CN112770718A - 牙科护理的组合物和方法 - Google Patents

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CN112770718A CN201980063121.1A CN201980063121A CN112770718A CN 112770718 A CN112770718 A CN 112770718A CN 201980063121 A CN201980063121 A CN 201980063121A CN 112770718 A CN112770718 A CN 112770718A
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穆罕默德·萨尔维
德尼兹·塔尼尔·尤塞索伊
汉森·郭·方
萨米·道根
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Abstract

本文公开了用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构以及修复由于脱矿导致的牙齿矿物质含量损失的组合物及方法，其中所述组合物包括第一制剂和一种或多种其他制剂，所述第一制剂包含可有效治疗牙科疾病和/或美白牙齿的多肽，所述其他制剂包含至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源，其中所述第一制剂被配置成比Ca2+从所述至少一种钙离子源中释放以及PO4 3‑从所述至少一种磷酸盐离子源中释放更快地释放多肽。

Description

牙科护理的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2018年8月30日提交的美国临时申请专利号62/725,160和2018年11月9日提交的美国临时申请专利号62/758,230的优先权，每个申请的全部内容通过引用的方式包含于此。
背景技术
脱矿(牙齿表面矿物质含量的损失)是大多数牙科疾病的主要原因。酸性饮食、口干、牙齿美白、牙齿磨损和由产酸细菌引起的龋齿都可能导致矿物质的损失。如果不进行治疗，脱矿可能会导致各种问题，从牙齿过敏到极端情况下的疼痛，再到全身感染(如心脏病)。脱矿是牙齿脱落最常见的原因之一。牙齿过敏(DH)是一种常见的口腔健康问题，影响着世界上大多数成年人。仅在美国，用于治疗过敏症的、用于牙膏的、用于临床贴剂和凝胶以及漱口水的费用总计约为100亿美元。尽管有大量的非处方药和临床产品，但治疗方法仍然有限，过敏反应仍然是牙齿不适和患者健康的主要原因。目前的牙齿美白方法是使用高活性的过氧化物基化学物质，通过溶解牙齿表面的着色矿物层来去除变色。这种化学蚀刻过程是以牺牲牙釉质为代价的，牙釉质是牙冠完全矿化的外层。因此，隐藏的牙本质由于化学脱矿而暴露出来，造成了过敏和对蛀牙的敏感性增加等问题，远远超过任何美容益处。美国牙科协会报告称，过氧化物脱矿导致的牙釉质侵蚀会导致不利影响，包括：过敏(发生在64％的患者中)、牙龈萎缩、牙髓炎症和经常使用美白产品导致的蛀牙。
发明内容
一方面，本发明提供了一种组合物或试剂盒，包括
(a)第一制剂，所述第一制剂包含有效剂量的用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的多肽，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)一种或多种其他制剂，所述其他制剂包含至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源；
其中所述第一制剂被配置成比Ca2+从所述至少一种钙离子源中释放以及PO4 3-从所述至少一种磷酸盐离子源中释放更快地释放多肽。
在一个实施方式中，与一种或多种其他制剂相比，所述第一制剂具有更低的粘度。在另一个实施方式中，与一种或多种其他制剂相比，所述第一制剂被调节以改变水溶性。在另一个实施方式中，钙离子源选自醋酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、氯化钙、葡萄糖酸钙、甘油磷酸钙、乳酸钙和磷酸钙。在另一个实施方式中，磷酸盐离子源选自磷酸铝、磷酸钙、磷酸钾和磷酸钠。在一个实施方式中，至少一种钙离子源与至少一种磷酸盐离子源的摩尔比约为5:3。在另一个实施方式中，多肽与所述至少一种钙离子源和至少一种磷酸盐离子源的组合的摩尔比为约1:2至约1:100。
在一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第一制剂和所述第二制剂以锭剂或胶剂的形式存在。在另一个实施方式中，所述锭剂或胶剂包含：
(i)包含第二制剂的核心区；和
(ii)包含第一制剂的壳区。
在另一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第二制剂是水性制剂，并且其中所述第一制剂是水性制剂。在另一个实施方式中，本发明公开了一种组合物或试剂盒，包含至少第一制剂，所述至少第一制剂包含：
(a)用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的有效剂量的多肽，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源，其中至少一种钙离子源和至少一种磷酸盐离子源被包封；
其中所述第一制剂被配置成以比Ca2+和PO4 3-更快的速率释放多肽。在一个实施方式中，所述至少第一制剂包含第一制剂和第二制剂，其中
(i)所述第一制剂包含多肽和至少一种钙离子源或至少一种磷酸盐离子源中的一种；和
(ii)所述第二制剂包含多肽和至少一种钙离子源或至少一种磷酸盐离子源中的一种；
其中如果第一制剂包含至少一种钙离子源，则第二制剂包含至少一种磷酸盐离子源；如果第一制剂包含至少一种磷酸盐离子源，则第二制剂包含至少一种钙离子源。在另一个实施方式中，所述至少一种钙离子源和所述至少一种磷酸盐离子源被包封在磷脂囊泡中。
在一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第一制剂作为第一胶黏剂层存在，并且所述第二制剂作为第二胶黏剂层存在，其中所述第二胶黏剂层直接或间接的粘附到所述第一胶黏剂层。在另一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包含第二制剂和第三制剂，其中所述第二制剂包含所述一种或多种钙离子源，并且所述第三制剂包含所述一种或多种磷酸盐离子源，其中所述第一制剂作为第一胶黏剂层存在，所述第二制剂作为第二胶黏剂层存在，并且第三制剂作为第三胶黏剂层存在，其中第二胶黏剂层和第三胶黏剂层直接或间接的粘附到第一胶黏剂层。在另一个实施方式中，当第一胶黏剂层、第二胶黏剂层和第三胶黏剂层存在时，其厚度各自独立的为50μm至500μm。
在一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包括第二制剂和第三制剂，其中所述第一、第二和第三制剂是第一、第二和第三糊剂，并且各自被分离糊剂分开，其中：
第一糊剂包含缓冲液中10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％，或约47.5％至约52.5％w/v的多肽；
第二糊剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种钙离子源，包括但不限于CaCl2；和
第三糊剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种磷酸盐离子源，包括但不限于K2HPO4；并且其中第一糊剂的粘度小于第二糊剂和第三糊剂的粘度。在一个实施方式中，所述第一糊剂、第二糊剂和第三糊剂包含增稠剂，所述增稠剂包括但不限于聚丙二醇(PPG)、甘油和/或羧甲基纤维素钠。在另一个实施方式中，所述第一糊剂、第二糊剂和第三糊剂包含丙二醇(PPG)、甘油和羧甲基纤维素钠(SCS)，其中第一糊剂包含比第二糊剂和第三糊剂更高浓度的PPG，并且其中第一糊剂包含比第二糊剂或第三糊剂更低浓度的SCS。
在多个实施方式中，所述多肽包含选自下述的氨基酸序列或由下述的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)，或其功能等同物；
(PGYINFSYENSHSQAINVDRTA)1-10(SEQ ID NO:6)(ADP5H)，或其功能等同物；和
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)，或其功能等同物；
或者它们的组合；和
(HTLQPHHH(L/I)PVV)1-10(ADP1；SEQ ID NO:1)；
(VPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP2；SEQ ID NO:4)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVV)1-10(ADP4；SEQ ID NO:10)；
(PAQQPV(A/I)PQQPMMP)1-10(ADP8；SEQ ID NO:21)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；
HTLQPHHHLPVV)1-10(ADP1M；SEQ ID NO:2)；
(HTLQPHHHIPVV)1-10(ADP1H；SEQ ID NO:3)；
(VPGHHSMTPTQH)1-10(ADP2M；SEQ ID NO:5)；
(VPGQHSMTPIQH)1-10(ADP2H；SEQ ID NO:14)；
(HPPSHTLQPHHHLPVV)1-10(ADP4M；SEQ ID NO:11)；
(HPPTHTLQPHHHIPVV)1-10(ADP4H；SEQ ID NO:12)；
(HPPSHTLQPHHHLPVVPAQQPVAPQQPMMPVPGHHSMTPTQH)1-10(ADP7M；SEQ ID NO:19)；
(HPPTHTLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQH)1-10(ADP7H；SEQ ID NO:20)；
(PAQQPVAPQQPMMP)1-10(ADP8M；SEQ ID NO:22)；和
(PAQQPVIPQQPMMP)1-10(ADP8H；SEQ ID NO:23)；
(WPATDKTKREEVD)1-10(ADP3M；SEQ ID NO:8)；
(WPSTDKTKREEVD)1-10(ADP3H；SEQ ID NO:9),
MLPHHGA(HABP1；SEQ ID NO:25)；和
NPGFAQA(HABP2；SEQ ID NO:26)；
或其功能等同物及其组合。
另一方面，本发明公开了一种用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保持牙齿结构和/或修复由于脱矿质作用导致的牙齿矿物质损失的方法，包括对有需要的受试者口服给药：
(a)包含有效量的多肽的第一制剂，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成，所述有效量的多肽用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的矿物质含量：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQ
QPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)一种或多种其他制剂，所述其他制剂包含至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源；
其中所述第一制剂被施用给所述受试者，使得在从所述至少一种钙离子源释放Ca2+和从所述至少一种磷酸盐离子源释放PO4 3-之前，所述多肽可接触到所述受试者的一颗或多颗牙齿。
在一个实施方式中，与一种或多种其他制剂相比，所述第一制剂具有更低的粘度。在另一个实施方式中，与一种或多种其他制剂相比，所述第一制剂被调节以改变水溶性。在另一个实施方式中，所述钙离子源选自醋酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、氯化钙、葡萄糖酸钙、甘油磷酸钙、乳酸钙和磷酸钙。在另一个实施方式中，所述磷酸盐离子源选自磷酸铝、磷酸钙、磷酸钾和磷酸钠。在一个实施方式中，至少一种钙离子源与至少一种磷酸盐离子源的摩尔比约为5:3。在另一个实施方式中，所述多肽与至少一种钙离子源和至少一种磷酸盐离子源的组合的摩尔比约为1:2至约1:100。
在一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第一制剂和所述第二制剂以锭剂或胶剂的形式存在，其中所述多肽从所述第一制剂中释放的速度快于Ca2+和PO4 3-从所述第二制剂中释放的速度。在另一个实施方式中，所述锭剂或胶剂包括:
(i)包含第二制剂的核心区；和
(ii)包含第一制剂的壳区。
在另一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包括第二制剂，其中所述第二制剂是水性制剂，其中所述第一制剂是水性制剂。在另一个实施方式中，本发明公开了一种组合物或试剂盒，其包含至少第一制剂，所述至少第一制剂包含：
(a)治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的有效量的多肽，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源，其中所述至少一种钙离子源和至少一种磷酸盐离子源被包封；
其中多肽以比Ca2+和PO4 3-更快的速率释放。在一个实施方式中，所述至少第一制剂包含第一制剂和第二制剂，其中：
(i)第一制剂包含多肽和至少一种钙离子源或至少一种磷酸盐离子源中的一种；和
(ii)第一制剂包含多肽和至少一种钙离子源或至少一种磷酸盐离子源中的一种；
其中如果第一制剂包含至少一种钙离子源，则第二制剂包含至少一种磷酸根离子源，如果第一制剂包含至少一种磷酸根离子源，则第二制剂包含至少一种钙离子源。在另一个实施方式中，所述至少一种钙离子源和所述至少一种磷酸盐离子源被包封在磷脂囊泡中。
在一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包括第二制剂，其中所述第一制剂以第一胶黏剂层的形式存在，并且所述第二制剂以第二胶黏剂层的形式存在，所述第二胶黏剂层直接或间接粘附到所述第一胶黏剂层上。在另一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包含第二制剂和第三制剂，其中所述第二制剂包含所述一种或多种钙离子源，并且所述第三制剂包含所述一种或多种磷酸盐离子源，其中所述第一制剂作为第一胶黏剂层存在，所述第二制剂作为第二胶黏剂层存在，并且第三制剂以第三胶黏剂层的形式存在，第二胶黏剂层和第三胶黏剂层直接或间接粘附到第一胶黏剂层上。在另一个实施方式中，当所述第一胶黏剂层、所述第二胶黏剂层和所述第三胶黏剂层存在时，其厚度各自独立地在50μm和500μm之间。
在一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包括第二制剂和第三制剂，其中所述第一、第二和第三制剂是第一、第二和第三糊剂，并且其各自被分离糊剂分开，其中：
第一糊剂包含缓冲液中10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的多肽；
第二糊剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种钙离子源，包括但不限于CaCl2；和
第三糊剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种磷酸盐离子源，包括但不限于K2HPO4；并且其中第一糊剂的粘度小于第二糊剂和第三糊剂的粘度。在一个实施方式中，所述第一糊剂、第二糊剂和第三糊剂包含增稠剂，所述增稠剂包括但不限于聚丙二醇(PPG)、甘油和/或羧甲基纤维素钠。在另一个实施方式中，所述第一糊剂、所述第二糊剂和所述第三糊剂包含丙二醇(PPG)、甘油和羧甲基纤维素钠(SCS)，其中所述第一糊剂包含比所述第二糊剂和所述第三糊剂更高浓度的PPG，并且其中所述第一糊剂包含比所述第二糊剂或所述第三糊剂更低浓度的SCS。
在多个实施方式中，所述多肽包含选自下述的氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成:
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)，或其功能等同物；
(PGYINFSYENSHSQAINVDRTA)1-10(SEQ ID NO:6)(ADP5H)，或其功能等同物；和
