CN112739691B - 用作抗癌药的trk抑制剂 - Google Patents

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Abstract

涉及一组原肌球蛋白受体激酶抑制剂，其包含酰胺基苯氧基吲唑化合物结构。这些化合物对许多致癌激酶显示强效抑制作用，尤其是TRK，由此可用于治疗肿瘤或癌症。

Description

用作抗癌药的TRK抑制剂
技术领域
本发明涉及一组具有新结构的化合物、包含这些化合物的药物组合物、制备这些化合物的方法以及这些化合物在治疗癌症中的用途。具体而言，本发明涉及一组取代的“苯基-吡啶酮-酰胺基-苯氧基-(吡唑取代的)吲唑”结构的化合物，其表现Trk抑制活性且由此可用于治疗癌症。
背景技术
原肌球蛋白受体激酶(Tropomyosin Receptor Kinase)，也称为Trk。Trk受体家族包含TrkA、TrkB和TrkC三种受体，该三种受体分别由神经营养酪氨酸激酶受体基因NTRK1、NYRK2和NTRK3编码。Trk是一类神经营养因子(NT)受体，它们可见于多种组织类型中，可由神经营养因子激活，在这些神经营养因子中，有可激活TrkA的神经生长因子(NGF)、可激活TrkB的脑源性神经营养因子(BDNF)及NT-4/5以及可激活TrkC的NT3。
神经营养因子与Trk蛋白质结合，进而诱导受体二聚体化、磷酸化，并且激活PI3K、RAS/MAPK/ERK和PLC-gamma的下游信号放大和传导。从而，Trk与细胞增殖、分化、代谢和凋亡有密切的关系。具体地，它们参与神经元发育，包括神经元突触的生长和功能、记忆形成和维持以及缺血和其他类型损伤后的神经元保护。WO2010/033941中已有综述，研究显示，Trk/神经营养因子途径的抑制剂在疼痛的多种临床前模型中有效；Trk的过表达、激活、扩增和/或突变与许多癌症有关，相应地，在癌症的临床前和临床模型中，一些小分子Trk抑制剂已经显示能够抑制肿瘤生长并阻止肿瘤转移；抑制Trk/神经营养因子途径还显示可有效治疗炎症性疾病(如炎性肺病、间质性膀胱炎、炎性肠病及炎性皮肤病)、神经变性疾病(如多发性硬化、帕金森氏病、阿尔兹海默氏病)、与骨重建调节失衡有关的疾病(如骨质疏松、类风湿性关节炎和骨转移)。
具体就Trk与癌症治疗的关系而言，Trk蛋白可与神经营养因子结合，进而诱导Trk受体二聚体化、磷酸化，并且激活PI3K、RAS/MAPK/ERK和PLC-gamma的下游信号放大和传导。Trk通路的变化主要包括基因融合、蛋白过表达及单核苷酸变异，这些变化与许多癌症的发病机理有关，其中NTRK基因融合是迄今为止最为明确的致癌事件(Stransky N等人,TheLandscape of kinase fusions in cancer,Nature Communications 2014年9月，10:1-10)。研究表明，当染色体变异发生NTRK基因融合，可导致Trk下游信号过度激活，进而可导致或促进多种癌症产生(Vaishnavi等人，TRKing Down an Old Oncogene in a New Eraof Targeted Therapy,Cancer Discovery 2015；5:25-34)。这些癌症包括但不限于神经母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、唾液腺癌、多发性骨髓瘤、星形细胞瘤和成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、肺腺癌、大细胞神经内分泌肿瘤、结肠直肠癌、头颈癌、肉瘤(尤其婴儿纤维肉瘤癌)、肝内胆管癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、分泌性乳腺癌(secretory breast carcinoma)、乳腺分泌性癌(mammary secretory carcinoma)、急性髓样白血病、先天性中胚层肾瘤、先天性纤维肉瘤、急性成淋巴细胞性白血病、结肠腺癌、胃肠道间质瘤等。其中，NTRK1基因融合已经显示是肺腺癌、胆管癌、结直肠癌、乳头状甲状腺癌、spitzoid肿瘤和成胶质细胞瘤的驱动突变；NTRK2基因融合已经显示是肉瘤、星形细胞瘤、肺腺癌和头颈癌的驱动突变；NTRK3基因融合已经显示是低级胶质瘤、分泌性乳腺癌、乳头状甲状腺癌、急性髓性白血病、先天性中胚层肾瘤、先天性纤维肉瘤、急性成淋巴细胞性白血病、结肠腺癌、甲状腺癌、皮肤黑素瘤、头颈癌和小儿胶质瘤的驱动突变(Vaishnavi等人，2015)。因此，靶向Trk、抑制Trk催化活性的化合物有望成为这些癌症治疗的有效选择。
