CN112772295A - 一种羊肚菌液体菌种和改良栽培种的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种羊肚菌液体菌种和改良栽培种的制备方法；通过在培养基中加入0.3％以上的羧甲基纤维素钠，有效增加培养基粘性，达到羊肚菌菌丝球浓度高、无大块菌团的效果，采用液体菌种的方式进行羊肚菌栽培，可将液体种与辅料拌匀，制得改良栽培种直接播撒，省去灭菌及装袋程序，工艺简单，成本低廉，易于工厂化生产。

Description

一种羊肚菌液体菌种和改良栽培种的制备方法
技术领域
本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种羊肚菌液体菌种和改良栽培种的制备方法。
背景技术
羊肚菌(Morchella spp.)，属子囊菌门(Ascomycota)盘菌纲(Pezizomycetes) 盘菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌属(Morchella)，又名羊肚菜、羊肚蘑等，因其菌盖表面凹凸不平，形似羊肚而得名，是一种珍贵食(药) 用菌。羊肚菌具有化痰理气，益肠胃，抗氧化、抗肿瘤及保肝保肾等功效，兼具食用价值和药用价值，市场价格高，但深受人们喜食。羊肚菌是羊肚菌属内所有种类的统称，并非单一物种，常见有黑脉羊肚菌(M.angusticeps)、粗柄羊肚菌 (M.crassipes)、美味羊肚菌(M.esculenta)、梯棱羊肚菌(M.importuna)、六妹羊肚菌等(M.sextelata)。
目前国内栽培羊肚菌主要为梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌，主要采用大田栽培、林下栽培两种模式，并使用固体种进行栽培。常规固体种在生产和栽培过程中存在成本高、劳动强度大、生产周期长、污染率高等因素，无法满足羊肚菌规模化栽培的需求。目前，金针菇、杏鲍菇等大宗型食用菌已成功进行液体菌种的工厂化生产，而羊肚菌的液体菌种生产还处于探索阶段，此前的一些技术手段，其菌丝球分散不均匀或无法形成菌丝球，而只形成菌丝团块，在制备栽培种的过程中，也仅采用的常规固体种的制备方法，其成本高、周期长。因此，改进羊肚菌菌种生产工艺，有效提升生产效率，降低生产成本，是目前亟待解决问题。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种羊肚菌液体菌种和改良栽培种及其制备方法。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种羊肚菌的栽培技术方法，具体包括液体菌种及改良栽培种的制备。
1、菌种活化：配制PDA培养基，制作平板培养基或试管斜面培养基，挑取 0.5cm2羊肚菌原种于平板或试管斜面培养基上，于黑暗条件下25℃恒温培养5-8 天，备用。
进一步，所述的平板培养基直径为9-12cm；所述的试管斜面培养基，试管规格为20mm×200mm或18mm×180mm。
2、液体菌种的制备：
(1)配制一级液体种培养基：按配方取红糖40-55g/L、酵母粉5-10g/L、羧甲基纤维素钠5-15g/L、六水氯化镁1-3g/L、磷酸二氢钾0.5-1g/L，加水溶解定容至1L，pH值自然，采用500mL三角瓶装液100-300mL，盖上硅胶塞，用牛皮纸或报纸包裹瓶口，121℃灭菌30分钟，冷却备用。
(2)配制二级液体种培养基：按配方取红糖40-55g/L、酵母粉5-10g/L、羧甲基纤维素钠5-13g/L、六水氯化镁2-3g/L、磷酸二氢钾0.5-1g/L、添加消泡剂 0.05-0.1％，pH值自然，采用30-100L气升式或机械式发酵罐，每罐装液50-70％， 121℃灭菌30分钟，冷却备用。
进一步，所述的消泡剂为本领域常用消泡剂。
(3)制备一级液体菌种：采用打孔器或直接挑取3-5片0.5cm2母种菌块接种于一级液体种培养基中，于黑暗条件下，20-26℃恒温静置培养0-2天，再转 150r/min培养10-15天，此时菌丝球数量应达到1600-3500个/mL。
