，过滤，滤饼以少量纯化水淋洗，55℃下真空干燥20h，得类白色固体绿原酸钙盐倍半水合物40.97g，收率90.6％。
热失重分析结果表明在150℃右失重7.079％，是1.5分子水的特征失重；X-射线粉末衍射检测结果表明该晶体为新晶型，该晶体的X-射线粉末衍射谱图详见图1，热失重分析谱图详见图2。
实施例2
将40.0g绿原酸(113mmol)、600mL纯化水加入反应瓶内，20℃下缓慢滴加113mL碳酸氢钠水溶液(1mol/L)，滴毕，同温搅拌30min。然后向体系中缓慢滴加58ml氯化钙溶液(1mol/L)，10℃搅拌30min，过滤，滤饼以少量纯化水淋洗，45℃下真空干燥25h，得类白色固体绿原酸钙盐倍半水合物41.32g，收率91.4％。水分检测结果：6.8％。相应X-射线粉末衍射谱图和热失重分析谱图同实施例1。
实施例3
将40.0g绿原酸(113mmol)、600mL纯化水加入反应瓶内，20℃下缓慢滴加113mL碳酸氢钠水溶液(1mol/L)，滴毕，同温搅拌30min。然后向体系中缓慢滴加58ml氯化钙溶液(1mol/L)，30℃搅拌1.5h，过滤，滤饼以少量纯化水淋洗，65℃下真空干燥20h，得类白色固体绿原酸钙盐倍半水合物38.54g，收率85.3％。水分检测结果：7.1％。相应X-射线粉末衍射谱图和热失重分析谱图同实施例1。
实施例4稳定性实验
有关物质的测定条件如下：
Figure BDA0002266427640000081
Figure BDA0002266427640000091
表1
Figure BDA0002266427640000092
表1为绿原酸钙盐倍半水合物在上述条件下10天的影响因素结果，表明产品比较稳定，在各个条件下基本没有变化。杂质1为原料带入杂质，结构为右侧少一个羟基杂质，结构式为
Figure BDA0002266427640000093
杂质2为未知杂质。各个条件的X-射线粉末衍射图见图3-图7，没有明显变化。
实施例5溶解度
表2
名称 溶解度(mg/ml)
绿原酸 14.41
绿原酸钙倍半水合物 2.94
绿原酸钠 144.0
绿原酸乙醇胺盐 69.4
绿原酸葡甲胺盐 1028
绿原酸赖氨酸盐(L) 1009
绿原酸组氨酸盐(D) 1032
表2的数据表明绿原酸钙盐倍半水合物的溶解度要远远小于绿原酸以及绿原酸的其他盐。
实施例6大鼠胃粘膜刺激性试验
取健康wistar大鼠50只，随机分为5组，每组10只大鼠，雌雄各半，灌胃给药，5组分别为空白对照组，绿原酸高剂量组(160mg/kg)，绿原酸低剂量组(80mg/kg)和绿原酸钙盐高剂量组(160mg/kg)，绿原酸钙盐低剂量组(80mg/kg)，每天给药一次，连续给药15天，空白对照组给予生理盐水。末次给药1h后，脱颈椎处死大鼠，开腹取胃，注入10ml 10％甲醛固定15min，沿胃大弯剪开，用预冷的生理盐水将胃粘膜表面冲洗干净。在解剖显微镜下观察胃粘膜的损伤情况，利用游标卡尺测定溃疡面的最大长径和最大宽径，以二者的成绩作为溃疡指数。
表3
Figure BDA0002266427640000101
Figure BDA0002266427640000111
表3的各组溃疡指数表明空白组与绿原酸钙盐组对大鼠胃粘膜没有刺激性，绿原酸对大鼠胃粘膜有明显的刺激性。
实施例7化合物针对小鼠黑色素瘤B16F10的体内药效
1.实验目的：在小鼠皮下移植瘤模型上评价绿原酸、绿原酸钙盐对小鼠黑色素瘤B16F10高转移株的体内抗肿瘤药效。
2.实验材料：阳性药：注射用环磷酰胺，山西普德药业股份有限公司生产。动物：C57BL/6小鼠，体重14-16g，SPF级，雌性，由北京华阜康动物实验有限公司提供。
3.实验方法
3.1步骤
无菌条件下将1×107个B16-F10细胞接种到C57BL/6腋下。10天后，无菌条件下获取肿瘤组织，匀浆用生理盐水稀释后计数制成浓度为1×106个/mL肿瘤细胞悬液，于小鼠右侧腋下接种0.2mL/只。接种后次日(24小时后)动物随机分组，称重后给药，待测化合物每天1次，连续腹腔给药17次。环磷酰胺腹腔给药，给药2次。第17天称量体重，处死动物，剥取肿瘤组织，称重并进行拍照。最后计算肿瘤抑制率，以肿瘤抑制率评价抗肿瘤作用强度。
3.2分组
空白对照组，阳性药对照组(环磷酰胺CTX)(100mg/kg，ip)，绿原酸(20mg/kg,ip)，绿原酸(40mg/kg,ip)，绿原酸钙盐倍半水合物(20mg/kg，ip)，绿原酸钙盐倍半水合物(40mg/kg，ip)。
3.3药物配制
(1)环磷酰胺：精确称取50mg环磷酰胺，加入10mL无菌生理盐水至5mg/mL，每只动物按体重腹腔给予0.4mL/20g。
(2)待测化合物
绿原酸：精确称取24mg，溶于3mL无菌生理盐水中，配成8mg/mL(相当于40mg/kg)。将8mg/mL溶液倍比稀释，制成4mg/mL(相当于20mg/kg)。每只动物按体重腹腔给予0.1mL/20g。
绿原酸钙盐倍半水合物：精确称取24mg(以绿原酸计)，混悬于3mL无菌生理盐水中，配成8mg/mL(相当于40mg/kg)。将2mg/mL溶液倍比稀释，制成4mg/mL(相当于20mg/kg)。每只动物按体重腹腔给予0.1mL/20g。
3.4计算方法
相对肿瘤增殖率T/C(％)：T/C％＝T/C×100％。(T：治疗组肿瘤重量；C：阴性对照组肿瘤重量)。
肿瘤增殖抑制率TGI(％)：TGI＝(1-T/C)×100。(T：治疗组肿瘤重量；C：阴性对照组肿瘤重量)。
评价标准：T/C(％)>40％为无效；T/C(％)≤40％，并经统计学处理P<0.05为有效。
4.实验结果
表4化合物对小鼠黑色素瘤B16F10的体内抗肿瘤药效
Figure BDA0002266427640000131
表4的数据表明腹腔注射绿原酸20mg/kg无效，40mg/kg有效，而绿原酸钙盐倍半水合物两个剂量均有效，但绿原酸钙盐倍半水合物的效果明显优于绿原酸。结果见图8。