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)，或其功能等同物；
(HTLQPHHH(L/I)PVV)1-10(ADP1；SEQ ID NO:1)；
(VPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP2；SEQ ID NO:4)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVV)1-10(ADP4；SEQ ID NO:10)；
(PAQQPV(A/I)PQQPMMP)1-10(ADP8；SEQ ID NO:21)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；
HTLQPHHHLPVV)1-10(ADP1M；SEQ ID NO:2)；
(HTLQPHHHIPVV)1-10(ADP1H；SEQ ID NO:3)；
(VPGHHSMTPTQH)1-10(ADP2M；SEQ ID NO:5)；
(VPGQHSMTPIQH)1-10(ADP2H；SEQ ID NO:14)；
(HPPSHTLQPHHHLPVV)1-10(ADP4M；SEQ ID NO:11)；
(HPPTHTLQPHHHIPVV)1-10(ADP4H；SEQ ID NO:12)；
(HPPSHTLQPHHHLPVVPAQQPVAPQQPMMPVPGHHSMTPTQH)1-10(ADP7M；SEQ ID NO:19)；
(HPPTHTLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQH)1-10(ADP7H；SEQ ID NO:20)；
(PAQQPVAPQQPMMP)1-10(ADP8M；SEQ ID NO:22)；和
(PAQQPVIPQQPMMP)1-10(ADP8H；SEQ ID NO:23)；
(WPATDKTKREEVD)1-10(ADP3M；SEQ ID NO:8)；
(WPSTDKTKREEVD)1-10(ADP3H；SEQ ID NO:9),
MLPHHGA(HABP1；SEQ ID NO:25)；和
NPGFAQA(HABP2；SEQ ID NO:26)；
或其功能等同物及其组合。
在另一个实施方式中，所述受试者患有选自牙周炎、牙齿酸蚀、过敏症、菌斑、氟斑牙、蛀牙、龋齿、牙内吸收、颅颌面部骨病、牙龈萎缩和/或一颗或多颗牙齿的釉质脱矿的牙科疾病。
附图说明
图1：(A)过氧化氢基美白产品与(B)美白锭剂的作用机理示意图。(C)天然牙齿、(D)过氧化氢和(E)锭剂处理的表面的代表性扫描电子显微镜图像。正常情况下，牙齿表面有些粗糙，但由于咀嚼动作，通常是光滑的(C)。由于过氧化氢基凝胶和条带的化学蚀刻作用去除了牙齿表面大量的矿物质，使得牙齿表面非常粗糙(D)。由于肽导向再矿化作用的附加机制，当使用锭剂时，牙齿表面覆盖着新的矿物质(E)。
图2：核壳设计的锭剂的示意图。
图3：对人牙釉质进行一轮锭剂处理后拍摄的代表性的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图4：再矿化增白处理(a)之前和(b)之后离体人牙固有染色的光学图像。圆圈区域显示了进行了颜色定量分析的区域。
图5：对美白过程的作用模式进行结构评估，并与商业产品进行正面对比。受到图(a)无处理和7轮图(b)增白条处理、图(c)增白凝胶处理和图(d)增白锭剂处理后牙齿样本的SEM图像。(e&f)7轮处理(1周)后美白的量化*沿图(e)中白线量化的白度，以及白度曲线如图(f)所示。结果表明，美白锭剂与临床使用的美白凝胶(40％HP)具有同等的效果，以及具有比OTC美白条3倍以上的效果。
图6：暴露的牙本质小管的制备示意图。
图7：显示抛光的牙本质表面和圆形小管的光学显微镜图像。
图8：肽导向再矿化处理的示意图。
图9：3轮再矿化样品的热循环过程示意图。
图10：pH循环过程示意图。
图11：显示牙本质表面和牙本质小管内的再矿化层的扫描电镜图像。
图12：显示热循环前后的矿物形态的扫描电镜图像。
图13：在人牙釉质上进行一轮漱口水处理后拍摄的代表性扫描电镜图像。箭头指的是新形成的矿物层。
图14：肽凝胶制剂相对于商业牙科产品和甘油/水的水性溶液的粘度。
图15：使用含肽(a&b)和不含肽(c&d)的凝胶制剂对离体人牙齿釉质上的人工损伤进行矿化。
图16：牙膏配方相对于普通市售牙膏的粘度。
图17：第5组的正面(a，b)和侧面(d)扫描电镜图像和EDXS分析(c)：shADP5+1100ppm F+Ca2+/PO4 3-。插图4b显示了表面上累积的100nm球形nm粒子的松散结晶区域。第6组的正面(e，f)和侧面(h)扫描电镜图像和EDXS分析(c)：shADP5+Ca2+/PO4 3-。插图4f显示在shADP5+Ca2+/PO4 3-处理中新形成的(h)矿物层中高度均匀的板状HAp微晶。插图面板为1μm×1μm。(d)和(h)中的宽箭头表示新层和原始牙齿表面之间的边界。
图18：目视观察含肽的与不含肽的阳离子和阴离子凝胶的扩散和反应。中间的宽带表示矿化反应的程度。
图19：含肽和不含肽凝胶的扩散系数。
图20：示例性牙齿再矿化和美白条的示意图，所述美白条包含应用于牙齿表面的三重凝胶。
图21：本公开的示例性三糊剂牙膏的示意图。
图22：本公开的示例性漱口水的示意图。
具体实施方式
所有引用的参考文献在此全部引入作为参考。在本申请中，除非另有说明，所使用的技术可以在几个公知的参考文献中找到，例如：《分子克隆实验指南》(Sambrook等人，1989年，冷泉港实验室期刊)、《基因表达技术》(酶学方法，1991年，第185卷，D.Goeddel编辑，学术出版社，圣地亚哥，CA)、《酶学方法中的蛋白质纯化指南》(M.P.Deutshcer,ed.，(1990)学术出版社有限公司)、《聚合酶链式反应协议：方法和应用指南》(Innis等，1990，学术出版社，圣地亚哥，CA)、《动物细胞培养：基本技术手册》第二版(R.I.Freshney，1987，Liss公司，纽约，NY)、《基因转移和表达协议》(第109-128页，E.J.Murray编辑，人类出版社，Clifton,N.J.)和Ambion 1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。
如本文所用，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个/a”、“一个/an”和“所述”包括复数指代物。除非另有明确说明，否则本文所用的“和”可与“或”互换使用。
如本文所用，“大约”是指所述参数的+/-5％范围。
除非上下文清楚地另有规定，本发明任何方面的所有实施例都可以组合使用。
这里所示的细节是作为示例的，并且仅仅是为了说明性地讨论本发明的优选实施方式，并且是为了提供被认为是对本发明的各种实施方式的原理和概念方面最有用和最容易理解的描述而呈现的。在这点上，除了对本发明所必需的基本理解之外，没有试图更详细地示出本发明的结构细节，结合附图和/或示例的描述可以使得本领域技术人员清楚本发明的几种形式如何在实践中实施。
如本文所用，除非另有说明，术语“一个/a”和“一个/an”是指“一个”、“至少一个”或“一个或多个”。除非上下文另有要求，否则本文使用的单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”等应理解为包含性的，而不是排他性的或穷尽性的；即，“包括但不限于”的意思。使用单数或复数的单词也分别包括复数和单数。此外，当在本申请中使用时，词语“在此”、“以上”、“以下”和类似含义的词语应指本申请的整体，而不是指本申请的任何特定部分。
本公开的实施方式的描述并不旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明目的描述了本公开的具体实施方式和示例，但是相关领域的技术人员将会认识到，在本公开的范围内，可以进行各种等效修改。
本文引用的所有参考文献都通过引用并入本文。如果需要，可以修改本公开的各方面，以采用上述参考文献和申请的系统、功能和概念来提供本公开的更多实施方式。
根据详细描述，可以对本公开进行这些和其他改变。任何前述实施方式的特定元件可以组合或替代其他实施方式中的元件。此外，在这些实施方式中的至少一些实施方式中包含特定元素可以是可选的，其中进一步的实施方式可以包括具体排除一个或多个这些特定元素的一个或多个实施方式。此外，虽然已经在这些实施方式的上下文中描述了与本公开的某些实施方式相关联的优点，但是其他实施方式也可以具有这样的优点，并且并非所有实施方式都需要具有这样的优点来落入本公开的范围内。
一方面，本发明提供了一种组合物或试剂盒，包括
(a)第一制剂，所述第一制剂包含有效剂量的用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的多肽，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)一种或多种其他制剂，所述其他制剂包含至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源；
其中所述第一制剂被配置成比Ca2+从所述至少一种钙离子源中释放以及PO4 3-从所述至少一种磷酸盐离子源中释放更快地释放多肽。
如本文所公开的，发明人惊奇地发现，如果将矿化肽和钙/磷酸盐离子一起给药于受试者，矿化在唾液中开始，以使得矿化开始远离牙齿表面，严重限制了牙齿组织上的矿化功效。通过将所有矿化集中在牙齿表面，本发明的组合物和方法提供了对现有方法的显著改进。多肽首先被释放并粘附到受试者的一颗或多颗牙齿上，随后释放的离子迁移到牙齿上以开始矿化过程。
第一制剂被配置成比Ca2+从所述至少一种钙离子源中释放以及PO4 3-从所述至少一种磷酸盐离子源中释放更快地释放多肽。这种释放曲线可以通过任何合适的方式建立。在一个实施方式中，与一种或多种其他制剂相比，所述第一制剂具有更低的粘度。在另一个实施方式中，与一种或多种其他制剂相比，调节第一制剂以改变其水溶性。
第一制剂和一种或多种其他制剂可以是任何合适的类型，包括但不限于牙膏(toothpastes)、牙粉、漱口水、牙线、液体洁齿剂、牙片、局部凝胶、片剂、咀嚼胶、牙膏(dental pastes)、牙龈按摩膏、漱口片、锭剂和食品。在本文中更详细地描述了非限制性的具体实施方式。
可以使用能够充当钙离子前驱体的任何合适的钙离子源。在各种非限制性实施方式中，钙离子源选自醋酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、氯化钙、葡萄糖酸钙、甘油磷酸钙、乳酸钙和磷酸钙。钙离子源可以以适合预期用途的任何浓度存在于一种或多种其他制剂中。在各种非限制性实施方式中，一种或多种其他制剂包含至少一种钙离子源，其浓度范围为约1mM至约10M、1mM至约5M、1mM至约2M、约1mM至约1M、约1mM至约0.5M、约1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约1mM至约10mM、约2mM至约8mM、约3mM至约7mM、约4mM至约6mM、或约4.5mM至约5.5mM。
可以使用能够充当磷酸根离子前驱体的任何合适的磷酸根离子源。在各种非限制性实施方式中，磷酸盐离子源选自磷酸铝、磷酸钙、磷酸钾和磷酸钠。磷酸盐离子源可以以适合预期用途的任何浓度存在于一种或多种其他制剂中。在各种非限制性实施方式中，一种或多种其他制剂包含至少一种钙离子源，其浓度范围为约1mM至约10M、1mM至约5M、1mM至约2M、约1mM至约1M、约1mM至约0.5M、约1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约1mM至约10mM、约1mM至约7mM、或约1mM至约6mM、约1.5mM至约5mM、约2mM至约4mM、或约2.5mM至约3.5mM。
在一个实施方式中，在一种或多种其他制剂中，至少一种钙离子源与至少一种磷酸盐离子源的摩尔比约为5:3。在另一个实施方式中，第一制剂中的多肽与一种或多种其他制剂中的至少一种钙离子源和至少一种磷酸根离子源的组合的摩尔比为约1:2至约1:100、约1:2至约1:50、约1:2至约1:25、约1:2至约1:10、约1:10至约1:100、约1:10至约1:50、或约1:2、约1:10或约1:100。
在一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第一制剂和所述第二制剂以锭剂的形式存在。所述锭剂可以采用任意合适的形式。在一个实施方式中，所述锭剂包含：
(i)包含第二制剂的核心区；和
(ii)包含第一制剂的壳区。
当对受试者口服给药时，壳区溶解在唾液中，多肽被释放并沉积在牙齿上。壳区溶解后，核区提供钙和磷酸盐离子，在牙齿表面开始生物矿化。锭剂可以是适于对受试者口服给药的任何尺寸或形状，包括但不限于圆柱形、正方形、矩形等。在一个实施方式中，锭剂可以包括直径在约6mm-15mm和约2mm-4mm的圆柱形片剂。
在一个实施方式中，所述第二制剂包含：
(A)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-65％、45％-60％、50％-60％、52％-58％、53％-57％、54％-56％、或约54％-55％w/w的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；和
(B)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、15％-50％、20％-40％、25％-35％、27％-33％、28％-32％、29％-31％、或约29.5％-30.5％w/w的钾离子源，包括但不限于KH2PO4。
在另一个实施方式中，所述第二制剂进一步包含一种或多种润滑剂、调味剂和/或赋形剂。在又一个实施方式中，所述第二制剂包含：
0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-65％、45％-60％、50％-60％、52％-58％、53％-57％、54％-56％、或约54％-55％w/w的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；和
0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、15％-50％、20％-40％、25％-35％、27％-33％、28％-32％、29％-31％、或约29.5％-30.5％w/w的钾离子源，包括但不限于KH2PO4；和
1％-10％w/w的润滑剂。
在另一个实施方式中，所述第一制剂包含0.1％-10％、0.5％-7.5％、1％-6％、1.5％-5％、2％-4％、或约2.5％-约3.5％w/w的多肽。在另一个实施方式中，所述第一制剂进一步包含一种或多种润滑剂、调味剂和/或填料。在一个实施方式中，所述第一制剂包含：
0.1％-10％、0.5％-7.5％、1％-6％、1.5％-5％、2％-4％、或约2.5％-约3.5％w/w的多肽；
1％-10％w/w的润滑剂；和
50％-90％w/w的填料。
在一个实施方式中，所述锭剂可以包含表1A中所列举的成分。
表1A：美白锭剂中包含的示例性成分
Figure BDA0002992179550000141
锭剂可以使用任何合适的技术制备，包括但不限于本文所述的技术。在一个非限制性实施方式中，所述锭剂可以通过使用液压机在一定压力下在金属模具内压缩混合的成分来制备。在下面的示例中提供了进一步的非限制性锭剂实施例。
类似于锭剂，可以制备含有两种成分的层状胶剂：一种包含肽，另一种包含两种离子。所述两层结构可能具有相同的结构和物理特性。两层的厚度可以相同。所述两种组分的粘度以及化学和机械稳定性也可能相同，这意味着其非活性组分是相似的。在咀嚼作用下，两种活性成分混合，从而各自溶解在唾液中。在牙齿表面固定后，所述肽吸收离子并引发再矿化作用。每种胶剂都有一定的寿命，在此期间，离子和肽会不断从胶剂中释放出来(但速度会逐渐降低)，溶解在唾液中，并在牙齿表面重新矿化。
胶剂具有类似于锭剂的核-壳结构，壳是肽，其可以包括硬壳，类似于覆盖锭剂的实施方式中所述的硬壳，以及包含钙离子源和磷酸根离子源的胶芯。通过将壳溶解在口中而无需咀嚼直到胶基糖芯暴露出来，即可实现肽的依次释放，然后依次释放钙离子和磷酸根离子。钙和磷酸盐离子的后续释放是通过咀嚼来完成的。胶剂各区域的成分可能与表1A中的成分相同。在一个具体的实施方式中，所述成分可以如表1B中所列。
表1B：美白胶剂中包含的示例性成分
Figure BDA0002992179550000151
在一个实施方式中，可以通过在7000psi下压制上表中列出的干燥成分来制造胶芯。然后，由表中列出的粉末混合物组成的硬壳可以包裹在胶芯周围，并以9000psi的压力压制。所得到的硬壳-胶芯结构可以具有例如8mm的芯直径和10mm的整体厚度。
表1C：美白咀嚼胶中包含的示例性成分
Figure BDA0002992179550000152
