CN112741026A

CN112741026A - 一种石斑鱼的繁殖方法

Info

Publication number: CN112741026A
Application number: CN201911063319.8A
Authority: CN
Inventors: 施钢; 潘传豪; 王忠良; 吴勇; 曾珍
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2039-10-31
Also published as: CN112741026B

Abstract

本发明公开了一种石斑鱼的繁殖方法，分别从采集石斑鱼的精液和雌石斑鱼的卵细胞；将精液和卵细胞混合，并轻轻搅拌，获得受精卵；将受精卵置于砂滤海水中静置，随后用砂滤海水冲洗受精卵，洗净受精卵上的精液、亲鱼排泄物和分泌物将；受精卵密度为5—10c.mL^‑1，微充气，按照15×10^‑6L^‑1的剂量加入5％聚维酮碘溶液，药浴10‑15min，最后收集灭毒胚胎；将灭毒胚胎置于盐度30的消毒海水中孵化，密度0.01—0.03个/ml，微充气，孵化。感染鱼类诺达病毒受精卵在卵裂4细胞期前通过本申请的清洗、灭毒操作后，鱼类诺达病毒RNA检测均为阴性；最后通过本申请的孵化操作，可以获得没有鱼类诺达病毒的仔鱼，而且仔鱼的孵化率高，畸形率低，能有效避免鱼类诺达病毒垂直传播。

Description

一种石斑鱼的繁殖方法

技术领域

本发明涉及动物养殖领域，具体涉及一种石斑鱼的繁殖方法。

背景技术

鱼类诺达病毒(piscine nodaviruses)(即神经坏死病病毒Viral nervousnecrosis，VNN)是感染斜带石斑鱼、褐点石斑鱼、鞍带石斑鱼、珍珠龙趸等石斑鱼类，及欧洲狼鲈、军曹鱼等海水鱼类各个生长阶段的主要病毒。研究表明，其传播途径主要为亲鱼的垂直传播、饵料生物和生活环境的水平传播，感染后死亡率90％以上，导致仔、稚、幼鱼或者成鱼批量死亡，严重抑制海水名贵鱼类养殖业的可持续发展。

在石斑鱼种苗生产中，因亲鱼鱼类诺达病毒的垂直传播导致仔、稚、幼鱼爆发病毒病而失败的现象日趋严重。近年来，粤、桂、琼三省沿海石斑鱼(珍珠龙趸)种苗培育中，从仔鱼培育至体长9cm的种苗规格，其成活率仅为0.2％—0.4％。其中神经坏死病成为制约石斑鱼养殖业可持续发展核心问题。

目前，切断鱼类诺达病毒垂直传播的方法有无特定病原(Specific pathogenFree，简称SPF)亲鱼培育及种质资源保存、受精卵消毒等，但SPF亲鱼培育的周期长(褐点石斑鱼一代亲鱼雌鱼初次性成熟的时间是4-5年，雄鱼为6-7年，斜带石斑鱼雌鱼初次性成熟的时间是4-5年，雄鱼为6-7年，鞍带石斑鱼雌鱼初次性成熟的性时间是6-8年，雄鱼为8-10年)、SPF亲鱼种群维持费用高，因此尽管其应用前景广泛，但由于超长的研发周期，且SPF种质资源具有重新感染病毒的极大风险等原因，目前尚无法应用于产业。本专利通过使用常用的消毒剂和安全的剂量在石斑鱼胚胎发育的特定时段采用精准的步骤进行消毒，切断石斑鱼亲鱼携带的鱼类诺达病毒的垂直传播，获取批量胚胎发育正常且不携带病毒的石斑鱼仔鱼。