(4)制备二级液体菌种：按体积比接种5-10％一级液体种于培养基中，于黑暗条件下，20-26℃恒温静置培养0-2天，再转150r/min培养10-15天，此时菌丝球数量应达到1600-3500个/mL。
进一步，在制备一级液体种时，若满足生产需求可以直接采用一级种进行后续工序，而无需制备二级液体种。
3、液体种使用方式：
按以上方式制备的液体可直接接入固体培养基中，按常规方法生产固体栽培种；或与改良培养基拌匀，直接播撒到土壤中，进行栽培；或按照所需浓度，直接将液体种播撒到土壤中进行栽培。
4、制备改良栽培种：
(1)制备改良培养基：
按以下配方配制改良培养基：麦麸70-80％、玉米芯15-25％、红糖3-5％、磷酸二氢钾0.5-1％、六水氯化镁0.5-1％、石灰1％，拌匀备用。
(2)制备改良栽培种：
按羊肚菌改良培养基质量，接入0.5-1％液体种，拌匀并调节水分至15-30％，得改良栽培种，直接将改良栽培种种播撒至土壤中即可。
进一步，所述的液体种浓度为102-103个/mL
5、羊肚菌栽培：对土壤进行前处理，采用撒播和沟播两种方式进行液体种，常规固体栽培种、改良固体栽培种的播种，随后覆土和覆膜，进一步开展后期出菇管理工作。
综上所述，本发明的有益效果在于：本发明通过在培养基中加入0.3％以上的羧甲基纤维素钠，有效增加培养基粘性，达到羊肚菌菌丝球浓度高、无大块菌团的效果，采用液体菌种的方式进行羊肚菌栽培，可将液体种与辅料拌种直接播撒，省去灭菌及装袋程序，工艺简单，成本低廉，易于工厂化生产。
其中，对羊肚菌液体种培养条件、液体种培养基配方、改良固体种配方等进行研究，在液体培养基中添加羧甲基纤维素钠、红糖、六水氯化镁等，羊肚菌液体种菌丝萌发快，菌丝生物量大；并且，液体培养基中添加羧甲基纤维素钠(3g/L 以上)作为粘稠剂，菌丝球浓度高、分散均匀、菌丝活性高，且添加食品级的羧甲基纤维素钠，来源广泛，使用安全，也优于同级别的海藻酸钠；再将液体种接种至改良培养基上，制成改良栽培种，可直接进行栽培，该工艺省去装袋及灭菌程序。本发明优化了液体种配方及固体种制备工艺，具有菌丝生长快、萌发点多、发菌时间短、污染率低，原料来源丰富，工艺简单、成本低廉等优势。
附图说明
图1为培养基中粘稠剂浓度对羊肚菌菌丝形态影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
1、菌种活化：配置PDA培养基，制作9cm平板培养基，挑取0.5cm2羊肚菌原种于平板中央，黑暗条件下，25℃恒温培养6d，备用。
2、液体培养基配制：
按液体种培养基配方，红糖45g/L、酵母粉10g/L、羧甲基纤维素钠13g/L、六水氯化镁2.8g/L、磷酸二氢钾1g/L，加水溶解定容至1L，pH值自然，采用500mL 三角瓶装液300mL，盖上硅胶塞，用牛皮纸或报纸包裹瓶口，121℃灭菌30分钟，冷却备用。
3、接种及培养
采用8mm打孔器于平板上均匀打孔，挑取3-5片母种菌块于液体培养基中，于25℃恒温黑暗条件下，先静置培养1d，然后转150r/min培养8d，经检测，菌丝球数量达3200个/mL。
实施例2
1、菌种活化：配置PDA培养基，制作9cm平板培养基，挑取0.5cm2羊肚菌原种于平板中央，黑暗条件下，25℃恒温培养6d，备用。
2、液体培养基配制
按液体种培养基配方，红糖42g/L、酵母粉10g/L、羧甲基纤维素钠11g/L、六水氯化镁2.5g/L、磷酸二氢钾1g/L，加水溶解定容至1L，pH值自然，采用500mL 三角瓶装液300mL，盖上硅胶塞，用牛皮纸或报纸包裹瓶口，121℃灭菌30分钟，冷却备用。
3、液体种接种
采用8mm直接打孔器于平板上均匀打孔，挑取3-5片母种菌块于液体培养基中，于25℃恒温黑暗条件下，先静置培养1d，然后转150r/min培养8d，经检测，菌丝球数量达2300个/mL。
实施例3
1、菌种活化：配置PDA培养基，制作9cm平板培养基，挑取0.5cm2羊肚菌原种于平板中央，黑暗条件下，25℃恒温培养6d，备用。
2、液体培养基配制