Figure BDA0002992179550000161
在另一个实施方式中，一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第二制剂是水性制剂，并且其中所述第一制剂是水性制剂。在该实施方式中，所述第一制剂和第二制剂可以包括在单独容器中提供的漱口水。与唾液接触时，多肽与牙齿结合，并吸收第二种制剂中的离子，使牙齿表面再矿化。
在一个可选的漱口水设计中，所述组合物或试剂盒包含至少第一制剂，所述至少第一制剂包含：
(a)用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的有效剂量的多肽，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源，其中至少一种钙离子源和至少一种磷酸盐离子源被包封；
其中所述第一制剂被配置成以比Ca2+和PO4 3-更快的速率释放多肽。
在包含所述设计的一个实施方式中，所述至少第一制剂包含第一制剂和第二制剂，其中
(i)所述第一制剂包含多肽和至少一种钙离子源或至少一种磷酸盐离子源中的一种；和
(ii)所述第二制剂包含多肽和至少一种钙离子源或至少一种磷酸盐离子源中的一种；
其中如果第一制剂包含至少一种钙离子源，则第二制剂包含至少一种磷酸盐离子源；如果第一制剂包含至少一种磷酸盐离子源，则第二制剂包含至少一种钙离子源。在另一个实施方式中，所述至少一种钙离子源和所述至少一种磷酸盐离子源被包封在磷脂囊泡中。
在这个可选的实施方式中，所述至少一种钙离子源和至少一种磷酸根离子源可以封装在囊泡中，包括但不限于磷脂、胶束、脂质、脂质体或肽囊泡，以延迟其释放速度(相对于多肽)。可以使用任何合适的磷脂囊泡，包括但不限于聚二乙炔磷脂囊泡。囊泡可以是任何合适的尺寸，包括但不限于直径在约100nm至-约10μm。
在这种可替代的漱口水设计中，钙和磷酸盐前驱体被封装在阳离子和阴离子中性pH响应囊泡内，并在储存期间保持分离和稳定。此外，肽和前驱体离子的递送顺序是通过调节囊泡头部基团的离子特性来建立的，以在与唾液接触时达到延迟释放。例如，参见图22。
在漱口水设计的一个实施方式中，所述第一制剂或第二制剂包含：
(A)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、20％-80％、30-80％、40％-80％、45％-80％、50％-80％、60％-78％、65％-75％、或约67.5％-72.5％w/w的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；和/或
(B)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、15％-50％、20％-40％、25％-35％、27％-33％、28％-32％、29％-31％、或约29.5％-30.5％w/w的钾离子源，包括但不限于KH2PO4。
在漱口水设计的另一个实施方式中，所述第一制剂和/或第二制剂进一步包含一种或多种防腐剂、调味剂和/或抗微生物剂。在另一个实施方式中，所述多肽以约100ng/ml至约100mg/ml、1mg/ml至约100mg/ml、约10mg/ml至约90mg/ml、约20mg/ml至约80mg/ml、约30mg/ml至约70mg/ml、约35mg/ml至约65mg/ml、约35mg/ml至约60mg/ml、或约40mg/ml至约50mg/ml的浓度存在于所述第一制剂和/或第二制剂中。
这些漱口水的实施方式中的第一制剂和/或第二制剂是水性的，并且可以包含任何其他被认为合适的成分/赋形剂，包括但不限于防腐剂、调味剂等。在非限制性实施方式中，所述漱口水的实施方式包含表2A-B中列举的成分。
表2A：漱口水实施例中包含的示例性成分
Figure BDA0002992179550000181
表2B：漱口水实施例中包含的示例性成分
Figure BDA0002992179550000182
Figure BDA0002992179550000191
在一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第一制剂作为第一胶黏剂层存在，并且所述第二制剂作为第二胶黏剂层存在，其中所述第二胶黏剂层直接或间接的粘附到所述第一胶黏剂层。在一个相关的实施方式中，所述一种或多种其他制剂包含第二制剂和第三制剂，其中所述第二制剂包含所述一种或多种钙离子源，并且所述第三制剂包含所述一种或多种磷酸盐离子源，其中所述第一制剂作为第一胶黏剂层存在，所述第二制剂作为第二胶黏剂层存在，并且第三制剂作为第三胶黏剂层存在，其中第二胶黏剂层和第三胶黏剂层直接或间接的粘附到第一胶黏剂层。
在这些实施方式中，第一和第二制剂或第一、第二和第三制剂形成牙条。这些条带具有自粘特性。这些条带在唾液中是耐久的，但会渗漏，使得一个条带中的离子和另一个条带中的肽从条带中释放出来，并混合形成牙齿表面的再矿化层。条带的厚度被设计成允许一定浓度的离子和肽，以促进在牙齿表面的应用部位形成预定厚度的再矿化层。条带是柔性的，可以在齿边缘上弯曲，以覆盖面对的表面和内表面。该条具有矿化以及渗透到暴露的牙本质小管中的能力，以治疗牙齿过敏。在另一个实施方式中，当第一胶黏剂层、第二胶黏剂层和第三胶黏剂层存在时，其厚度各自独立的为50μm至500μm。在另一个实施方式中，所述第一胶黏剂层包含缓冲液中0.1％-60％、1％-58％、10％-55％、20％-52％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-约42.5％w/v的多肽。在另一个实施方式中，所述第二胶黏剂层包缓冲液中含10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；以及缓冲液中10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钾离子源，包括但不限于KH2PO4；或者，其中所述第二胶黏剂层在缓冲液中包含10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钙离子源。在另一个实施方式中，所述第二胶黏剂层包含缓冲液中10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；并且其中所述第三胶黏剂层包含缓冲液中10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钾离子源，包括但不限于KH2PO4。
在另一个实施方式中，所述第二胶黏剂层和/或第三胶黏剂层的厚度大于第一胶黏剂层的厚度，包括但不限于当第三胶黏剂层不存在时第二胶黏剂层和第一胶黏剂层之间的厚度比约为2:1，或者当第三胶黏剂层存在时第二胶黏剂层+第三胶黏剂层和第一胶黏剂层之间的厚度比约为2:1；并且其中第一、第二和第三胶黏剂层和任何中间层的总厚度约为0.05mm。
在另一个实施方式中，所述胶黏剂层可以包括被认为适合用于给定用途的任何其他成分。在多个实施方式中，所述第一胶黏剂层、第二胶黏剂层和/或第三胶黏剂层进一步包括增稠剂、表面活性剂、调味剂、纤维素或纤维素衍生物和/或防腐剂。
在一个实施方式中，所述第一胶黏剂层、第二胶黏剂层和/或第三胶黏剂层进一步包括:
0.1％-30％w/v的增稠剂，包括但不限于丙二醇(PPG)、树脂和/或甘油；
1％-30％w/v的纤维素或纤维素衍生物，包括但不限于羧甲基纤维素钠、纤维素、甲基醚、甲基化纤维素、甲基纤维素、E461(食品添加剂中的名称编号)；纤维素替代品的其他变体：羟丙基纤维素；和
0.1％至5％的表面活性剂。
胶黏剂层的实施方式的制剂可包含任何其他被认为合适的合适成分/赋形剂，包括但不限于防腐剂、调味剂、增稠剂、表面活性剂、赋形剂等。在一个非限制性实施方式中，两层的实施例中的胶黏剂层包含表3中列出的成分。在三层的实施例中，第三层可以与第二层相同，仅至少一个钙离子源在一层中，并且至少一个磷酸盐离子源在另一层中。
表3：在两层实施例中胶黏剂层中包含的示例性成分
Figure BDA0002992179550000201
Figure BDA0002992179550000211
所述不同的粘合剂层可以直接接触或者由分离层分隔开。这样的分离层可以包含任意合适的分离层，包括但不限于纤维素凝胶薄层。
在另一个实施方式中，所述第一制剂包含缓冲液中10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的多肽。在另一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包括第二制剂和第三制剂，其中:
第二制剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种钙离子源，包括但不限于CaCl2；和
第三制剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种磷酸盐离子源，包括但不限于K2HPO4。
在这个实施方式中，所述第一制剂、第二制剂和第三制剂进一步包含防腐剂、增稠剂、调味剂和/或表面活性剂。在另一个实施方式中，所述第一制剂、第二制剂和第三制剂进一步包含：
5％-50％w/v的增稠剂，包括但不限于聚丙二醇(PPG)、甘油、羧甲基纤维素钠和/或树脂；和/或
0.1％-5％的表面活性剂。
在另一个实施方式中，所述一种或多种其他制剂包括第二制剂和第三制剂，其中所述第一、第二和第三制剂是第一、第二和第三糊剂，并且各自被分离糊剂分开，其中：
第一糊剂包含缓冲液中10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％，或约47.5％至约52.5％w/v的多肽；
第二糊剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种钙离子源，包括但不限于CaCl2；和
第三糊剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种磷酸盐离子源，包括但不限于K2HPO4；并且其中第一糊剂的粘度小于第二糊剂和第三糊剂的粘度。
在这个实施方式中，所述组合物包含牙膏，其中制剂的粘度、活性成分的相对浓度和总量决定了肽和离子从三组分糊剂结构中的溶解速率，保证了肽在后离子组分释放后再释放的顺序。在一个实施方式中，所述第一糊剂、第二糊剂和第三糊剂包含增稠剂，所述增稠剂包括但不限于聚丙二醇(PPG)、甘油和/或羧甲基纤维素钠。在另一个实施方式中，所述第一糊剂、第二糊剂和第三糊剂包含丙二醇(PPG)、甘油和羧甲基纤维素钠(SCS)，其中第一糊剂包含比第二糊剂和第三糊剂更高浓度的PPG，并且其中第一糊剂包含比第二糊剂或第三糊剂更低浓度的SCS。在又一个实施方式中，所述第一糊剂中的PPG与所述第二糊剂和第三糊剂中的PPG比例约为5:3，和/或其中所述第一糊剂中的SCS与所述第二糊剂和第三糊剂中的SCS比例约为2:3。
所述糊剂可以储存在例如在可挤压的或泵作用的牙膏管中，作为跨越管长的单独的条状糊剂，并且任选的由中性糊剂层分开(例如，仅由非活性成分制成的糊剂)。
这些牙膏实施方式中的糊剂可以包含其他任意被认为合适的合适成分/赋形剂，包括但不限于防腐剂、调味剂、增稠剂、表面活性剂等。在一个非限制性实施方式中，所述糊剂包含表4中列出的成分。
表4:牙膏配方的基础凝胶配方成分列表。
Figure BDA0002992179550000221
Figure BDA0002992179550000231
在所有这些实施方式及其组合中，所述多肽包含选自下述的氨基酸序列或由下述的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)，或其功能等同物；
(PGYINFSYENSHSQAINVDRTA)1-10(SEQ ID NO:6)(ADP5H)，或其功能等同物；和
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)，或其功能等同物；
或者它们的组合。
在另一个实施方式中，所述多肽包含选自下述的氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成：
(HTLQPHHH(L/I)PVV)1-10(ADP1；SEQ ID NO:1)；
(VPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP2；SEQ ID NO:4)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVV)1-10(ADP4；SEQ ID NO:10)；
(PAQQPV(A/I)PQQPMMP)1-10(ADP8；SEQ ID NO:21)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；
HTLQPHHHLPVV)1-10(ADP1M；SEQ ID NO:2)；
(HTLQPHHHIPVV)1-10(ADP1H；SEQ ID NO:3)；
(VPGHHSMTPTQH)1-10(ADP2M；SEQ ID NO:5)；
(VPGQHSMTPIQH)1-10(ADP2H；SEQ ID NO:14)；
(HPPSHTLQPHHHLPVV)1-10(ADP4M；SEQ ID NO:11)；
(HPPTHTLQPHHHIPVV)1-10(ADP4H；SEQ ID NO:12)；
(HPPSHTLQPHHHLPVVPAQQPVAPQQPMMPVPGHHSMTPTQH)1-10(ADP7M；SEQ ID NO:19)；
(HPPTHTLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQH)1-10(ADP7H；SEQ ID NO:20)；
(PAQQPVAPQQPMMP)1-10(ADP8M；SEQ ID NO:22)；和
(PAQQPVIPQQPMMP)1-10(ADP8H；SEQ ID NO:23)；
(WPATDKTKREEVD)1-10(ADP3M；SEQ ID NO:8)；
(WPSTDKTKREEVD)1-10(ADP3H；SEQ ID NO:9),
MLPHHGA(HABP1；SEQ ID NO:25)；和
NPGFAQA(HABP2；SEQ ID NO:26)；
或其功能等同物及其组合。
如本文所用，多肽的“功能等同物”是指在治疗牙齿疾病中保留有生物活性的多肽，包括一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或插入。在各种实施方式中，所述功能等同物与所述多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多相同。
如本申请通篇所用，术语“多肽”以其最广泛的含义用于指亚单位氨基酸序列，无论是天然存在的还是合成的。本发明的多肽可以包含左旋氨基酸、右旋氨基酸(其在体内对左旋氨基酸特异性蛋白酶具有抗性)或右旋和左旋氨基酸的组合。本文所述的多肽可以化学合成或重组表达。多肽可以与其他化合物连接，以促进体内半衰期的增加，例如通过聚乙二醇化、糖基化、磷酸化或糖基化。如本领域技术人员所知晓的，这种连接可以是共价或非共价的。
在各种实施方式中，所述多肽可以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝存在，优选一个拷贝。当存在多个拷贝时，这些拷贝彼此相邻。例如，ADP5的2个拷贝将是：PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTAPGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA(SEQ ID NO:15)。基于此教导，进一步的示例对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
在另一个实施方式中，所述多肽以单一拷贝存在。在另一个实施方式中，所述多肽与抗微生物肽相连。任意合适的抗微生物肽均可使用，包括但不限于：
KWKRWWWWR(SEQ ID NO:27)；
LKLLKKLLKLLKKL(SEQ ID NO:28)；
CPFVC(SEQ ID NO:29)；
RRXXRF(SEQ ID NO:30)；
ALLHHGLNCAKGVLA(SEQ ID NO:31)；
LWKTLLKKVLKAAA(SEQ ID NO:32)；
GLRKRKRKFRNKKKEKLKKI(SEQ ID NO:33)；和
RKRIHIGPGRAFYTT(SEQ ID NO:34)。
在另一个实施方式中，所述第一制剂和/或一种或多种其他制剂进一步包含氟化物。在一个实施方式中，所述氟化物在所述第一制剂和/或所述一种或多种其他制剂中以约50ppm至约20,000ppm、约50ppm至约10,000ppm、约50ppm至约5000ppm、约50ppm至约1000ppm、约50ppm至约500ppm、或约75ppm至约400ppm、约100ppm至约300ppm、约150ppm至约250ppm、或约200ppm的量存在。