迄今为止，未见有关于精准切断石斑鱼类亲鱼鱼类诺达病毒垂直传播的方法的报道，仅仅只有关于诺达病毒的快速检测方法。例如：ZL201610277466.5《三步法快速检测石斑鱼β诺达病毒的试剂盒及其操作方法》“快速提取RNA、预混反应试剂的方法，简化了RNA病毒的检测步骤。本发明所用材料和试剂全部为一次性使用，确保不会出现假阳性结果；本发明试剂盒组份简单，使用方法可操作性强，适用于检测和防控石斑鱼类黑身病的流行，能特异性，高灵敏度的检测出β诺达病毒。”虽然能加快检测发现诺达病毒，但是无法从根本上有效切断鱼类诺达病毒垂直传播。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提供一种能有效减少石斑鱼类诺达病毒垂直传播、提高种苗质量和产量的石斑鱼的繁殖方法。

为实现该技术目的，本发明的方案是：一种石斑鱼的繁殖方法，具体步骤如下：

第一步，采集，分别从采集石斑鱼的精液和雌石斑鱼的卵细胞；

第二步，人工授精，将精液和卵细胞混合，并轻轻搅拌，待搅拌均匀后加入少量海水活化精子，获得受精卵；

第三步，洗卵，将受精卵置于砂滤海水中静置，受精卵密度为1—5c.mL^-1，随后用砂滤海水冲洗受精卵，洗净受精卵上的精液、亲鱼排泄物和分泌物；

第四步，灭毒，将清洗后的受精卵置于砂滤海水中，受精卵密度为5—10c.mL^-1，微充气，镜检胚胎发育进入2细胞期时，按照15×10^-6L^-1的剂量加入5％聚维酮碘溶液，药浴10-15min，最后收集灭毒胚胎；

第五步，孵化，将灭毒胚胎置于盐度30的消毒海水中孵化，密度0.01—0.03个/ml，微充气，孵化；发育到原肠初期，停止充气让好卵上浮，坏卵下沉排出；继续孵化至出膜获得无病毒仔鱼。

作为优选，所述第三步洗卵和第四步灭毒要求在卵裂4细胞期前完成。

作为优选，所述第五步的消毒海水为：在沙滤海水加入含氯消毒剂，按有效氯12×10^-6L^-1—15×10^-6L^-1黑暗处理12h，化学纯以上的硫代硫酸钠中和余氯，曝气2h。

作为优选，第一步采集中，在经促熟培育的亲鱼群体中，选择腹部饱满的亲鱼，挤压腹部获取少量性细胞，镜检并明确成熟度和雌雄，最终采集到石斑鱼的精液和雌石斑鱼的卵细胞。

作为优选，所述含氯消毒剂为漂白粉、漂白精、或强氯精其中一种或多种。

作为优选，将无病毒仔鱼进行抽查取样，检测鱼类诺达病毒RNA。

本发明的有益效果，感染鱼类诺达病毒受精卵在卵裂4细胞期前通过本申请的清洗、灭毒操作后，鱼类诺达病毒RNA检测均为阴性；最后通过本申请的孵化操作，可以获得没有鱼类诺达病毒的仔鱼，而且仔鱼的孵化率高，畸形率低，能有效避免鱼类诺达病毒垂直传播。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明所述的具体实施例为一种石斑鱼的繁殖方法，具体步骤如下：

为了及时清洗和灭毒，所述第三步洗卵和第四步灭毒要求在卵裂4细胞期前完成。

为了获得优质的消毒海水，所述第五步的消毒海水为：在沙滤海水加入含氯消毒剂，按有效氯12×10^-6L^-1—15×10^-6L^-1黑暗处理12h，化学纯以上的硫代硫酸钠中和余氯，曝气2h。

为了取出合适的精子和卵细胞，第一步采集中，在经促熟培育的亲鱼群体中，选择腹部饱满的亲鱼，挤压腹部获取少量性细胞，镜检并明确成熟度和雌雄，最终采集到石斑鱼的精液和雌石斑鱼的卵细胞。