按液体种培养基配方，红糖45g/L、酵母粉10g/L、羧甲基纤维素钠13g/L、六水氯化镁2.3g/L、磷酸二氢钾1g/L，加水溶解定容至1L，pH值自然，采用500mL 三角瓶装液300mL，盖上硅胶塞，用牛皮纸或报纸包裹瓶口，121℃灭菌30分钟，冷却备用。
3、液体种接种
采用8mm打孔器于平板上均匀打孔，挑取3-5片母种菌块于液体培养基中，于25℃恒温黑暗条件下，先静置培养1d，然后转150r/min培养8d，经检测，菌丝球数量达2800个/mL。
对实施例1-3的菌丝状态进行统计，如表1所示。
表1
Figure RE-GDA0002990622880000051
现有技术已公开，在制备液体种时，需要菌丝球浓度达到800-1500个/mL 以上才适应于生产。由表1可知，实施例1-3的培养基配方所得的菌丝球浓度均在2000个/mL以上，菌球数量多且均匀，符合生产需求。
实施例4
1、菌种活化：配置PDA培养基，制作斜面培养基(试管20mm×200mm)，挑取0.5cm2羊肚菌原种于PDA斜面培养基上，黑暗条件下，25℃恒温培养6d，备用。
2、液体培养基配制
按液体种培养基配方，红糖42g/L、酵母粉10g/L、羧甲基纤维素钠11g/L、六水氯化镁2.5g/L、磷酸二氢钾1g/L，加水溶解定容至1L，pH值自然，采用500mL 三角瓶装液300mL，盖上硅胶塞，用牛皮纸或报纸包裹瓶口，121℃灭菌30分钟，冷却备用。
3、液体种接种
从试管中挑取3-5片(0.5cm2)母种菌块于液体培养基中，于25℃恒温黑暗条件下，先静置培养1d，然后转150r/min培养8d，菌丝球数量达2450个/mL。
4、固体栽培种制备
配制常规羊肚菌固体培养基，灭菌冷却备用。将制备好的2450个/mL浓度液体种稀释为103个/mL，采用袋口接种，无菌环境下，每袋(1000g)接入0.5％的液体种，黑暗条件下，25℃恒温培养18天，菌丝即可长满菌袋。
实施例5
1、菌种活化：配置PDA培养基，制作斜面培养基(试管20mm×200mm)，挑取0.5cm2羊肚菌原种于平板中央，黑暗条件下，25℃恒温培养6d，备用；
2、液体培养基配制
按液体种培养基配方，红糖42g/L、酵母粉10g/L、羧甲基纤维素钠11g/L、六水氯化镁2.5g/L、磷酸二氢钾1g/L，加水溶解定容至1L，pH值自然，采用500mL 三角瓶装液300mL，盖上硅胶塞，用牛皮纸或报纸包裹瓶口，121℃灭菌30分钟，冷却备用。
3、液体种接种
从试管中挑取3-5片(0.5cm2)母种菌块于液体培养基中，于25℃恒温黑暗条件下，先静置培养1d，然后转150r/min培养8d，菌丝球数量达2380个/mL。
4、固体栽培种制备
配制常规羊肚菌固体培养基，灭菌冷却备用。将制备好的2450个/mL浓度液体种稀释为103个/mL，采用打孔接种，无菌环境下，每袋(1000g)接入0.5％的液体种，黑暗条件下，25℃恒温培养10天，菌丝即可长满菌袋。
实施例6
1、菌种活化：配置PDA培养基，制作9cm平板培养基，挑取0.5cm2羊肚菌原种于平板中央，黑暗条件下，25℃恒温培养6d，备用；
2、液体培养基配制
按液体种培养基配方，红糖42g/L、酵母粉10g/L、羧甲基纤维素钠11g/L、六水氯化镁2.5g/L、磷酸二氢钾1g/L，加水溶解定容至1L，pH值自然，采用500mL 三角瓶装液300mL，盖上硅胶塞，用牛皮纸或报纸包裹瓶口，121℃灭菌30分钟，冷却备用。
3、液体种接种
采用8mm打孔器于平板上均匀打孔，挑取3-5片母种菌块于液体培养基中，于25℃恒温黑暗条件下，先静置培养1d，然后转150r/min培养8d，菌丝球数量达2500个/mL。
4、改良栽培种制备
按改良栽培种配方，麦麸79％、玉米芯15％、红糖3％、磷酸二氢钾1％、六水氯化镁1％、石灰1％，添不同组分并拌匀，将制备好的2500个/mL浓度液体种稀释为103个/mL，添加0.5％的稀释液体种于培养基中，拌匀并调节水分至 20％，pH值自然，即得。
5、羊肚菌栽培：对土壤进行前处理，采用沟播方式进行栽培，分别覆土和覆膜，地温适宜(10-18℃)，菌丝3-5天萌发，7-10天出土。