本发明的多肽可以是药物组合物中的唯一活性剂，或者该组合物可以进一步包含一种或多种适合预期用途的其他活性剂，包括但不限于抗微生物多肽(抑制细菌感染)、生物矿化促进多肽(即：可用于控制或促进生物矿化的任何多肽)、无机材料结合多肽、三维支架形成多肽、胶原蛋白、壳聚糖、两亲性肽、蛋白质结合多肽，釉质素衍生多肽，釉丛蛋白衍生的肽，富酪蛋白衍生的多肽，牙本质衍生的多肽，骨唾液蛋白衍生的多肽，骨钙蛋白衍生的多肽，骨桥蛋白衍生的多肽，具有龋齿抑制活性的蛋白，酪蛋白和骨形态发生衍生多肽。
本公开的组合物或试剂盒可以包括认为适合预期用途的任何其他组分。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保持牙齿结构和/或修复由于脱矿质作用导致的牙齿矿物质损失的方法，包括对有需要的受试者口服给药：
(a)包含有效量的多肽的第一制剂，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成，所述有效量的多肽用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的矿物质含量：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)一种或多种其他制剂，所述其他制剂包含至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源；
其中所述第一制剂被施用给所述受试者，使得在从所述至少一种钙离子源释放Ca2+和从所述至少一种磷酸盐离子源释放PO4 3-之前，所述多肽可接触到所述受试者的一颗或多颗牙齿。
因此，所述方法包括使用本文公开的任何组合物或试剂盒来治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿质作用导致的牙齿矿物质损失。本文公开的组合物和试剂盒的所有实施方式及其组合可用于该方法。
受试者可以是任何可能患有牙科疾病的受试者，包括但不限于哺乳动物。在各种实施方式中，所述哺乳动物是人、狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、猪或其他宠物或食用/乳用动物。在一个优选实施方式中，所述受试者是人。
如本文所用，牙齿疾病是影响牙齿、牙龈(牙龈)或其他口腔组织的任何疾病或病症，包括(直接或间接)脱矿质(即：牙齿表面矿物质含量的损失)。对健康人来说，牙齿通过牙齿表面和周围唾液之间的离子交换处于脱矿和再矿化的循环中。当脱矿率超过再矿化率时，就会导致牙齿疾病。脱矿是大多数牙科疾病的主要原因。矿物质的流失可以通过任何方式引起，包括但不限于酸性饮食、口干、牙齿美白、牙齿磨损和致龋细菌。
这种牙科疾病可以包括但不限于牙周炎、牙侵蚀、过敏、龋齿(也称为蛀牙/蛀洞)、氟斑牙、牙齿吸收、颅颌面骨疾病和牙龈萎缩。
如本文所用，“牙周炎”是一组影响牙周组织(即包围和支撑牙齿的组织)的炎性疾病。牙周炎涉及牙齿周围牙槽骨的逐渐损失，如果不治疗，会导致牙齿松动和随后的丧失。牙周炎是由附着并生长在牙齿表面的微生物以及对这些微生物的过度攻击性免疫反应引起的。
如本文所用，“牙齿脱矿”或“牙齿磨损”是牙齿釉质的磨损。这种牙齿磨损可能是由多种因素引起的，包括侵蚀(酸性饮食)、正常功能或异常功能引起的磨牙(磨损)、磨损以及某些情况下的内部碎裂。
如本文所用，“过敏症”是指牙齿牙本质内神经环境的暴露程度增加，导致神经反应增加，可为轻度至重度。敏感性可能由任何因素引起，包括但不限于磨损、蛀牙或牙根暴露。
本文所用的“龋齿”是一种感染性疾病，通常是细菌引起的，引起硬组织(牙釉质、牙本质和牙骨质)的脱矿和牙齿有机物的破坏。最常见于牙洞的细菌是变形链球菌和乳酸杆菌。如果不治疗，龋齿会导致疼痛、牙齿脱落和全身感染。
如本文所用，“氟斑牙”是牙齿发育过程中过度暴露于高浓度氟化物引起的牙釉质发育障碍。在3个月至8岁之间，氟化物过度暴露的风险最大。轻度氟中毒通常表现为牙齿釉质中不明显的微小白色条纹或斑点。在最严重的情况下，牙齿外观会因变色或棕色斑点而受损。釉质可能有凹痕、粗糙且难以清洁。氟中毒留下的斑点和污渍是永久性的，随着时间的推移可能会变暗。
如本文所用，“牙齿再吸收”是牙齿结构全部或部分丧失的过程。在“外吸收”中，牙根表面丧失；这可能由例如慢性炎症、囊肿、肿瘤、外伤、牙齿再植或未知原因引起。“内吸收”包括根管中心的牙本质和牙髓壁的吸收；原因有时可归因于牙齿外伤，但通常没有公知的原因。
如本文所用，“牙龈萎缩”是由于牙龈线从牙冠上缩回而导致牙根(牙骨质)暴露于环境中。牙骨质是一种钙化组织，通过牙周韧带支持牙齿附着在下颌骨或上颌骨上。暴露的牙骨质会导致牙骨质的再吸收和潜在牙本质的暴露，从而导致过敏和疼痛。
在一个实施方式中，“颅颌面骨疾病”是指牙骨结构疾病。
本文所用的“治疗牙齿疾病”是指完成以下一项或多项：(a)降低牙齿疾病的严重程度；(b)限制或防止所治疗的牙齿疾病的症状发展；(c)抑制所治疗的牙齿疾病的症状恶化；(d)限制或预防先前患有牙齿疾病的患者的牙齿疾病的复发；(e)限制或防止以前有牙齿疾病症状的患者的症状复发；和(f)限制有患牙科病症风险的受试者的牙科病症的发展，或尚未显示牙科病症的临床效果。
本公开的任何实施方式或实施方式的组合的方法和组合物也可用于修复和保持牙齿结构，修复由于脱矿导致的牙齿矿物质损失，或用于化妆品目的美白牙齿。
如本文所用，“有效量”是指多肽对治疗和/或限制牙齿疾病有效的量。
在一个实施方式中，本文公开的锭剂组合物口服给药于受试者。一旦壳区溶解在唾液中，多肽就从牙齿中释放出来并沉积在牙齿上。壳区溶解后，核心区向牙齿提供钙和磷酸盐离子，开始生物矿化。修复过程包括修复矿物结构，从而通过增厚牙釉质并渗透到牙小管中来消除过敏的风险，并恢复牙齿的自然“白色”。
在另一个实施方式中，本文公开的漱口水组合物和试剂盒被口服给药于受试者，并且多肽首先被释放并快速结合到牙齿上(例如，在10、20、30、40、50、60秒内)，随后用第二容器提供钙离子和磷酸盐离子，或者所述钙离子和磷酸盐离子以与多肽相同的制剂存在，但是在囊泡内，所述囊泡延迟离子的释放，直到多肽结合到牙齿上。
在另一个实施方式中，本文公开的组合物和试剂盒的牙条/胶黏剂层实施例被应用于受试者的牙齿。条带是柔性的，可以在齿边缘上弯曲，覆盖面对表面和内表面。这些条带导致受损牙齿表面形成矿物质，并导致新形成的矿物质渗透到暴露的牙小管中，以治疗牙齿过敏。
在又一个实施方式中，牙膏组合物通过例如刷牙给药于受试者。多肽存在于第一糊剂中，其粘度低于释放离子的第二糊剂和第三糊剂的粘度。例如，糊剂可以储存在例如在可挤压的或泵作用的牙膏管中，作为跨越管长的单独的条状糊剂，并且任选的由中性糊剂层分开(例如，仅由非活性成分制成的糊剂)。
实施例1
牙齿变色是许多人普遍关心的美学问题，为此，牙科专业人员和公众花费了大量的时间和金钱来改善着色牙齿的外观。根据色斑沉积的来源和位置，牙齿变色可以分为不同的类别，进行分类也有利于开发靶向治疗。所述类别包括：(i)外源性变色，变色原沉积在牙齿外表面或薄膜层内，如茶、咖啡、烟草、金属和饮食产品的盐成分(铜、硫化物)；(ii)固有染色，其中牙齿的光学特性由于牙本质的结构变化而改变，所述牙本质的结构变化是由于老化、遗传因素、根管治疗材料的渗漏或代谢疾病，例如，尿碱症、先天性红细胞生成性卟啉症、先天性高胆红素血症、牙釉质生成不全、牙本质生成不全。暴露于色原，如四环素染色、氟中毒；儿童早期牙齿发育过程中的化疗药物也是牙齿固有染色的另一个原因，其中色原结合到牙本质组织中。其他类型的牙齿变色是(iii)色斑内化，其中在牙齿发育过程中，通过牙釉质和牙本质缺陷或牙齿修复材料的渗漏，外源性色原色素被结合到矿物组织中；以及(iv)浅层次表层脱矿，其形式为白斑损伤，这是由于牙科手镯(dentalbracelets)和其他正畸矫治器周围的微生物活性增强而导致的长期细菌酸性攻击的结果。
目前的美白方法的主要问题是使用高活性的过氧化物基化学物质，通过溶解牙齿表面的着色矿物层来去除变色。这种化学蚀刻过程是以牙釉质的损伤为代价的，牙釉质是牙冠完全矿化的外层。因此，潜在的牙本质暴露出来，造成了过敏和对蛀牙的敏感性增加等问题，所述问题远远超过任何美容益处。美国牙科协会报告称，过氧化物脱矿导致的牙釉质侵蚀会导致不利影响，包括：过敏(发生在64％的患者中)、牙龈萎缩、牙髓炎症和经常使用美白产品导致的蛀牙。
在此，我们开发了一种牙齿美白锭剂和相关的实施方式，其可以用作载体，以实用的方式递送矿化成分、肽和钙离子和磷酸盐离子，从而通过添加剂、仿生过程实现牙齿美白。
目前基于过氧化氢的美白产品通过化学蚀刻釉质上的天然牙齿矿物质来去除牙齿变色，从而去除驻留在矿物质顶部的污渍沉积物。虽然这种磨蚀过程通过暴露牙齿矿物质的内部未着色区域而导致牙齿变白，但代价是牙齿留下高度腐蚀的、脱矿的牙齿表面。另一方面，本文公开的组合物和方法通过肽激活的仿生修复过程再生天然牙齿矿物质来美白牙齿。在一个锭剂的实施方式中，锭剂包含两个活性层：一个外壳含有催化牙釉质再生的生物矿化肽，一个内核含有钙和磷酸盐—天然再矿化所需的原料。每一层在恢复过程中都起着重要的作用。一旦外壳溶解，多肽就从外层释放出来并沉积在牙齿上。壳耗尽后，内核向生物矿化成分提供钙和磷酸盐。修复过程包括矿物结构的再生(通过增厚釉质消除过敏风险)和重现牙齿的自然色。
再矿化美白产品，例如锭剂，包括核-壳结构。壳含有作为活性成分的再矿化肽，而核含有作为主要成分的钙离子和磷酸盐(图2)。使用不同量的赋形剂分别配制再矿化增白锭剂的核和壳组分。
锭剂外壳(肽)中的活性成分与润滑剂(硬脂酸镁)、山梨醇、木糖醇、薄荷和其他类型植物香料形式的甜味剂、滑石、乳糖、薄荷醇等形式的赋形剂混合。在制造之前，所述配料通过球磨机进行干混和均质化。
表5：下述研究中使用的锭剂剂型
Figure BDA0002992179550000291
通过使用液压机在5000-10000吨/平方米范围内的压力下在金属模具(直径为6-15mm)内压缩混合的成分，将再矿化增白锭剂制造成锭剂(lozenge-shape)。
为了分析分解时间，使用了USP Dissolution 2(USP-2)装置。该装置是文献中使用的用于模拟口腔环境的装置，其中桨和轴系统以37℃和60rpm的速度搅拌人工唾液。测试开始时，向系统中加入9ml唾液，然后每1min取出并更换一次，以模拟唾液的吞咽和复制。通过量化初始和剩余锭剂的总重量来分析在不同压力下压缩并由不同成分组成的锭剂。在下一个步骤中，将离体人牙齿样本放入USP-2装置中，在37℃下，在60rpm的恒定搅拌下，通过向USP-2容器中加入人工唾液来对锭剂进行处理。锭剂处理15min，通过每分钟更换容器中的人工唾液来进行，并在15min结束时从USP装置中取出牙齿样本完成处理过程。样品用去离子水冲洗，并破碎成两块，通过扫描电子显微镜进行表面和横截面分析。在扫描电镜分析之前，样品用加压气流进行干燥，并涂上5nm金层。
使用微距摄影成像和Adobe Lightroom颜色分析软件对锭剂处理的人类牙齿样本进行增白量化。根据目测评估，将牙齿样本被安装在金属带上，并被放入维塔遮光板岩石(Vita Shade Guide rock)中。图像是在锭剂处理前后使用佳能Rebel T5i相机(配有18-135mm微距镜头)在定制的配有白色LED和漫射器的摄影站(photo-station)内拍摄的。半定量量化基于使用vita色度指南的视觉色度比较，绝对颜色分析通过使用Adobe Lightroom颜色分析软件分析成像来进行。结果用牙科常用的CIE L*a*b*颜色模型表示。
对从牙科诊所收集的人类牙齿进行了美白锭剂产品与现有HP基牙齿美白产品的正面对比。根据目测评估，将牙齿样本被安装在金属带上，并被放入维塔遮光板岩石中。对于对比产品，使用14％HP含美白条和40％HP含临床美白凝胶。根据制造商的说明，对每颗牙齿进行7轮增白处理。如前所述，在USP-2装置内进行锭剂处理。标本的图像是在使用佳能Rebel T5i相机(配有18-135mm微距镜头)进行锭剂处理之前拍摄的，该相机位于一个定制的配有白色LED和漫射器的摄影站内。半定量量化基于使用vita色度指南的视觉色度比较，绝对颜色分析通过使用Adobe Lightroom颜色分析软件分析成像来进行。结果用CIE L*a*b*系统表示。
结果
在溶解时间测试之后，确定了在15min内在人工唾液中产生完全溶解的增白锭剂的最佳片剂配方和压缩力(见表5)。接下来，将离体人牙齿样品放入USP-2装置中，进行15min的矿化。在离体人牙齿上进行一轮锭剂处理后，在牙釉质上形成了一层连续的片状晶体矿物层，其厚度约为1μm(图3)。
通过宏观照相和颜色分析来测量再矿化锭剂的增白性能。以此为目的，采用液压机进行压制的方法制备得到了核壳锭剂。将离体的固有深色的人牙齿样本安装在不锈钢支架上，并放入导光架(shade guide rack)中。记录预设灯光设置下的图像。接下来，将样品放入USP-2装置中，进行15min的矿化。取出样品，用蒸馏水滴洗，放回遮光架(shade rack)上的相同位置，并拍摄光学图像(图4)。如图4所示，未处理样品的平均颜色(在虚线圆圈内)是使用CIE系统中的Adobe Lightroom测量的，用L*a*b颜色单位表示。CIE L*a*b*的三个坐标表示颜色的亮度，其中L＝0表示黑色，L＝100表示漫射白色，a＝负值表示绿色，而a＝正值表示品红色，b＝负值表示蓝色，b＝正值表示黄色。当处理前牙齿样本的平均颜色被量化为L＝68.93，a＝2.93，b＝27.92时，在再矿化处理后，它被测量为L＝69.37，a＝3.93，b＝22.47。表示白度总变化的ΔE值使用等式1计算为5.56，如下所示：
Figure BDA0002992179550000301
对安装在金属带上的人类离体牙齿进行了美白锭剂与HP基商业牙齿美白产品的全面比较。每个样品的一半接受7轮连续的增白处理(每天1次处理)，而另一半不接受处理。在每次处理过程中，将标本保存在人工唾液中。使用4个试验组：1)不处理，2)用含14％HP的增白条处理，3)用含40％HP的临床增白凝胶处理，和4)增白锭剂处理。拍摄样本图像，使用佳能Rebel T5i相机(配有18-135mm微距镜头)将牙齿的两半并排放置在一个定制的配有白色LED和漫射器的摄影站内。虽然在阴性对照样品(未接受处理)的左侧和右侧之间没有显著变化被观察到或被量化，但接受不同类型增白处理的其他3组与左半部分或处理前牙齿右侧拍摄的图像相比显示出不同的增白量。如下表6所示，分别用7轮增白条(14％HP)、临床凝胶(40％HP)和增白锭剂处理的样品的ΔE值(白度变化)计算为4.0±2.8、11.1±2.8、10.2±1.1。这些结果表明，在类似的处理条件下(如表3所示)，增白锭剂比其OTC对应物增白条有效三倍。更重要的是，锭剂的美白性能与临床凝胶相当，但临床凝胶比锭剂贵约300倍，且需要牙科医生。
表6：商业产品与再矿化锭剂的美白效果
Figure BDA0002992179550000311
为了证明这些处理方式对天然牙齿表面的影响，在增白量化后，对样品进行扫描电镜分析。如下图5所示，天然牙面(未处理)光滑，对比均匀。经过增白条处理后，牙齿表面变得更粗糙，这是过氧化氢处理后脱矿质过程的迹象。更重要的是，临床凝胶处理后牙齿表面的粗糙度增加，这可以用临床凝胶中过氧化氢含量较高来解释。另一方面，与商业产品的化学蚀刻效果相反，锭剂处理产生了厚度约为2μm的新矿物层。综上所述，虽然HP基商业产品在不同程度上蚀刻牙釉质表面并产生自然的牙釉质颜色，但再矿化锭剂用新的矿物质覆盖表面，并以更健康的方式美白牙齿。
其他实施例
本发明中许多其他成分的实施方式是可能的，因为锭剂实施方式的证明改进可以用于牙齿美白和使其更健康和新鲜的口腔护理。这些消费品包括牙膏、口香糖、口腔清新剂、牙条、牙托凝胶、牙齿防护用品等。本文描述了在产品的双组分设计中实现肽的再矿化作用的方法和材料。双组分设计涉及两种活性成分：一种含有肽，另一种含有钙和磷酸根离子。在这种设计中，制剂中剩余的非活性组分可以掺入任一组分中。第二个发现是双组分设计可以在口腔的生理条件下溶解在模拟唾液溶液中。这两种元素或成分在同时起作用时，会形成一种状态，使再矿化作用机制变得可行。此外，产品(例如锭剂)的溶解时间可以通过仔细选择非活性成分来控制。
潜在消费产品(非独家)包括牙膏、口香糖、漱口水/漱口片、凝胶、液体洁齿剂、牙片/锭剂/片剂/药片、外用凝胶、牙膏、牙齿清漆、牙科摩丝和食品。
牙膏——双组分设计包含两种配方，一种含有再矿化肽，另一种含有钙和磷酸盐离子；配方的其余部分含有非活性成分。虽然每种配方都有不同的化学组成，但每种配方都有相同的机械特性，特别是粘度和物理性能，如模量和塑性。每种成分的溶解特性也是相同的，能够在口腔环境中与唾液充分接触，并同时在其中完全溶解。这已经在锭剂的情况下得到证明，同样的方法也用于牙膏。双组分设计在给定的单管糊剂中有两个通道：一个糊剂包含结合肽，另一个包含离子。当在牙刷上挤出时，两种成分混合，当应用到牙齿上时，两种成分混合，产生再矿化的作用机制。