为了有效消毒海水，所述含氯消毒剂为漂白粉、漂白精、或强氯精其中一种或多种。

为了确保每个批次的无病毒仔鱼符合要求，将无病毒仔鱼进行抽查取样，检测鱼类诺达病毒RNA。通过抽查可以即使发现是否有感染诺达病毒。

下面就具体实施例进行说明：

实施例一：

1.1石斑鱼类成熟性细胞的采集

下午17:00，在养殖场4号、5号亲鱼培育池，挑选1尾性腺成熟鞍带石斑鱼，体重约85千克，挤压腹部获取少量性细胞，镜检为精子，确定为雄鱼。采用挤压法获取精液约90毫升，置于塑料管中冷藏备用。取样检测鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA。

当日20:30，在7号、8号亲鱼培育池，挑选13尾性腺成熟褐点石斑鱼亲鱼，体重约6千克—7千克，腹部饱满，挤压腹部获取少量性细胞，镜检确定其中10尾为雌鱼。采用挤压法获取卵细胞，每尾亲鱼的卵细胞独立置于塑料盆中，并编号，共10份，每份约0.6—0.8kg。分别取样检测鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA。

1.2人工受精：将步骤1.1获得的精液分为10等份，然后分别和10份卵细胞混合，轻轻搅拌1分钟，促使精子和卵细胞充分均匀混合。分别取样检测鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA。

1.3洗卵：将步骤1.2获得的受精卵分别置于沙滤海水中，受精卵密度约5c.mL^-1，静置15分钟，用砂滤海水冲洗受精卵，洗净受精卵上的精液、亲鱼排泄物和分泌物等。洗卵要求在卵裂4细胞期前完成。分别取样检测鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA。

1.4受精卵灭毒：将步骤1.3获得的洗净受精卵分别置于沙滤海水中，受精卵密度约5c.mL^-1，微充气，镜检胚胎发育进入2细胞期时，加入5％聚维酮碘溶液，剂量为15×10^-6L^-1，药浴15min，收集灭毒后胚胎。整个操作在4细胞期前完成。分别取样检测鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA。

1.5孵化、择优和无病毒仔鱼的获得：将步骤1.4获得的灭毒胚胎置于孵化池消毒海水中孵化，密度约0.03c.mL^-1，微充气。孵化。发育到原肠初期，停气让好卵上浮，坏卵下沉排出。继续孵化至出膜获得无病毒仔鱼。取样检测鱼类诺达病毒RNA和真鲷虹彩病毒DNA。

实施例一的结果如下：

1.6采集的石斑鱼类成熟性细胞检测结果：鞍带石斑鱼精液良好，精子和卵细胞的鱼类诺达病毒RNA检测均为阳性。

1.7灭毒受精卵的检测结果：镜检获取的优质清洗后的受精卵，二细胞期胚胎90％以上，发育良好。鱼类诺达病毒RNA检测均为阴性。

1.8孵化获得的无病毒仔鱼检测结果：次日下午16:00，孵化出膜为仔鱼，孵化率93.63％，畸形率0.34％。鱼类诺达病毒RNA检测均为阴性。

实施例二

2.1石斑鱼类成熟性细胞的采集：下午17:20，在养殖场2号、3号亲鱼培育池，挑选2尾性腺成熟鞍带石斑鱼，体重分别约85千克和90千克，腹部饱满，挤压腹部获取少量性细胞，镜检为精子，确定为雄鱼。采用挤压法分别获取精液约100毫升和90毫升，置于塑料盆中。取样检测鱼类诺达病毒RNA。

在5号、6号亲鱼培育池，挑选18尾性腺成熟褐点石斑鱼亲鱼，体重约6—8千克，腹部饱满，挤压腹部获取少量性细胞，镜检确定其中14尾为雌鱼。采用挤压法获取卵细胞，每尾亲鱼的卵细胞独立置于塑料盆中，并编号，共14份，每份约0.6—0.9kg。分别取样检测鱼类诺达病毒RNA。

2.2人工受精：将步骤2.1获得的精液分为7等份，2尾雄鱼共14份，分别和14份卵细胞混合，轻轻搅拌1分钟，促使精子和卵细胞充分均匀混合。分别取样检测鱼类诺达病毒RNA。

