CN112746048B - 一种液体菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵领域，特别是涉及一种液体菌剂及其制备方法，所述液体菌剂包括促生拮抗菌M18、所述发酵培养基和菌体保护剂；以发酵培养基的总体积为基准，所述发酵培养基中包括：葡萄糖0.8～1.2g/100ml，复合氨基酸0.6～1.4g/100ml，硫酸铵0.1～0.4g/100ml，硝酸镧0.0015～0.0045g/100ml。所述制备方法包括以下步骤：1)配制所述发酵培养基；2)向所述发酵培养基中接种促生拮抗菌M18并培养；3)培养结束后向发酵液中加入菌体保护剂。本发明的液体菌剂可直接用于防治多种植物真菌性病害和促进植物幼苗的生长。优化后摇瓶发酵活菌产量可达350亿CFU/ml以上，本发明的制备方法提高了促生拮抗菌M18的发酵水平和活菌稳定性；同时不产生废水和废渣。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，特别是涉及一种液体菌剂及其制备方法。
背景技术
促生拮抗菌M18于植物根际土壤中分离得到，该菌类属荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.0462，在中国专利CN00119857.2中，发明人许煜泉、冯镇泰描述了生物农药促生拮抗菌M18及其制备方法，发明内容主要是：设计并应用了新的高效筛选培养程序，从植物根际土壤中制备出同时具有促进植物生长和广谱性抑制植物真菌性病害的生物农药促生拮抗菌M18；该发明产品能有效地抑制甜瓜蔓枯病菌、水稻纹枯病菌和黄瓜枯萎病菌等多种植物病菌的生长，并对植物幼苗的生长具有明显的促进作用。该专利的描述被参考并结合于本文中。
在上述专利中，发明人还描述了将促生拮抗菌M18制成活菌制剂的方法，活菌数可达1010CFU/ml，保存6个月的活菌数仍能达到108CFU/ml；具体制备过程是将该目标菌置于经高压灭菌的培养基上，25～30度振荡培养1～5天，得到促生拮抗菌M18，所述的培养基的配方为(重量百分比)：甘油0.5％～2.5％、蛋白胨1％～3％、磷酸氢二钾0.01％～0.05％、硫酸镁0.05％～0.35％、余量为水、pH5.5～7.5。该方法的缺点是M18菌剂活菌数偏低，储存稳定性差。
目前利用促生拮抗菌M18于发酵罐中深层培养再经提取和纯化，可以得到代谢产物吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，简称PCA)，又称申嗪霉素，是一种吩嗪类农用广谱杀菌剂，把它制成悬浮剂或可湿性粉剂用于防治植物真菌性病害，该工艺的缺点是发酵后提取纯化申嗪霉素的过程中会产生大量的废水和废渣，环保处置难度大。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种液体菌剂及其制备方法，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明首先提供一种发酵培养基，以发酵培养基的总体积为基准，所述发酵培养基中包括以下组分：
本发明还提供一种液体菌剂，所述液体菌剂包括促生拮抗菌M18、所述发酵培养基和菌体保护剂。
本发明还提供一种液体制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)配制所述发酵培养基；
2)向所述发酵培养基中接种促生拮抗菌M18并培养；
3)培养结束后向发酵液中加入菌体保护剂。
如上所述，本发明的液体菌剂及其制备方法，具有以下有益效果：液体菌剂可直接用于防治多种植物真菌性病害和促进植物幼苗的生长。优化后摇瓶发酵活菌产量可达350亿CFU/ml以上，具有很大生产优势。采用本发明的液体制剂的制备工艺，提高了促生拮抗菌M18的发酵水平和活菌稳定性；同时无提取和纯化步骤，不产生废水和废渣，不需后续环保处置措施。
具体实施方式
本发明提供一种发酵培养基，以发酵培养基的总体积为基准，所述发酵培养基中包括以下组分：
所述复合氨基酸包括L-苯丙氨酸或L-谷氨酸中的一种或几种。复合氨基酸作为速效氮源。
葡萄糖作为速效碳源被添加进发酵培养基。所述发酵培养基中葡萄糖的浓度选自以下范围中的一个：0.8～0.9g/100ml、0.9～1.0g/100ml、1.0～1.2g/100ml、1.2～1.4g/100ml。