口香糖——层状口香糖有两种成分：一种含有肽，另一种含有两种离子。这两层具有相同的结构和物理特征。这两层的厚度是一样的。这两种组分的粘度以及化学和机械稳定性也是相同的，这意味着非活性组分是相似的。在咀嚼作用下，两种活性成分混合，各自溶解在唾液中。在牙齿表面固定后，肽吸收离子并引起再矿化。每种胶剂都有一定的寿命，在此期间，离子和肽会不断从牙龈中释放出来，但速度会降低，溶解在唾液中，并在牙齿表面重新矿化。
漱口水——再矿化漱口水的双组分设计包括两个含有肽或离子的微容器(如囊泡)。与唾液接触时，囊泡的膜会溶解，内含物释放到唾液中，当接触时，在牙齿表面形成新的矿物质。再矿化将在口腔中用漱口水漱口的过程中持续一段时间，例如30s至1min。除了肽和离子作为活性成分，还引入了其他成分来清新口气和对抗口臭。漱口水是设计来对抗口干/口干症的，其作为一种润滑剂和口气清新剂，添加了通用成分。
再矿化牙齿美白条——肽导向美白条设计为两层50-500μm厚的凝胶层相互接触，一层含有肽，另一层含有离子。增白条具有自粘特性。这些条带在唾液中是耐久的，但会渗漏，使得一个条带中的离子和另一个条带中的肽从条带中释放出来，并混合形成牙齿表面的再矿化层。条带的厚度被设计成可容纳一定浓度的离子和肽，以促进在牙齿表面应用部位形成预定厚度的再矿化层。条带是柔性的，以在齿边缘上弯曲，覆盖面对表面和内表面。该条具有矿化以及渗透到暴露的牙小管中的能力，以治疗牙齿过敏。
牙托中的美白凝胶、糊剂、粉末或液体制剂——牙托具有与目前可用的牙托相似的物理和机械特性，可用于多种用途，例如，防止磨牙、保护牙齿免受运动防护装置的冲击。牙托由热固性或热塑性材料制成，具体取决于使用目的。热塑性塑料符合牙齿的形状，覆盖表面，例如在白天或夜间使用时，保护已经用其它再矿化产品如凝胶、条或清漆形成的再矿化层。热塑性牙托的内表面有一层含有肽和离子的再矿化凝胶层。在热固性牙托的情况下，其形状不仅符合上下牙齿组的3D结构，而且在龋齿部位具有包含具有特定体积的矿化凝胶袋的装置。矿化凝胶有两种成分：一种含有肽，另一种含有钙/磷酸根离子，它们被一层可渗透的膜隔开，该膜在机械挤压时破裂，例如在牙齿咀嚼过程中。矿化被限制在沿着牙托内表面的区域内，这些区域的位置由龋齿在牙齿表面上的位置和由在牙托内表面上具有负面效果的龋齿的尺寸所限定的体积来限定。在牙科专业人员或牙科临床医生的指导下，可以监测龋齿，直到完全再矿化和组织完全修复。
再矿化牙齿清漆——这种清漆具有双组分设计，其非活性成分与市售牙科清漆相同，但不含氟离子。两种清漆中的每一种都含有再矿化肽或钙和磷酸盐离子，它们是在牙齿表面形成新矿物质的活性成分。清漆具有足够的粘度，可以直接涂在牙根上，尤其是在牙根最容易过敏的牙齿清洁过程后。该再矿化牙齿清漆不仅具有形成矿物质的能力，而且矿物质渗透到牙齿根部任何暴露的牙小管中。
牙科产品中的嵌合肽设计：再矿化肽可以设计成具有双重功能；一种具有再矿化特性，另一种具有例如抗微生物特性。抗微生物肽(ATPs)的一个成员使用柔性接头(如其间的GGG)与再矿化肽缀合。然后将嵌合肽掺入上述制剂或产品中的双组分之一。所有其他材料和方法在产品的双组件设计中是相同的。一种成分包括嵌合肽作为活性成分，另一种成分包括掺入其中的前驱体离子，以及两种成分中的非活性成分。
此类产品可能还包括口香糖、含有再矿化(肽)和酸碱度平衡(钙和磷)漱口水的润滑剂，还包括具有消除口臭双重效果的漱口水、用于口干患者的漱口水、牙膏、孩子们午饭后放置于学校的午餐盒中用于预防龋齿的再矿化糖果。
再矿化漱口水
每个容器中的双桶再矿化漱口水的组分是分别使用下表7中详述的赋形剂配制的。
表7：漱口水制剂中包含的组分及其含量
桶1 桶2
成分 含量(mg) 含量(mg)
shADP5肽 125.0 125.0
CaCl<sub>2</sub>·H<sub>2</sub>O 0.0 70.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 30.0 0.0
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 10.0 0.0
苯甲酸钠 1.0 1.0
山梨醇 4.0 4.0
薄荷 5.0 5.0
水 100.0 100.0
在离体人牙釉质上测试漱口水的再矿化功效。为此，将牙齿样本安装在金属桩上，并使用液滴分配器将含肽漱口水(桶-1)涂抹在牙齿表面。将50μl溶液以大约60°的角度滴到牙齿表面上，使得它能够以小于1s的接触时间滑过牙齿表面，其中剩余液体在牙齿表面上的保留时间为4s。该过程重复3次，以在含肽桶-1的成分和牙齿表面之间建立10-12s的接触时间。接下来，使用液滴分配器将含钙和磷酸盐的漱口水(桶-2)涂敷到牙齿表面。将50μl溶液以大约60°的角度滴到牙齿表面上，使得它能够以小于1s的接触时间滑过牙齿表面，其中剩余液体在牙齿表面上的保留时间为4s。该过程重复7次，以在含肽桶-2的成分和牙齿表面之间建立20s的接触时间。再矿化处理后，用人工唾液滴冲洗牙齿样品，然后用去离子水冲洗，并准备进行扫描电子显微镜分析。样品沿垂直于处理表面的方向断裂，并涂上金。成像在10千伏启动电流下进行。
釉质上形成了一层连续的有片状晶体的矿物层。作为对离体人牙齿进行一轮漱口水处理的结果，新形成的矿物层的计算厚度被测量为300-100nm(图13)。
再矿化牙条
使用不同量的赋形剂分别配制双层再矿化带的组分。第一层中的活性成分(肽)与等浓度的钙离子、山梨醇/木糖醇形式的甜味剂、薄荷和其他类型的植物香料、丙二醇形式的增稠剂、纤维素胶和甘油以及二甲基硅油形式的表面活性剂混合。各条带的具体成分见表8。本发明提供了一个肽层，并且含有钙离子源的层和含有钾离子源的层交替存在(见图20)。
表8：再矿化条带中包含的成分及其含量
Figure BDA0002992179550000351
再矿化条带采用双层结构，以水和甘油为主要溶剂对成分进行混合。含钙的第二层(底部)被置于塑料薄膜表面，并被一薄层纤维素胶凝胶覆盖，以与其他层分离。接下来，将含肽的凝胶层叠在膜表面。底部和顶部凝胶之间的厚度比保持为2:1，以提供最佳的活性成分递送。
在离体人牙釉质上测试牙条(oral strip)的再矿化效果。一个牙齿样本被放在金属桩上，用人工唾液浸湿。将双层条带放在牙齿表面并保持30min，以进行再矿化。再矿化处理后，用人工唾液滴冲洗牙齿样品，然后用去离子水冲洗，并准备进行扫描电子显微镜分析。样品沿垂直于处理表面的方向断裂，并涂上金。成像在10千伏启动电流下进行。
在釉质上形成了具有片状晶体的连续矿物层(数据未显示)。新形成的矿物层的计算厚度被测量为700±100nm，这是对离体人牙齿进行一轮牙条处理的结果。
再矿化肽可以设计成具有双重功能：一种具有再矿化特性，另一种具有例如抗微生物特性。抗微生物肽(AMPs)的一个成员可以使用柔性接头与再矿化肽缀合，例如其间的GGG。然后可以将嵌合肽掺入本文所述制剂和产品中的双组分之一。所有其他材料和方法在产品的双组件设计中是相同的。一种成分包括嵌合肽作为活性成分，另一种成分包括掺入其中的前驱体离子，以及两种成分中的非活性成分。
抗菌再矿化肽是通过将shADP5再矿化肽与抗菌肽LKLLKKLLKLLKKL(SEQ ID NO:28)结合而构建的。一个柔性的甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸残基被置于两者之间，这样嵌合肽中的每个隔室可以自由地暴露于环境中。使用不同量的赋形剂分别配制双桶再矿化抗菌凝胶的组分。
如表9所示，通过使用水和甘油作为主要溶剂对成分进行混合，以两个条带结构制造再矿化凝胶。除了含有钙离子源(氯化钙)的条带和含有钾离子源(K2HPO4)的条带以交替方式排列在单层内(见图20)之外，每个条带都是相同的。
表9：
Figure BDA0002992179550000361
Figure BDA0002992179550000371
在离体人牙釉质上测试牙条(oral strip)的再矿化效果。一个牙齿样本被固定在金属桩上。使用牙签，将肽凝胶制剂应用于牙齿表面以覆盖受影响的牙釉质，并在37℃孵育10min。然后，将第二种凝胶放在预处理过的区域，等待以确保溶液充分混合，从而发生矿化。抗微生物凝胶保持50min以进行再矿化。在再矿化处理后，用人工唾液滴冲洗牙齿样品，然后用去离子水冲洗，并准备用于扫描电子显微镜分析。样品沿垂直于处理表面的方向断裂，并涂上金。成像在10千伏启动电流下进行。
将再矿化的样品浸泡在变异链球菌培养物(OD600:0.5)中，并保持24小时用于细菌定殖。然后将标本放入活/死细菌分析溶液中，用共聚焦显微镜观察。
釉质上形成了一层连续的有片状晶体的矿物层。新形成的矿物层的厚度被测量为1.2±0.1μm，这是在离体人牙齿上进行嵌合抗微生物处理的一轮牙条检测的结果。
共聚焦荧光成像显示变异链球菌在新形成矿物上的定殖与未矿化(未处理)的釉质表面相比减少了95％，表明了嵌入新形成矿物中的肽的抗微生物活性的功效。
再矿化凝胶和清漆配方
制备了三种不同的凝胶制剂，其包含纯度>95％的shADP5肽、钙离子或PO4离子的水溶液。这三种物质有着相同的化学成分，这些化学成分是凝胶或清漆配方所特有的。凝胶和清漆之间的主要区别是在清漆配方中使用树脂代替甲基纤维素。表10和11分别列出了凝胶和清漆的具体成分。
表10：凝胶制剂的基础凝胶配方成分列表。
Figure BDA0002992179550000372
Figure BDA0002992179550000381
表11：清漆制剂的基础凝胶配方成分列表。
Figure BDA0002992179550000382
Figure BDA0002992179550000391
再矿化凝胶是从制备1.6mM的ADP5、960mM的CaCl2和575mM的K2HPO4开始，在24mM的Tirs-HCl缓冲液中，最终的pH值被调节到7.4。单独地，凝胶制剂混合物通过使用低速(50C)螺旋桨混合器混合山梨酸钾、丙二醇、甘油、60％山梨醇水溶液、二甲基硅油和纤维素胶来制备。混合物降回到室温后，通过使用低速螺旋桨混合器将1.6mMADP 5、960mM CaCl2或575mM K2HPO4的溶液与凝胶制剂混合物按照50-50混合，制成最终制剂。为了储存，含有每种活性成分的凝胶储存在单独的注射器中，以防止过早的矿化反应。
清漆是从制备1.6mM的ADP5、960mM的CaCl2和575mM的K2HPO4开始，在24mM Tirs-HCl缓冲液中，最终的pH值调节至7.4。单独地，清漆配方混合物通过使用低速(60C)螺旋桨混合器混合山梨酸钾、丙二醇、甘油、60％山梨醇水溶液、二甲基硅油和树脂来制备。混合物降回到室温后，通过使用低速螺旋桨混合器结合旋转螺旋桨在混合期间的上下运动，将1.6mMADP 5、960mM CaCl2或575mM K2HPO4的溶液与凝胶制剂混合物按照50-50混合，制成最终制剂。为了储存，含有每种活性成分的凝胶被密封在单独的可挤压袋中，以防止过早的矿化反应。
人类牙齿是从华盛顿大学牙科诊所的匿名病人身上收集的。分别在华盛顿大学IACUC批准的协议#3242-02和#3393-03的最终程序后，收集Sprague-Dawley大鼠和Yucatan小型猪的动物牙齿。将人的牙齿储存在10％漂白剂中消毒24小时，用去离子水冲洗，然后储存在70％乙醇水溶液中备用。所有动物的牙齿都保存在70％的乙醇中备用。
釉质上的人工损伤首先是用含33％磷酸的UltraetchTM(Ultradent)蚀刻30s，然后用喷射的去离子水冲洗30s。再矿化始于提取蚀刻的制备样品，加入肽凝胶制剂覆盖受影响的釉质表面，并在37℃孵育10min。然后，在单独的区域，将等量的960mM CaCl2或576mMKH2PO4凝胶配方混合在一起，以确保溶液充分混合，从而发生矿化。孵育后，尽可能擦拭肽凝胶制剂，将等量的钙和磷酸铁凝胶制剂涂在受影响的牙齿表面。与混合的钙离子+PO4离子凝胶制剂一起在37℃孵育2小时。在培养结束时，将牙齿转移到含有模拟唾液的容器中，并在37C下培养21小时，直到下一轮再矿化。该过程重复7次。
矿物层通过扫描电子显微镜JEOL JSM 6010在10千伏的横截面上的成像进行表征。化学成分用机载EDXS系统测量。矿物层以及下面的牙齿组织的硬度和弹性模量使用附着在ParkAFM系统上的Hysitron TriboscopeTMNanoindentation系统进行测量。
配方特征
开发凝胶配方的用途是能够对受影响的牙齿表面进行局部治疗。这在临床环境和家庭护理治疗环境中都是理想的。粘度是对流动阻力的度量，因此，它是决定凝胶制剂局部化程度的一个重要参数。粘度是针对各种商业牙科产品如牙膏、口干凝胶、氟清漆(见图14)进行测量。凝胶配方的粘度与幼儿牙膏相当。该粘度足够高，以使显影凝胶制剂能够附着在牙齿表面。
对用33％磷酸凝胶UltraEtchTM蚀刻造成人工损伤的牙齿进行再矿化。在离体人牙齿上，在肽制剂处理10min后，加入钙/磷酸凝胶制剂反应2小时，生成了5μm厚的矿物质层，所有这些都在37℃孵育(图15a和b)。相比之下，那些仅用钙/磷凝胶配方处理的人，会产生裸露的蚀刻釉质表面，表明没有可测量到的再矿化发生(图15c和d)。类似地，相似的矿物层导致大鼠和猪的釉质(数据未显示)的产生。这些结果表明，当肽凝胶制剂与钙/磷酸盐凝胶制剂一起使用时，可以通过向牙齿表面添加矿物质层而导致再矿化。
机械性能
机械性能通过新矿物层和底层釉质横截面上的纳米压痕来测量。再矿化层的硬度是底层牙釉质的1/3，而弹性模量约为1/4。矿物层的硬度和弹性模量较低，表明凝胶配方中含有有机物。从矿物层向下层釉质过渡的硬度和弹性模量降低。
表12：硬度和弹性模量的数值
Figure BDA0002992179550000401
Figure BDA0002992179550000411
再矿化牙膏制剂
再矿化牙膏涉及到将活性成分、shADP5、钙离子和磷酸盐离子结合到特定配方的牙膏物质中，以获得足够高的粘度，使牙刷能够在牙齿表面铺展，而不会有过量的流失。牙齿表面矿化所需的时间为2min(见图21)。最终牙膏配方具有以下独特特征：
1.含有活性成分，shADP5，钙离子，磷酸盐离子。
2.牙膏配方中的非活性成分被设计成最少数量的成分，同时达到10-12Pa.s的粘度范围并提供风味。
3.牙膏配方使用基础凝胶配方，但粘度较高。无机颗粒作为增稠剂的一部分被限制/排除使用，从而不会干扰牙齿表面形成的新矿物层。
4.3种分别含有shADP5、钙离子和磷酸盐离子的单独牙膏储存在可挤压或泵送牙膏管中，作为横跨牙膏管长度的单独牙膏条，并由中性牙膏层(仅由非活性成分制成的牙膏)或作为扩散屏障的薄膜隔开。
5.氟化物离子可以加入含磷酸盐离子的凝胶作为第四种活性成分。
制备了三种不同的凝胶制剂，分别含有纯度>95％的shADP5肽、钙离子或离子PO4的水溶液。这三种物质在糊状制剂中具有相同的化学成分。具体成分列于表13。
表13：牙膏制剂的基础凝胶配方成分列表。
Figure BDA0002992179550000412
Figure BDA0002992179550000421
再矿化凝胶是从制备1.6mM的ADP5、960mM的CaCl2和575mM的K2HPO4开始，在24mM的Tirs-HCl缓冲液中，最终的pH值被调节到7.4。单独地，凝胶制剂混合物通过使用低速(50C)螺旋桨混合器混合山梨酸钾、丙二醇、甘油、60％山梨醇水溶液、二甲基硅油和纤维素胶来制备。混合物降回到室温后，通过使用低速螺旋桨混合器将1.6mMADP 5、960mM CaCl2或575mM K2HPO4的溶液与凝胶制剂混合物按照50-50混合，制成最终制剂。3种独立含有ADP5、钙离子和磷酸盐离子的糊剂存储在可挤压或泵送牙膏管中，作为横跨牙膏管长度的单独牙膏条，并由中性牙膏层(仅由非活性成分制成的牙膏)或作为扩散屏障的膜隔开。
制剂的粘度特性如图16所示。
对于所有制剂，氟化物离子可以作为第四种活性成分加入，并在1000ppm-5000ppm的范围内将氟化物离子与含K2HPO4的制剂混合。例如，表14列出了凝胶制剂的组成。
表14：氟化物作为第四种活性成分的凝胶配方。
Figure BDA0002992179550000422
Figure BDA0002992179550000431
shADP5能够将氟化物离子输送到牙齿表面。牙齿表面处理后，用PO4离子输送氟化物离子。如图17所示，通过能量色散X光光谱(EDXS)检测到矿物层中含有氟化物。参见图17。
分别储存在各自凝胶/清漆/牙膏配方中的活性成分对于防止过早的矿化反应非常重要。在所有的制剂中，首先输送肽，然后输送钙离子/磷酸盐或钙离子/磷酸盐/氟化物。了解反应时间有助于确定规定的治疗时间和程序。为了确定处理方案，设计了一个实验，其中将两滴含钙和磷酸盐的凝胶与肽凝胶混合，并彼此相邻地放置在载玻片上，足够靠近，使得在随后两滴扩散时，它们将在各自的边缘彼此接触。通过观察凝胶从透明(未反应)变为白色(反应)的部分，目测监测矿化反应。
以凝胶制剂为例，加入shADP5后，反应明显比没有shADP5时更广泛，如图18所示。此外，还记录了基于扩散定律的扩散常数，即图18所示的白带宽度随时间的变化。然后取这两个量的倒数，以便能够根据以下等式确定扩散常数:1/t＝D(1/x)，其中t是时间，x是反应矿物的宽度(在图18中显示为白色)，D是以mm/min为单位的扩散常数。图19所示为导出扩散常数的一个例子。