实施例7
1、菌种活化：配置PDA培养基，制作9cm平板培养基，挑取0.5cm2羊肚菌原种菌块于平板中央，黑暗条件下，25℃恒温培养6d，备用；
2、液体培养基配制
按液体种培养基配方，红糖42g/L、酵母粉10g/L、羧甲基纤维素钠11g/L、六水氯化镁2.5g/L、磷酸二氢钾1g/L，加水溶解定容至1L，pH值自然，采用500mL 三角瓶装液300mL，盖上硅胶塞，用牛皮纸或报纸包裹瓶口，121℃灭菌30分钟，冷却备用。
3、液体种接种
采用8mm打孔器于平板上均匀打孔，挑取3-5片母种于液体培养基中，于 25℃恒温黑暗条件下，先静置培养1d，然后转150r/min培养8d，菌丝球数量达 2500个/mL。
4、改良栽培种制备
按改良栽培种配方，麦麸72％、玉米芯20％、红糖5％、磷酸二氢钾1％、六水氯化镁1％、石灰1％，添不同组分并拌匀。将制备好的2500个/mL浓度液体种稀释为102个/mL，添加1％的液体种于辅料培养基中，拌匀并调节水分至 15％，pH值自然，即得。
5、羊肚菌栽培：对土壤进行前处理，采沟播方式进行栽培，分别覆土和覆膜，地温适宜(10-18℃)，羊肚菌菌丝2-3天萌发，5-8天出土。
一、粘稠剂浓度对羊肚菌菌丝形态的影响
采用实施例1的液体种配方分为A、B两组进行实验，其中，A组中的粘稠剂为海藻酸钠，B组的粘稠剂为羧甲基纤维素钠，A组、B组分别设置6个浓度的粘稠剂进行羊肚菌培养实验，浓度梯度依次为：0g/L(对照组)、1g/L、3g/L、 5g/L、7g/L、9g/L，培养情况如附图1所示。
在培养过程中发现，由于同浓度的粘稠剂B组(羧甲基纤维素钠组)的菌丝球浓度优于A组，因此在A组(海藻酸钠组)中仅进行到9g/L的对比实验，对B组的高浓度(11g/L、13g/L、15g/L)进行比较实验，培养情况如附图1 所示。

Claims (8)

1.一种羊肚菌液体菌种，其特征在于，所述的液体菌种包括一级液体种培养基和二级液体培养基，培养基中均含有0.3％以上的羧甲基纤维素钠。
2.如权利要求1所述的一种羊肚菌液体菌种，其特征在于，所述的一级液体种培养基，其组成为：红糖40-55g/L、酵母粉5-10g/L、羧甲基纤维素钠5-13g/L、六水氯化镁1-3g/L、磷酸二氢钾0.5-1g/L，溶剂为水。
3.如权利要求1所述的一种羊肚菌液体菌种，其特征在于，所述的二级液体培养基，其组成为：红糖40-55g/L、酵母粉5-10g/L、羧甲基纤维素钠5-13g/L、六水氯化镁1-3g/L、磷酸二氢钾0.5-1g/L、消泡剂0.05-0.1％，溶剂为水。
4.一种羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将3-5片0.5cm2母种菌块接种于一级液体种培养基中，于20-26℃恒温黑暗的条件下静置培养0-2d，然后转150r/min培养7-10d，菌丝球数量达1600-3500个/mL；
(2)将一级液体培养基按体积比5-10％的比例接种至二级液体培养基中，于20-26℃恒温黑暗条件下，先静置培养0-2d，然后转150r/min培养10-15d，菌丝球数量达1600-3500个/mL。
5.一种羊肚菌液体菌种的应用方法，其特征在于，所述的液体菌种可直接接入固体培养基中；也可按所需浓度直接播撒到土壤中栽培。
6.一种羊肚菌改良栽培种的制备方法，其特征在于，是在改良培养基上接种0.5-0.1％的羊肚菌液体菌种，调节水分含量在15-30％范围内，并将接种后的培养基直接播种至土壤中。
7.如权利要求6所述的一种羊肚菌改良栽培种的制备方法，其特征在于，所述的改良培养基，其组成按百分比计为：麦麸70-80％、玉米芯15-25％、红糖3-5％、磷酸二氢钾0.5-1％、六水氯化镁0.5-1％、石灰1％。
8.如权利要求6所述的一种羊肚菌改良栽培种，其特征在于，所述的羊肚菌液体菌种，其浓度为102-103个/mL。
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