所述发酵培养基中复合氨基酸的浓度选自以下范围中的一个：0.6～0.8g/100ml、0.8～1.0g/100ml、1.0～1.1g/100ml、1.1～1.2g/100ml。
硫酸铵作为无机氮源被添加进发酵培养基。所述发酵培养基中硫酸铵的浓度选自以下范围中的一个：0.1-0.2g/100ml、0.2～0.3g/100ml、0.3～0.4g/100ml。
硝酸镧作为细菌生长促进剂被添加进发酵培养基。所述发酵培养基中硝酸镧的浓度选自以下范围中的一个：0.0015～0.0025g/100ml、0.0025～0.0035g/100ml、0.0035～0.0045g/100ml。
所述发酵培养基还包括菌株发酵常用的物质。在一种实施方式中，所述发酵培养基还包括甘油、骨蛋白胨、磷酸氢二钾、硫酸镁、水。
在一种实施方式中，以发酵培养基的总体积为基准，所述发酵培养基中甘油的浓度为0.5～1.5％(ml/ml)。
在一种实施方式中，以发酵培养基的总体积为基准，所述发酵培养基中骨蛋白胨的浓度为0.5～2.0g/100ml。
在一种实施方式中，以发酵培养基的总体积为基准，所述发酵培养基中磷酸氢二钾的浓度为0.01～0.03g/100ml。
在一种实施方式中，以发酵培养基的总体积为基准，所述发酵培养基中硫酸镁0.05～0.15g/100ml。
在一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为7.0～7.2。
本发明还提供一种液体菌剂，所述液体菌剂包括促生拮抗菌M18、所述发酵培养基和菌体保护剂。
所述促生拮抗菌M18同申请号为CN00119857.2的中国专利中的促生拮抗菌M18相同。该菌属荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.0462。
在一种实施方式中，所述菌体保护剂包括黄原胶或海藻糖中的一种或多种。
在一种实施方式中，以发酵培养基的总体积为基准，菌体保护剂的终浓度为0.2～0.5g/100ml。
在一种实施方式中，所述液体制剂25℃储存1年，菌体存活率不低于85％。
本发明还提供一种液体制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)配制所述发酵培养基；
2)向所述发酵培养基中接种促生拮抗菌M18并培养；
3)培养结束后向发酵液中加入菌体保护剂即获得液体菌剂。
在一种实施方式中，步骤2)中接种的促生拮抗菌M18为促生拮抗菌M18的种子液。
在一种实施方式中，步骤2)中促生拮抗菌M18的接种量为发酵培养基体积的1％～3％(ml/ml)。
在一种实施方式中，步骤2)中的培养温度为26～30℃。
在一种实施方式中，步骤2)中接种完毕后在摇床上培养，摇床的转速为150～220转/分。
在一种实施方式中，步骤2)中培养时间为30～35小时。
在一种实施方式中，步骤2)培养结束时用平板计数法计数，活菌大于350亿CFU/ml。
所述促生拮抗菌M18同申请号为CN00119857.2的中国专利中的促生拮抗菌M18相同。该菌属荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.0462。
在一种实施方式中，所述菌体保护剂包括黄原胶或海藻糖中的一种或多种。所述黄原胶或海藻糖均为粉末状。
在一种实施方式中，以发酵培养基的总体积为基准，菌体保护剂的浓度为0.2％～0.5％(g/100ml)。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1摇瓶发酵培养基优化试验
用接种针从M18菌种斜面上挑起少许菌苔，转接至已制备好的茄子瓶斜面上，28±1℃培养20～24小时，用适量的灭菌蒸馏水将茄子瓶斜面上长好的菌苔洗至灭菌三角瓶中，即成种子液。上述使用的斜面培养基组成：葡萄糖1.0％、酵母浸粉0.5％、骨蛋白胨1.0％、氯化钠0.1％、琼脂1.5％、纯水配制、pH7.0～7.2、121℃灭菌20min。
发酵培养基中添加葡萄糖、复合氨基酸、硫酸铵、硝酸镧试验：将上述种子液按1％～3％的接种比例接至发酵摇瓶中，摇瓶基本培养基组成：甘油1.0％、骨蛋白胨1.5％、磷酸氢二钾0.02％、硫酸镁0.1％、纯水配制、pH7.0～7.2、121℃灭菌20min；培养条件：摇床温度28±1℃、转速150～220转/分、培养30～35小时；按上述条件，在基本培养基中添加各3个浓度的葡萄糖、复合氨基酸、硫酸铵、硝酸镧，按正交试验法，比较各组摇瓶试验的发酵活菌数(平板计数)，选定最优组合，数据如下表：