总之，扫描电镜分析表明，经过一轮锭剂处理后，在着色釉质表面形成约1-2μm厚的连续的有片状晶体的矿物层。矿物层的成功形成表明所开发的锭剂是在人工唾液中转移和实现肽导向再矿化的有效产品。作为增白产品，在下一步中，通过再矿化固有着色的人牙齿来测试锭剂的增白性能。锭剂处理使牙齿的白度提高了ΔE＝5.56。在下一步中，将锭剂的增白性能与商业产品进行比较。虽然锭剂显示出的美白效果与临床使用的美白凝胶(40％HP)一样有效，但它的效果是OTC美白条的3倍。商业产品化学腐蚀掉牙齿上的矿物质，形成粗糙的牙齿表面，然而美白含片增加了矿物质层，在牙齿表面形成更厚、更健康的釉质。本文所述的锭剂和其他产品提供了治疗(再矿化)和美容(增白)两种益处。锭剂的增白性能是对现有牙齿美白产品的改进。
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实施例2.牙齿过敏
牙齿过敏(Dental hypersensitivity(DH))是一种常见的口腔健康状况，影响着世界上大多数成年人。仅在美国，用于治疗过敏症、牙膏、临床牙膏和凝胶以及漱口水的费用总计约为100亿美元。尽管有大量的非处方药和临床产品，但治疗选择有限，过敏仍然是牙齿不适的主要原因，也是牙龈炎和牙齿脱落的根本原因。牙齿过敏是由于覆盖牙齿表面的保护性牙骨质或釉质脱矿导致牙本质暴露而引起的。当牙本质小管暴露时，牙髓或牙本质前体中的神经纤维受到液体位移的刺激，并引发疼痛。引发疼痛的刺激可以是热的、化学的或机械的。目前仍然没有有效的药物来完全解决患者对牙齿过敏的不适。非处方产品通常被建议用于治疗糖尿病肾病，而含锶、草酸盐或钾盐或氟化物的牙膏被建议用于降低糖尿病肾病的敏感性，但效果有限。使用复合材料、玻璃离子或汞合金的修复材料适用于治疗受影响的区域，但效果有限。
样品制备
从华盛顿大学牙科学院提取的人类臼齿很少或没有蛀牙或修复的证据。样品制备的目的是通过去除牙齿的釉质来暴露下面的牙本质小管，从而模拟牙齿过敏。一般样品制备过程如图6所示。拔出的牙齿被固定并使用伊玛特(Isomet)低速锯切割。为了在正确的方向上获得牙本质小管数量最多的样本，在牙釉质下方和牙髓腔上方切取离体牙，以获得牙本质颈部的圆柱形盘。然后对样品进行抛光，以使表面具有尽可能多的暴露的小管。抛光后，对样品进行超声波处理，以去除残留在表面的所有碎片。目标是用新的矿物层优化牙本质小管的闭塞和穿透，牙本质小管在再矿化样品中的取向极其重要。为了观察样品的横截面以观察矿物在细管中的渗透，细管需要垂直于表面或尽可能靠近表面。因此，如图7所示，在再矿化之前，对制备样品的牙本质表面进行光学显微镜检查，以确保小管正确排列。图3中小管的圆形度和相对高的密度表明小管排列整齐。光学显微镜检查是用Olympus BX50实验室显微镜和SC30数码相机进行的。
肽导向的再矿化过程
样品制备后，样品进行肽导向再矿化过程。用于牙齿过敏治疗的肽是sADP5，或简称为釉原蛋白衍生肽5。将样品置于24mM Tris缓冲溶液中，以4,000转/分钟的速度离心5分钟，以使样品水合。然后在37℃下，将样品在0.75mL肽溶液中孵育15分钟，所述肽溶液为将0.80mM肽溶于24mM Tris缓冲溶液中。接下来，将样品放入含有等量24mM Tris缓冲溶液、9.6mM Ca2+溶液和5.76mM PO4 3-溶液的溶液中，在37℃下孵育2小时。肽导向再矿化处理的示意图如图8所示。然后用去离子水冲洗样品，以去除溶液中形成的沉积矿物。所述过程构成1轮肽引导的再矿化治疗。为了观察连续处理后的矿物层，对样品进行多轮再矿化处理。除了没有再矿化的对照样品外，对样品进行1、2和3轮肽指导的再矿化过程。
SEM表征
在肽引导的再矿化处理后，制备样品用于扫描电子显微镜(SEM)表征，以观察新形成的矿物层的形态和厚度。由于需要横截面图像，在样品制备期间和再矿化过程之前，使用Isomet低速锯在样品背面放置缺口。再矿化处理后，用去离子水冲洗样品，并在干燥器中干燥过夜，以去除任何水分。然后，样品被小心地沿着切口分成两个独立的部分。然后将一片安装在薄的铝扫描电镜短柱上，其横截面平行于短柱的边缘。然后将样品涂上5纳米厚的金层，以便通过扫描电镜成像。使用可调节的扫描电镜支架，以便观察再矿化样品的顶面和横截面。使用JEOL 6010扫描电镜进行扫描电镜表征。
热循环
为了确保牙本质表面新形成的矿物层的热耐久性，对再矿化样品进行了热循环试验。示例热循环过程如图9所示。在三轮肽导向再矿化后，将样品置于含有人工唾液溶液的小瓶中，该溶液由130mM KCl、20mM HEPES、1.5mM CaCl2、0.9mM KH2PO4和1mM NaCl组成。为了模拟自然口腔环境中的温度变化，再矿化样品在5℃和50℃之间循环，在每个温度下保持30秒。在200次循环(6天)和2500次循环(90天)后，对矿物层进行扫描电镜成像，以比较不同时间段的热循环效果。
pH循环
为了证实牙本质表面新形成的矿物层的化学耐久性，对再矿化样品进行了酸碱度循环试验。酸碱度循环过程如图10所示。在三轮肽引导的再矿化后，将样品置于去矿化溶液中6小时，如图10所示，溶液的酸碱度为4.6，以模拟自然口腔环境中出现的酸度。然后，样品经历另一轮再矿化，在图10中标记为“处理”。然后将样品置于pH 7的再矿化溶液中18小时，以模拟中性口腔环境。如图6所示，循环持续3-7天，此时样品准备进行扫描电镜成像。
结果和讨论
牙本质小管的阻塞
样品经肽导向再矿化处理后，通过扫描电镜对新形成的矿物层进行表征。图11显示了0-3轮再矿化过程中矿物质厚度和小管阻塞水平的对比图。黄色箭头表示小管的定性宽度和矿物层的厚度。图11a显示了没有再矿化的制备样品的横截面，可以看到牙质的裸露表面和小管的内壁。1轮再矿化后(图11b)，可见牙本质表面已形成一层矿物质，矿物质也已渗入小管。看到的片状特征是新生长的矿物。随着循环次数的增加，表面矿物层的厚度和渗透到小管中的矿物量也增加，通过比较图11a和11d可以看出，图11a和11d显示了3轮再矿化。图11d中的小管似乎也被完全封闭，因为矿物质覆盖了牙本质表面的小管开口。另一个要观察的方面是现有牙本质和新矿物之间的界面，通过扫描电镜显示为内聚和相容的，模拟了釉质和牙本质之间的自然界面。这些结果表明，肽引导的再矿化治疗确实在牙本质表面形成了新的矿物质层，并通过矿物质渗透封闭了小管。
热循环
图12显示了经过上述热循环过程的3个圆形再矿化样品的前后扫描电镜图像。黄色箭头表示牙本质表面的矿物层。图12a显示了3个圆形再矿化样品的横截面，其中没有发生热循环，而图12b显示了相同样品经过2500个循环(90天)后的情况。类似地，图12c显示了热循环前牙本质表面上的矿物层的俯视图，而图12d显示了相同样品经过2500次循环后的情况。图12e和12f分别显示了没有再矿化的制备样品的横截面和俯视图，以供参考。通过查看图像，可以看出矿物层在热循环90天后仍然存在，因此在牙本质表面上的矿物层是热稳定的。这加强了矿物层与牙本质表面的内聚界面的观点，并表明肽引导的再矿化是一种耐热持久的处理方式。虽然矿物是热稳定的，但可以观察到矿物的形态似乎略有变化，矿物的密度增加。需要进行进一步的研究来找到这些变化的原因。
结论
本实施例提供了肽引导的再矿化处理方法，以在基质表面形成新的矿物质层，并成功地用矿物质渗透堵塞牙本质小管。在90天的热循环处理后，再矿化层也显示出热稳定性。由肽引导的再矿化过程形成的矿物质是目前解决过敏症的可行且天然的替代物，并且可以提供与现有牙齿结构的持久、相容且内聚的界面。为了进一步确保新形成的矿物层的耐久性，已经进行了表征以评估其机械和化学稳定性。为此，可以对再矿化的牙本质表面进行纳米力学表征测试和pH值循环，以及对具有理想小管取向的样品制备进行分析，以识别热循环后的矿物形态变化。
实施例2的参考文献
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Leu Lys Lys Ile
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Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr
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Claims (102)

1.一种组合物或试剂盒，包括
(a)第一制剂，所述第一制剂包含有效剂量的用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的多肽，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)一种或多种其他制剂(further formulation)，所述其他制剂包含至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源；
其中所述第一制剂被配置成比Ca2+从所述至少一种钙离子源中释放以及PO4 3-从所述至少一种磷酸盐离子源中释放更快地释放多肽。
2.根据权利要求1所述的组合物或试剂盒，其中与一种或多种其他制剂相比，所述第一制剂具有更低的粘度。
3.根据权利要求1或2所述的组合物或试剂盒，其中与一种或多种其他制剂相比，所述第一制剂被调节以改变水溶性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物或试剂盒，其中钙离子源选自醋酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、氯化钙、葡萄糖酸钙、甘油磷酸钙、乳酸钙和磷酸钙。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物或试剂盒，其中磷酸盐离子源选自磷酸铝、磷酸钙、磷酸钾和磷酸钠。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述一种或多种其他制剂包含所述至少一种钙离子源，其浓度范围为约1mM至约10M、1mM至约5M、1mM至约2 M、约1mM至约1M、约1mM至约0.5M、约1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约1mM至约10mM、约2mM至约8mM、约3mM至约7mM、约4mM至约6mM、或约4.5mM至约5.5mM。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述一种或多种其他制剂包含所述至少一种磷酸盐离子源，其浓度范围为约1mM至约10M、1mM至约5M、1mM至约2M、约1mM至约1M、约1mM至约0.5M、约1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约1mM至约10mM、约1mM至约7mM、或约1mM至约6mM、约1.5mM至约5mM、约2mM至约4mM、或约2.5mM至约3.5mM。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中至少一种钙离子源与至少一种磷酸盐离子源的摩尔比约为5:3。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中多肽与所述至少一种钙离子源和至少一种磷酸盐离子源的组合的摩尔比为约1:2至约1:100。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第一制剂和所述第二制剂以锭剂或胶剂的形式存在。
11.根据权利要求10所述的组合物或试剂盒，其中锭剂或胶剂包含：
(i)包含第二制剂的核心区；和
(ii)包含第一制剂的壳区。
12.根据权利要求10或11所述的组合物或试剂盒，其中所述第二制剂包含：
(A)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-65％、45％-60％、50％-60％、52％-58％、53％-57％、54％-56％、或约54％-55％w/w的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；和
(B)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、15％-50％、20％-40％、25％-35％、27％-33％、28％-32％、29％-31％、或约29.5％-30.5％w/w的钾离子源，包括但不限于KH2PO4。
13.根据权利要求12所述的组合物或试剂盒，其中所述第二制剂进一步包含一种或多种润滑剂、调味剂和/或赋形剂。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的组合物或试剂盒，其中第二制剂包含：
0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-65％、45％-60％、50％-60％、52％-58％、53％-57％、54％-56％、或约54％-55％w/w的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；和
0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、15％-50％、20％-40％、25％-35％、27％-33％、28％-32％、29％-31％、或约29.5％-30.5％w/w的钾离子源，包括但不限于KH2PO4；和
1％-10％w/w的润滑剂。
15.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第一制剂包含0.1％-10％、0.5％-7.5％、1％-6％、1.5％-5％、2％-4％、或约2.5％-约3.5％w/w的多肽。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物或试剂盒，其中第一制剂进一步包含一种或多种润滑剂、调味剂和/或填充剂。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第一制剂包含：
0.1％-10％、0.5％-7.5％、1％-6％、1.5％-5％、2％-4％、或约2.5％-约3.5％w/w的多肽；
1％-10％w/w的润滑剂；和
50％至90％w/w的填料。
18.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第二制剂是水性制剂，并且其中所述第一制剂是水性制剂。
19.一种组合物或试剂盒，包含至少第一制剂(at least first formulation)，所述至少第一制剂包含：
(a)用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的有效剂量的多肽，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQ
QPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源，其中至少一种钙离子源和至少一种磷酸盐离子源被包封；
其中所述第一制剂被配置成以比Ca2+和PO4 3-更快的速率释放多肽。
20.根据权利要求19所述的组合物或试剂盒，其中所述至少第一制剂包含第一制剂和第二制剂，其中
(i)所述第一制剂包含多肽和至少一种钙离子源或至少一种磷酸盐离子源中的一种；和
(ii)所述第一制剂包含多肽和至少一种钙离子源或至少一种磷酸盐离子源中的一种；
其中如果第一制剂包含至少一种钙离子源，则第二制剂包含至少一种磷酸盐离子源；如果第一制剂包含至少一种磷酸盐离子源，则第二制剂包含至少一种钙离子源。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述至少一种钙离子源和所述至少一种磷酸盐离子源被包封在磷脂囊泡中。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述磷脂囊泡包含直径为约100nm至约10μm的聚二乙炔-磷脂囊泡。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第一制剂或第二制剂包含：
(A)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、20％-80％、30-80％、40％-80％、45％-80％、50％-80％、60％-78％、65％-75％、或约67.5％-72.5％w/w的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；和/或
(B)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、15％-50％、20％-40％、25％-35％、27％-33％、28％-32％、29％-31％、或约29.5％-30.5％w/w的钾离子源，包括但不限于KH2PO4。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第一制剂和/或第二制剂进一步包含一种或多种防腐剂、调味剂和/或抗微生物剂。