实施例8比格犬口服本发明的绿原酸倍半水合物的生物利用度试验
1.实验目的：初步研究制剂B和参比制剂A在Beagle犬体内的药代特征；同时考察其在Beagle犬体内的相对生物利用度。
2.实验材料：参比制剂A的制备：取供试样品绿原酸置于10mL容量瓶中，加入适量的生理盐水，在35℃搅拌下溶解，加生理盐水定容，样品为溶液；制剂B的制备：取供试样品绿原酸钙盐倍半水合物置于棕色瓶中，用0.5％吐温-80(W/V)溶解，然后在10mL容量瓶中定容，现用现配，样品为混悬液。
3.实验方法：
表5
Figure BDA0002266427640000141
给药剂量均按照绿原酸计算
注：给药结束后中间有一周清洗期。
参比制剂A于药前(0h)、以及给药后5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h静脉取血，离心分离血浆样本。
制剂B于药前(0h)、以及给药后5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、24h静脉取血，离心分离血浆样本。
初步建立液质联用法分别测定Beagle犬血浆样本中药物浓度的方法，并对血浆样本进行测定。
4.实验结果
表6
Figure BDA0002266427640000142
Figure BDA0002266427640000151
表7
Figure BDA0002266427640000152
不同制剂给药后，药代参数比较见表6和表7，根据表6和表7的数据可以看出，Beagle犬给制剂B相对生物利用度为120％。制剂B和参比制剂A的t1/2(h)分别为2.61±0.455和1.27±0.267，Cmax(ug/L)分别为14700±4258和48300±1323，且制剂B在Beagle犬体内平均驻留时间MRT是参比制剂A的4倍左右，可以看出制剂B比参比制剂A缓释。药代数据见图9。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (14)

1.一种式(I)所示的绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式，其特征在于：其结构式如下：
Figure FDA0003838794190000011
X-射线粉末衍射图包括下列特征峰：5.570、11.172、12.539、14.034、15.869、17.973、23.278°，误差为±0.2°。
2.根据权利要求1所述的绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式，其特征在于：X-射线粉末衍射图包括下列特征峰：5.570、11.172、11.810、12.539、14.034、15.869、17.074、17.973、18.871、23.278、25.922°，误差为±0.2°。
3.根据权利要求1所述的绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式，其特征在于：X-射线粉末衍射图包括下列特征峰：5.570、5.997、7.926、10.057、11.172、11.810、12.539、14.034、15.869、16.323、17.074、17.973、18.871、21.346、23.278、25.922、26.344、28.163、30.235、31.687°，误差为±0.2°。
4.根据权利要求1所述的绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式，其特征在于：X-射线粉末衍射如图1所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式，其特征在于：利用热重分析仪器测定的图谱表明含1.5分子的结晶水。
6.权利要求1的绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式的制备方法，其特征在于：将绿原酸加入水中，然后滴加碳酸氢钠水溶液并搅拌反应，然后向体系中滴加氯化钙溶液并搅拌反应，过滤，水洗，真空干燥，得到绿原酸钙倍半水合物的结晶形式。
7.根据权利要求6的制备方法，其特征在于：绿原酸：碳酸氢钠：氯化钙的摩尔比例为0.8-1.2：0.8-1.2：0.8-1.2；滴加氯化钙的温度为0～40℃；滴加氯化钙溶液并搅拌反应的时间为15min～5h；真空干燥温度为30～70℃。
8.根据权利要求6的制备方法，其特征在于：滴加氯化钙的温度为10～30℃；滴加氯化钙溶液并搅拌反应的时间为30min～2h；真空干燥温度为45～65℃。
9.根据权利要求8的制备方法，其特征在于：滴加氯化钙的温度为20℃；滴加氯化钙溶液并搅拌反应的时间为1h；真空干燥温度为55℃。
10.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1的绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式和一种或多种可药用赋形剂。
11.根据权利要求10的药物组合物，其特征在于：其在临床上可以用于口服、非肠道给药相关制剂。
12.权利要求1的绿原酸钙盐倍半水合物的结晶形式在制备治疗和/或预防肿瘤、炎性疾病、自身免疫性疾病、抗氧化、抗衰老、抗肌肉骨骼老化或保护心血管的药物中的用途。
13.根据权利要求12的用途，其特征在于：所述自身免疫性疾病为牛皮癣、炎症样类风湿性关节炎、狼疮、I型糖尿病、糖尿病肾病、多发性硬化症、肾小球肾炎或器官移植排斥。
14.根据权利要求12的用途，其特征在于：所述肿瘤为黑色素瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫癌或脑瘤。
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