表1因素水平表
表2L9(34)正交试验方案及试验结果表
从以上试验结果可以看出，试验6的发酵活菌数最高，为357亿CFU/ml，其组合是A2B3C1D2，即基本培养基加葡萄糖1.0g/100ml、复合氨基酸1.2g/100ml、硫酸铵0.2g/100ml、硝酸镧0.003g/100ml，其中对发酵影响因素较大的是复合氨基酸。本实施例使用的复合氨基酸为L-苯丙氨酸和L-谷氨酸等比例的混合物。
实施例2
用接种针从M18菌种斜面上挑起少许菌苔，转接至已制备好的茄子瓶斜面上，28℃培养22小时，用25ml的灭菌蒸馏水将茄子瓶斜面上长好的菌苔洗至灭菌三角瓶中，即成种子液。按优化的发酵条件进行摇瓶发酵，摇瓶培养基组成：甘油1.0％、葡萄糖1.0％、骨蛋白胨1.5％、复合氨基酸1.2％、硫酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.02％、硫酸镁0.1％、硝酸镧0.003％、纯水配制、pH7.0～7.2、121℃灭菌20min；培养条件：摇床温度28℃、转速180转/分、培养35小时，结束培养，合并摇瓶发酵液，搅拌均匀，取样，采用平板计数法活菌计数：菌数359亿CFU/ml；按0.3％的比例向发酵菌液中添加黄原胶，完全溶解后搅拌均匀，呈悬浮状，即成M18液体菌剂；灌装在干净的塑料瓶中，25℃条件下储存一年，平板计数法活菌计数：菌数为312亿CFU/ml，一年期菌体存活率达86.9％。
实施例3
用接种针从M18菌种斜面上挑起少许菌苔，转接至已制备好的茄子瓶斜面上，28℃培养24小时，用25ml的灭菌蒸馏水将茄子瓶斜面上长好的菌苔洗至灭菌三角瓶中，即成种子液；按优化的发酵条件进行摇瓶发酵，摇瓶培养基组成：甘油1.0％、葡萄糖1.0％、骨蛋白胨1.5％、复合氨基酸1.2％、硫酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.02％、硫酸镁0.1％、硝酸镧0.003％、纯水配制、pH7.0～7.2、121℃灭菌20min；培养条件：摇床温度28℃、转速200转/分、培养35小时，结束培养，合并摇瓶发酵液，搅拌均匀，取样，采用平板计数法活菌计数：菌数363亿CFU/ml；按0.3％的比例向发酵菌液中添加海藻糖，完全溶解后搅拌均匀，呈悬浮状，即成M18液体菌剂；灌装在干净的塑料瓶中，25℃条件下储存一年，平板计数法活菌计数：菌数为314亿CFU/ml，一年期菌体存活率达86.5％。
本发明详细描述了促生拮抗菌M18的发酵培养基优化方法及液体菌剂制备方法。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (4)
1.一种液体菌剂，其特征在于，所述液体菌剂包括促生拮抗菌M18、发酵培养基和菌体保护剂，以发酵培养基的总体积为基准，所述发酵培养基中包括以下组分：
所述复合氨基酸为L-苯丙氨酸和L-谷氨酸等比例的混合物，所述发酵培养基还包括甘油、骨蛋白胨、磷酸氢二钾、硫酸镁或水，所述发酵培养基的pH为7.0～7.2，所述菌体保护剂包括黄原胶或海藻糖中的一种或多种，菌体保护剂的质量体积百分数为0.2～0.5g/100ml，所述液体菌剂25℃储存1年，菌体存活率不低于85％。
2.权利要求1所述液体菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)配制所述的发酵培养基；
2)向所述发酵培养基中接种促生拮抗菌M18并培养30～35小时，培养结束时用平板计数法计数，活菌大于350亿CFU/ml；
3)培养结束后向发酵液中加入菌体保护剂即获得液体菌剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下特征中的一项或多项：
a)步骤2)中接种的促生拮抗菌M18为促生拮抗菌M18的种子液；
b)步骤2)中促生拮抗菌M18的接种量为发酵培养基体积的1％～3％。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下特征中的一项或多项：
a)步骤2)中的培养温度为26～30℃；
b)步骤2)中接种完毕后在摇床上培养，摇床的转速为150～220转/分。
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