2.3洗卵：：将步骤2.2获得的受精卵分别置于塑料盆沙滤海水中，受精卵密度约5c.mL^-1，轻轻搅拌均匀，静置15分钟，用砂滤海水冲洗受精卵，洗净受精卵上的精液、亲鱼排泄物和分泌物等。洗卵要求在卵裂4细胞期前完成。分别取样检测鱼类诺达病毒RNA。

2.4受精卵灭毒：将步骤2.3获得的优质受精卵分别置于沙滤海水中，受精卵密度约5c.mL^-1，微充气，镜检胚胎发育进入2细胞期时，加入5％聚维酮碘溶液，剂量为15×10^-6L^-1，药浴15min，收集灭毒后胚胎。整个操作在4细胞期前完成。分别取样检测鱼类诺达病毒RNA。

2.5孵化、择优和无病毒仔鱼的获得：将步骤2.4获得的灭毒胚胎置于孵化池消毒海水中孵化，密度约0.03c.mL^-1，微充气、孵化。发育到原肠初期，停气让好卵上浮，坏卵下沉排出。继续孵化至出膜获得无病毒仔鱼。取样检测鱼类诺达病毒RNA。

实施例二的检测结果如下：

2.6采集的石斑鱼类成熟性细胞检测结果：鞍带石斑鱼精液数量充足，海水激活后活力良好，鱼类诺达病毒RNA检测均为阳性。熟褐点石斑鱼卵细胞数量充足，海水激活后形状规则，诺达病毒RNA检测结果：14份鱼类诺达病毒RNA均为阴性。

2.7人工受精前检测结果：14份精子鱼类诺达病毒RNA检测均为阴性，而卵细胞混合物鱼类诺达病毒RNA检测均为阳性。

2.8洗卵后的受精卵检测结果：镜检获取的优质受精卵，受精率99％以上，受精膜明显，质量良好。鱼类诺达病毒RNA检测均为阳性。

2.9灭毒受精卵的检测结果：镜检获取的优质受精卵，四细胞期胚胎95％以上，发育良好。鱼类诺达病毒RNA检测均为阴性。

2.10孵化的无病毒仔鱼检测结果：次日下午15:40，孵化出膜为仔鱼，孵化率96.67％，畸形率0.21％。鱼类诺达病毒RNA检测均为阴性。

通过实施例一和实施例二可知，无论是卵细胞中鱼类诺达病毒RNA检测阳性，还是卵细胞和精子鱼类诺达病毒RNA均检测阳性，其受精卵均会感染鱼类诺达病毒；而通过本申请的灭毒操作后，鱼类诺达病毒RNA检测均为阴性；最后通过本申请的孵化操作，可以获得没有鱼类诺达病毒的仔鱼，而且仔鱼的孵化率高达93％以上，畸形率低于0.34％。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围之内。

Claims

1.一种石斑鱼的繁殖方法，其特征在于：具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的石斑鱼的繁殖方法，其特征在于：所述第三步洗卵和第四步灭毒要求在卵裂4细胞期前完成。

3.根据权利要求1所述的石斑鱼的繁殖方法，其特征在于：所述第五步的消毒海水为：在沙滤海水加入含氯消毒剂，按有效氯12×10^-6L^-1—15×10^-6L^-1黑暗处理12h，化学纯以上的硫代硫酸钠中和余氯，曝气2h。

4.根据权利要求1所述的石斑鱼的繁殖方法，其特征在于：第一步采集中，在经促熟培育的亲鱼群体中，选择腹部饱满的亲鱼，挤压腹部获取少量性细胞，镜检并明确成熟度和雌雄，最终采集到石斑鱼的精液和雌石斑鱼的卵细胞。

5.根据权利要求3所述的石斑鱼的繁殖方法，其特征在于：所述含氯消毒剂为漂白粉、漂白精、或强氯精其中一种或多种。

6.根据权利要求3所述的石斑鱼的繁殖方法，其特征在于：将无病毒仔鱼进行抽查取样，检测鱼类诺达病毒RNA。