25.根据权利要求16-22中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述多肽以约100ng/ml至约100mg/ml、1mg/ml至约100mg/ml、约10mg/ml至约90mg/ml、约20mg/ml至约80mg/ml、约30mg/ml至约70mg/ml、约35mg/ml至约65mg/ml、约35mg/ml至约60mg/ml、或约40mg/ml至约50mg/ml的浓度存在于所述第一制剂和/或第二制剂中。
26.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第一制剂作为第一胶黏剂层存在，并且所述第二制剂作为第二胶黏剂层存在，其中所述第二胶黏剂层直接或间接的粘附到所述第一胶黏剂层。
27.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述一种或多种其他制剂包含第二制剂和第三制剂，其中所述第二制剂包含所述一种或多种钙离子源，并且所述第三制剂包含所述一种或多种磷酸盐离子源，其中所述第一制剂作为第一胶黏剂层存在，所述第二制剂作为第二胶黏剂层存在，并且第三制剂作为第三胶黏剂层存在，其中第二胶黏剂层和第三胶黏剂层直接或间接的粘附到第一胶黏剂层。
28.根据权利要求26或27所述的组合物或试剂盒，其中当第一胶黏剂层、第二胶黏剂层和第三胶黏剂层存在时，其厚度各自独立的为50μm至500μm。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第一胶黏剂层包含缓冲液中0.1％-60％、1％-58％、10％-55％、20％-52％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-约42.5％w/v的多肽。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第二胶黏剂层包缓冲液中含10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；以及缓冲液中10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钾离子源，包括但不限于KH2PO4；或者
其中所述第二胶黏剂层在缓冲液中包含10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钙离子源。
31.根据权利要求26-29中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第二胶黏剂层包含缓冲液中10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；并且其中所述第三胶黏剂层包含缓冲液中10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钾离子源，包括但不限于KH2PO4。
32.根据权利要求26-31中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第一胶黏剂层、第二胶黏剂层和/或第三胶黏剂层进一步包括增稠剂、表面活性剂、调味剂、纤维素或纤维素衍生物和/或防腐剂。
33.根据权利要求26-31中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第一胶黏剂层、第二胶黏剂层和/或第三胶黏剂层进一步包括:
0.1％-30％w/v的增稠剂，包括但不限于丙二醇(PPG)、树脂和/或甘油；
1％-30％w/v的纤维素或纤维素衍生物，包括但不限于羧甲基纤维素钠、纤维素、甲基醚、甲基化纤维素、甲基纤维素、E461(食品添加剂中的名称编号)；纤维素替代品的其他变体：羟丙基纤维素；和
0.1％至5％的表面活性剂。
34.根据权利要求26-33中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第二胶黏剂层和/或第三胶黏剂层的厚度大于所述第一胶黏剂层的厚度，包括但不限于当所述第三胶黏剂层不存在时，所述第二胶黏剂层和所述第一胶黏剂层之间的厚度比约为2:1，或者当所述第三胶黏剂层存在时，所述第二胶黏剂层+第三胶黏剂层和所述第一胶黏剂层之间的厚度比约为2:1；并且其中第一、第二和第三胶黏剂层和任何中间层的总厚度约为0.05mm。
35.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第一制剂包含缓冲液中10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的多肽。
36.根据权利要求35所述的组合物或试剂盒，其中所述一种或多种其他制剂包括第二制剂和第三制剂，其中:
第二制剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种钙离子源，包括但不限于CaCl2；和
第三制剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种磷酸盐离子源，包括但不限于K2HPO4。
37.根据权利要求36所述的组合物或试剂盒，其中所述第一制剂、第二制剂和第三制剂进一步包含防腐剂、增稠剂、调味剂和/或表面活性剂。
38.根据权利要求36所述的组合物或试剂盒，其中所述第一制剂、第二制剂和第三制剂进一步包含：
5％-50％w/v的增稠剂，包括但不限于聚丙二醇(PPG)、甘油、羧甲基纤维素钠和/或树脂；和/或
0.1％-5％的表面活性剂。
39.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述一种或多种其他制剂包括第二制剂和第三制剂，其中所述第一、第二和第三制剂是第一、第二和第三糊剂，并且各自被分离糊剂分开，其中：
第一糊剂包含缓冲液中10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％，或约47.5％至约52.5％w/v的多肽；
第二糊剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种钙离子源，包括但不限于CaCl2；和
第三糊剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种磷酸盐离子源，包括但不限于K2HPO4；并且其中第一糊剂的粘度小于第二糊剂和第三糊剂的粘度。
40.根据权利要求39所述的组合物或试剂盒，其中第一糊剂、第二糊剂和第三糊剂包含增稠剂，所述增稠剂包括但不限于聚丙二醇(PPG)、甘油和/或羧甲基纤维素钠。
41.根据权利要求40所述的组合物或试剂盒，其中所述第一糊剂、第二糊剂和第三糊剂包含丙二醇(PPG)、甘油和羧甲基纤维素钠(SCS)，其中第一糊剂包含比第二糊剂和第三糊剂更高浓度的PPG，并且其中第一糊剂包含比第二糊剂或第三糊剂更低浓度的SCS。
42.根据权利要求40或41所述的组合物，其中所述第一糊剂中的PPG与所述第二糊剂和第三糊剂中的PPG比例约为5:3，和/或其中所述第一糊剂中的SCS与所述第二糊剂和第三糊剂中的SCS比例约为2:3。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述多肽包含选自下述的氨基酸序列或由下述的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)，或其功能等同物；
(PGYINFSYENSHSQAINVDRTA)1-10(SEQ ID NO:6)(ADP5H)，或其功能等同物；和
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)，或其功能等同物；
或者它们的组合。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述多肽包含选自下述的氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成：
(HTLQPHHH(L/I)PVV)1-10(ADP1；SEQ ID NO:1)；
(VPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP2；SEQ ID NO:4)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVV)1-10(ADP4；SEQ ID NO:10)；
(PAQQPV(A/I)PQQPMMP)1-10(ADP8；SEQ ID NO:21)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；
HTLQPHHHLPVV)1-10(ADP1M；SEQ ID NO:2)；
(HTLQPHHHIPVV)1-10(ADP1H；SEQ ID NO:3)；
(VPGHHSMTPTQH)1-10(ADP2M；SEQ ID NO:5)；
(VPGQHSMTPIQH)1-10(ADP2H；SEQ ID NO:14)；
(HPPSHTLQPHHHLPVV)1-10(ADP4M；SEQ ID NO:11)；
(HPPTHTLQPHHHIPVV)1-10(ADP4H；SEQ ID NO:12)；
(HPPSHTLQPHHHLPVVPAQQPVAPQQPMMPVPGHHSMTPTQH)1-10(ADP7M；SEQ ID NO:19)；
(HPPTHTLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQH)1-10(ADP7H；SEQ ID NO:20)；
(PAQQPVAPQQPMMP)1-10(ADP8M；SEQ ID NO:22)；和
(PAQQPVIPQQPMMP)1-10(ADP8H；SEQ ID NO:23)；
(WPATDKTKREEVD)1-10(ADP3M；SEQ ID NO:8)；
(WPSTDKTKREEVD)1-10(ADP3H；SEQ ID NO:9),
MLPHHGA(HABP1；SEQ ID NO:25)；和
NPGFAQA(HABP2；SEQ ID NO:26)；
或其功能等同物及其组合。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述多肽以单一拷贝存在。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述多肽与抗微生物肽相连。
47.根据权利要求46的组合物或试剂盒，其中抗微生物肽选自：
KWKRWWWWR(SEQ ID NO:27)；
LKLLKKLLKLLKKL(SEQ ID NO:28)；
CPFVC(SEQ ID NO:279；
RRXXRF(SEQ ID NO:30)；
ALLHHGLNCAKGVLA(SEQ ID NO:31)；
LWKTLLKKVLKAAA(SEQ ID NO:32)；
GLRKRKRKFRNKKKEKLKKI(SEQ ID NO:33)；和
RKRIHIGPGRAFYTT(SEQ ID NO:34)。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的组合物或试剂盒，其中所述第一制剂和/或一种或多种其他制剂进一步包含氟化物。
49.根据权利要求48所述的组合物或试剂盒，其中所述氟化物在所述第一制剂和/或所述一种或多种其他制剂中以约50ppm至约20,000ppm、约50ppm至约10,000ppm、约50ppm至约5000ppm、约50ppm至约1000ppm、约50ppm至约500ppm、或约75ppm至约400ppm、约100ppm至约300ppm、约150ppm至约250ppm、或约200ppm的量存在。
50.一种用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保持牙齿结构和/或修复由于脱矿质作用导致的牙齿矿物质损失的方法，包括对有需要的受试者口服给药：
(a)包含有效量的多肽的第一制剂，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成，所述有效量的多肽用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的矿物质含量：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)一种或多种其他制剂，所述其他制剂包含至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源；
其中所述第一制剂被施用给所述受试者，使得在从所述至少一种钙离子源释放Ca2+和从所述至少一种磷酸盐离子源释放PO4 3-之前，所述多肽可接触到所述受试者的一颗或多颗牙齿。
51.根据权利要求50所述的方法，其中与一种或多种其他制剂相比，所述第一制剂具有更低的粘度。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中与一种或多种其他制剂相比，所述第一制剂被调节以改变水溶性。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述钙离子源选自醋酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、氯化钙、葡萄糖酸钙、甘油磷酸钙、乳酸钙和磷酸钙。
54.根据权利要求50-53中任一项所述的方法，其中所述磷酸盐离子源选自磷酸铝、磷酸钙、磷酸钾和磷酸钠。
55.根据权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述一种或多种其他制剂包含所述至少一种钙离子源，其浓度范围约为1mM至约10M、1mM至约5M、1mM至约2M、约1mM至约1M、约1mM至约0.5M、约1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约1mM至约10mM、约2mM至约8mM、约3mM至约7mM、约4mM至约6mM、或约4.5mM至约5.5mM。
56.根据权利要求50-55中任一项所述的方法，其中所述一种或多种其他制剂包含所述至少一种磷酸盐离子源，其浓度范围约为1mM至约10M、1mM至约5M、1mM至约2M、约1mM至约1M、约1mM至约0.5M、约1mM至约100mM、约1mM至约50mM、约1mM至约10mM、约1mM至约7mM、或约1mM至约6mM、约1.5mM至约5mM、约2mM至约4mM、或约2.5mM至约3.5mM。
57.根据权利要求50-57中任一项所述的方法，其中至少一种钙离子源与至少一种磷酸盐离子源的摩尔比约为5:3。
58.根据权利要求50-57中任一项所述的方法，其中多肽与至少一种钙离子源和至少一种磷酸盐离子源的组合的摩尔比约为1:2至约1:100。
59.根据权利要求50-58中任一项所述的方法，其中所述一种或多种其他制剂包含第二制剂，其中所述第一制剂和所述第二制剂以锭剂或胶剂的形式存在，其中所述多肽从所述第一制剂中释放的速度快于Ca2+和PO4 3-从所述第二制剂中释放的速度。
60.根据权利要求59的方法，其中锭剂或胶剂包括:
(i)包含第二制剂的核心区；和
(ii)包含第一制剂的壳区。
61.根据权利要求59或60的方法，其中第二制剂包括：
(A)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-65％、45％-60％、50％-60％、52％-58％、53％-57％、54％-56％、或约54％-55％w/w的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；和
(B)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、15％-50％、20％-40％、25％-35％、27％-33％、28％-32％、29％-31％、或约29.5％-30.5％w/w的钾离子源，包括但不限于KH2PO4。
62.根据权利要求61的方法，其中第二制剂进一步包含一种或多种润滑剂、调味剂和/或赋形剂。
63.根据权利要求59-62中任一项所述的方法，其中第二制剂包括：
0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-65％、45％-60％、50％-60％、52％-58％、53％-57％、54％-56％、或约54％-55％w/w的CaCl2·H2O；
0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、15％-50％、20％-40％、25％-35％、27％-33％、28％-32％、29％-31％、或约29.5％-30.5％w/w的KH2PO4；和
1％-10％w/w润滑剂。
64.根据权利要求50-63中任一项所述的方法，其中所述第一制剂包含0.1％-10％、0.5％-7.5％、1％-6％、1.5％-5％、2％-4％、或约2.5％-约3.5％w/w的多肽。
65.根据权利要求50-64中任一项所述的方法，其中第一制剂进一步包含一种或多种润滑剂、调味剂和/或填充剂。
66.根据权利要求50-65中任一项所述的方法，其中所述第一制剂包含：
0.1％-10％、0.5％-7.5％、1％-6％、1.5％-5％、2％-4％、或约2.5％-约3.5％w/w的多肽
1％-10％w/w的润滑剂；和
50％至90％的填料。
67.根据权利要求50-66中任一项所述的方法，其中所述一种或多种其他制剂包括第二制剂，其中所述第二制剂是水性制剂，其中所述第一制剂是作为漱口水给药的水性制剂，随后所述第二制剂也作为漱口水给药。
68.一种用于治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保持牙齿结构、和/或修复由于脱矿导致的牙齿矿物质损失的方法，包括向有此需要的受试者口服施用至少第一制剂，该制剂包含：
(a)治疗牙齿疾病、美白牙齿、修复和保留牙齿结构、和/或修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失的有效量的多肽，所述多肽包含选自下组的氨基酸序列或由下组的氨基酸序列组成：
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)；
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)
(WP(A/S)TDKTKREEVD)1-10(ADP3；SEQ ID NO:7)；
(PGYIN(L/F)SYE(K/N)SHSQAIN(T/V)DRTA)1-10(ADP5；SEQ ID NO:13)；
(LPPLFSMPLSPILPELPLEAWPAT)1-10(ADP6；SEQ ID NO:17)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；和
12-42个连续的氨基酸(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQ QPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)，或功能等同物及其组合；和
(b)至少一种钙离子源和/或至少一种磷酸盐离子源，其中所述至少一种钙离子源和至少一种磷酸盐离子源被包封；
其中多肽以比Ca2+和PO4 3-更快的速率释放，并且多肽在Ca2+和PO4 3-之前可接触到受试者的一颗或多颗牙齿。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述至少第一制剂包含第一制剂和第二制剂，其中：
(i)第一制剂包含多肽和至少一种钙离子源或至少一种磷酸盐离子源中的一种；和
(ii)第一制剂包含多肽和至少一种钙离子源或至少一种磷酸盐离子源中的一种；
其中如果第一制剂包含至少一种钙离子源，则第二制剂包含至少一种磷酸根离子源，如果第一制剂包含至少一种磷酸根离子源，则第二制剂包含至少一种钙离子源。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中所述至少一种钙离子源和所述至少一种磷酸盐离子源被包封在磷脂囊泡中。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述磷脂囊泡包括直径在约100nm至10μm之间的聚二乙炔-磷脂囊泡。
72.根据权利要求67-71中任一项所述的方法，其中所述第一制剂或第二制剂包括：
(A)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、20％-80％、30-80％、40％-80％、45％-80％、50％-80％、60％-78％、65％-75％、或约67.5％-72.5％w/w的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；和/或
(B)0.1％-80％、0.5％-80％、1％-80％、5％-80％、10％-80％、10％-60％、15％-50％、20％-40％、25％-35％、27％-33％、28％-32％、29％-31％、或约29.5％-30.5％w/w的钾离子源，包括但不限于KH2PO4。
73.根据权利要求67-72中任一项所述的方法，其中所述第一制剂和/或第二制剂进一步包含一种或多种防腐剂、调味剂和/或抗微生物剂。
74.根据权利要求67-73中任一项所述的方法，其中所述多肽以约100ng/ml至约100mg/ml、约1mg/ml至约100mg/ml、约10mg/ml至约90mg/ml、约20mg/ml至约80mg/ml、约30mg/ml至约70mg/ml、约35mg/ml至约65mg/ml、约35mg/ml至约60mg/ml、约40mg/ml至约50mg/ml的浓度存在于第一制剂和/或第二制剂中。
75.根据权利要求50-58中任一项所述的方法，其中所述一种或多种其他制剂包括第二制剂，其中所述第一制剂以第一胶黏剂层的形式存在，并且所述第二制剂以第二胶黏剂层的形式存在，其中所述第一胶黏剂层粘附到所述受试者的一个或多个牙齿上，并且所述第二胶黏剂层粘附到所述受试者的一个或多个牙齿上，或者所述第二胶黏剂层直接或间接粘附到所述第一胶黏剂层上。
76.根据权利要求50-58中任一项所述的方法，其中所述一种或多种其他制剂包含第二制剂和第三制剂，其中所述第二制剂包含所述一种或多种钙离子源，并且所述第三制剂包含所述一种或多种磷酸盐离子源，其中所述第一制剂作为第一胶黏剂层存在，所述第二制剂作为第二胶黏剂层存在，并且第三制剂以第三胶黏剂层的形式存在，其中第一胶黏剂层粘附到受试者的一个或多个牙齿上，第二胶黏剂层和第三胶黏剂层粘附到受试者的一个或多个牙齿上，或者第二胶黏剂层和第三胶黏剂层直接或间接粘附到第一胶黏剂层上。
77.根据权利要求75或76所述的方法，其中当所述第一胶黏剂层、所述第二胶黏剂层和所述第三胶黏剂层存在时，其厚度各自独立地在50μm和500μm之间。
78.根据权利要求75-77中任一项所述的方法，其中所述第一胶黏剂层包含缓冲液中0.1％-60％、1％-58％、10％-55％、20％-52％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-约42.5％w/v的多肽。
79.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述第二胶黏剂层包含缓冲液中10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；以及缓冲液中10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钾离子源，包括但不限于KH2PO4；或者
其中所述第二胶黏剂层在缓冲液中包含10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钙离子源。
80.根据权利要求75-78中任一项所述的方法，其中所述第二胶黏剂层包含缓冲液中10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钙离子源，包括但不限于CaCl2·H2O；并且其中所述第三胶黏剂层包含缓冲液中10％-80％、20％-70％、25％-60％、30％-50％、35％-45％、或约37.5％-42.5％w/v的钾离子源，包括但不限于KH2PO4。
81.根据权利要求75-80中任一项所述的方法，其中所述第一胶黏剂层、第二胶黏剂层和/或第三胶黏剂层进一步包括增稠剂、表面活性剂、调味剂、纤维素或纤维素衍生物和/或防腐剂。
82.根据权利要求75-80中任一项所述的方法，其中所述第一胶黏剂层、第二胶黏剂层和/或第三胶黏剂层进一步包括：
0.1％-30％w/v的增稠剂，包括但不限于丙二醇(PPG)、树脂和/或甘油；
1％-30％w/v的纤维素或纤维素衍生物，包括但不限于羧甲基纤维素钠、纤维素、甲基醚、甲基化纤维素、甲基纤维素、E461(食品添加剂中的名称编号)；纤维素替代品的其他变体：羟丙基纤维素；和/或
0.1％至5％的表面活性剂。
83.根据权利要求75-82中任一项所述的方法，其中所述第二胶黏剂层和/或第三胶黏剂层的厚度大于所述第一胶黏剂层的厚度，包括但不限于当所述第三胶黏剂层不存在时，所述第二胶黏剂层和所述第一胶黏剂层之间的厚度比约为2:1，或者当所述第三胶黏剂层存在时，所述第二胶黏剂层+第三胶黏剂层和所述第一胶黏剂层之间的厚度比约为2:1；并且其中第一、第二和第三胶黏剂层和任何中间层的总厚度约为0.05mm。
84.根据权利要求50-58中任一项所述的方法，其中所述第一制剂包含缓冲液中10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的多肽。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述一种或多种其他制剂包括第二制剂和第三制剂，其中：
第二制剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种钙离子源，包括但不限于CaCl2；和
第三制剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种磷酸盐离子源，包括但不限于K2HPO4。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述第一制剂、第二制剂和第三制剂进一步包含防腐剂、增稠剂、调味剂和/或表面活性剂。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述第一制剂、第二制剂和第三制剂进一步包括：
5％-50％w/v的增稠剂，包括但不限于聚丙二醇(PPG)、甘油、羧甲基纤维素钠和/或树脂；
0.1％-5％的表面活性剂。
88.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种其他制剂包括第二制剂和第三制剂，其中所述第一、第二和第三制剂是第一、第二和第三糊剂，并且其各自被分离糊剂分开，其中：
第一糊剂包含缓冲液中10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的多肽；
第二糊剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种钙离子源，包括但不限于CaCl2；和
第三糊剂包含10％-80％、20％-75％、30％-70％、40％-60％、45％-55％、或约47.5％至约52.5％w/v的至少一种磷酸盐离子源，包括但不限于K2HPO4；并且其中第一糊剂的粘度小于第二糊剂和第三糊剂的粘度。
89.根据权利要求88的方法，其中所述第一糊剂、第二糊剂和第三糊剂包含增稠剂，所述增稠剂包括但不限于聚丙二醇(PPG)、甘油和/或羧甲基纤维素钠。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述第一糊剂、所述第二糊剂和所述第三糊剂包含丙二醇(PPG)、甘油和羧甲基纤维素钠(SCS)，其中所述第一糊剂包含比所述第二糊剂和所述第三糊剂更高浓度的PPG，并且其中所述第一糊剂包含比所述第二糊剂或所述第三糊剂更低浓度的SCS。
91.根据权利要求89或90所述的方法，其中所述第一糊剂中的PPG与所述第二糊剂和所述第三糊剂的PPG的比率约为5:3，和/或其中所述第一糊剂中的SCS与所述第二糊剂和所述第三糊剂的SCS的比率约为2:3。
92.根据权利要求50-91中任一项所述的方法，其中所述多肽包含选自下述的氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成:
(SYENSHSQAINVDRT)1-10(shADP5；SEQ ID NO:16)，或其功能等同物；
(PGYINFSYENSHSQAINVDRTA)1-10(SEQ ID NO:6)(ADP5H)，或其功能等同物；和
(SYEKSHSQAINTDRT)1-10(sADP5；SEQ ID NO:24)，或其功能等同物；
或者它们的组合。
93.根据权利要求50-92中任一项所述的方法，其中所述多肽包含选自下述的氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成:
(HTLQPHHH(L/I)PVV)1-10(ADP1；SEQ ID NO:1)；
(VPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP2；SEQ ID NO:4)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVV)1-10(ADP4；SEQ ID NO:10)；
(PAQQPV(A/I)PQQPMMP)1-10(ADP8；SEQ ID NO:21)；
(HPP(S/T)HTLQPHHH(L/I)PVVPAQQPV(A/I)PQQPMMPVPG(H/Q)HSMTP(T/I)QH)1-10(ADP7；SEQ ID NO:18)；
HTLQPHHHLPVV)1-10(ADP1M；SEQ ID NO:2)；
(HTLQPHHHIPVV)1-10(ADP1H；SEQ ID NO:3)；
(VPGHHSMTPTQH)1-10(ADP2M；SEQ ID NO:5)；
(VPGQHSMTPIQH)1-10(ADP2H；SEQ ID NO:14)；
(HPPSHTLQPHHHLPVV)1-10(ADP4M；SEQ ID NO:11)；
(HPPTHTLQPHHHIPVV)1-10(ADP4H；SEQ ID NO:12)；
(HPPSHTLQPHHHLPVVPAQQPVAPQQPMMPVPGHHSMTPTQH)1-10(ADP7M；SEQ ID NO:19)；
(HPPTHTLQPHHHIPVVPAQQPVIPQQPMMPVPGQHSMTPIQH)1-10(ADP7H；SEQ ID NO:20)；
(PAQQPVAPQQPMMP)1-10(ADP8M；SEQ ID NO:22)；和
(PAQQPVIPQQPMMP)1-10(ADP8H；SEQ ID NO:23)；
(WPATDKTKREEVD)1-10(ADP3M；SEQ ID NO:8)；
(WPSTDKTKREEVD)1-10(ADP3H；SEQ ID NO:9),
MLPHHGA(HABP1；SEQ ID NO:25)；和
NPGFAQA(HABP2；SEQ ID NO:26)；
或其功能等同物及其组合。
94.根据权利要求50-93中任一项所述的方法，其中所述多肽以单一拷贝存在。
95.根据权利要求50-94中任一项所述的方法，其中多肽与抗微生物肽相连。
96.根据权利要求95的方法，其中抗微生物肽选自：
KWKRWWWWR(SEQ ID NO:27)；
LKLLKKLLKLLKKL(SEQ ID NO:27)；
CPFVC(SEQ ID NO:28)；
RRXXRF(SEQ ID NO:39)；
ALLHHGLNCAKGVLA(SEQ ID NO:30)；
LWKTLLKKVLKAAA(SEQ ID NO:31)；
GLRKRKRKFRNKKKEKLKKI(SEQ ID NO:32)；和
RKRIHIGPGRAFYTT(SEQ ID NO:33)。
97.根据权利要求50-96中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括给所述受试者施用氟化物。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述氟化物以约50ppm至约20,000ppm、约50ppm至约10,000ppm、约50ppm至约5000ppm、约50ppm至约1000ppm、约50ppm至约500ppm、或约75ppm至约400ppm、约100ppm至约300ppm、约150ppm至约250ppm、或约200ppm的量存在于所述制剂中。
99.根据权利要求50-98中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自牙周炎、牙齿酸蚀、过敏症、菌斑、氟斑牙、蛀牙、龋齿、牙内吸收、颅颌面部骨病、牙龈萎缩和/或一颗或多颗牙齿的釉质脱矿的牙科疾病。
100.根据权利要求50-98中任一项所述的方法，所述方法用于修复和保持牙齿结构，修复由于脱矿导致的牙齿矿物质损失，或用于化妆品目的的牙齿美白。
101.根据权利要求50-100中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物，包括但不限于人类。
102.根据权利要求1-49中任一项所述的组合物在修复和保持牙齿结构、修复由于脱矿引起的牙齿矿物质损失或用于化妆品目的美白牙齿中的应用。
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