已经报道了若干类用于治疗癌症的Trk的小分子抑制剂。国际专利申请WO2006/115452和WO2006/087538描述了若干被称为Trk抑制剂的小分子化合物，可用于治疗疼痛和癌症。WO2008/052734和WO2010/033941分别描述了具有咪唑并[1,2-B]哒嗪结构的化合物，可用于治疗Trk介导的疾病或作为Trk抑制剂。WO2017/075017综述了多种结构类型的Trk抑制剂，包括但不限于取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物、大环化合物、取代的咪唑并[1,2-B]哒嗪化合物、包含-NH(C＝X)NH-结构的化合物、包含吲唑酰氨基结构的化合物。
WO2010/011538描述了一组可用作C-Met抑制剂的酰胺基苯氧基吲唑化合物。近期有研究报道(Bruce W.Konicek等人，Merestinib(LY2801653)inhibits neurotrophicreceptor kinase(NTRK)and suppresses growth of NTRK fusion bearing tumors,Oncotarget,2018,Vol.9,(No.17),pp:13796-13806)，靶向若干致癌激酶MET、AXL、RON和MKNK1/2的口服多激酶抑制剂Meretinib(LY2801653)显示能够抑制神经营养受体激酶(NTRK)并抑制携带NTRK基因融合的肿瘤的生长。
目前，若干以NTRK为靶标的化合物已经在临床开发中，例如LOXO-101(Larotrectinib)、Entrectinib、Carbozantinib、Merestinib、DS-6051b、PLX7486、TSR-011等。其中LOXO-101(Larotrectinib)的临床研究结果非常令人鼓舞，受试患者的肿瘤分布于十多种不同类型，包括甲状腺癌、结直肠癌、肺癌、黑色素瘤、婴儿纤维肉瘤、唾液腺瘤、胆管癌、GIST等，患者整体响应率(ORR)达75％，其中部分响应占62％，完全响应率占13％，治疗1年后，71％的病人依然响应治疗，55％的病人无疾病进展(Drilon A等人，Efficacy ofLarotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children，N Engl J Med.2018 Feb 22；378(8):731-739)。
然而，鉴于靶向Trk抑制剂具有优异的抗肿瘤效果，仍然需要更多强效的靶向抑制Trk的化合物，这些化合物期望具有改进的理化性质、成药性质和/或较少的药物相互作用。
本发明提供了具有抑制Trk活性的新型的特定取代的酰胺基苯氧基吲唑化合物，这些本发明化合物、尤其是本发明优选的化合物因具有改进的取代模式，相比现有技术已有的Trk抑制剂，不仅保留了相当的Trk抑制活性、甚至显示出增强的Trk抑制活性，还可减少体内活性中间体的产生；理化性质得以改良，例如和溶解度明显改善，从而具有良好的成药性质，例如更容易在体内崩解和吸收；同时对细胞色素p450酶系的抑制作用减弱，从而具有减少的药物相互作用。此外，本发明化合物、尤其是本发明优选的化合物，相比现有技术已有的Trk抑制剂，还表现出优异的抗肿瘤活性，能够以更高的浓度被富集在肿瘤组织和血浆中，同时还表现出显著改进的代谢稳定性，代谢半衰期更长，固有清除率更低，从而可以提供更为持久的药效或降低所需的药物剂量。尤其是，本发明中的含三环结构的化合物赋予分子Trk抑制活性、不同的活性谱、更好的成药性(如更低的对细胞色素p450酶系的抑制作用、更好的体内代谢稳定性等)。
发明内容
发明人通过研究发现，某些特定取代的吲唑-苯氧基-氨基酰基-二氢吡啶基化合物是Trk抑制剂，可用于治疗或预防Trk活性在其中扮演角色或牵涉的疾病或病症或可通过抑制Trk来治疗的疾病或病症，尤其是通过抑制Trk来治疗或预防肿瘤或癌症，更尤其是用于治疗或预防由NTRK基因融合导致的肿瘤或癌症。
本发明第一方面提供式I的化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，
Figure GDA0003227487180000031
其中R1是C1-6烷基或C3-6环烷基，其任选被一个或多个卤素、-ORa、C1-6烷基或氨基取代；
R5是H、卤素、-ORa或任选取代的C1-6烷基，所述取代基选自一个或多个卤素、-ORa、C1-6烷基或氨基；
或者R1和R5与它们所连接的原子一起形成具有以下通式的环状结构：
Figure GDA0003227487180000032
其中X是-CR7R8-、＝CR7-、-CR7R8-CR7R8-或-CR7＝CR8-；
R6、R7、R8和R9各自独立地是H、卤素、-ORa、任选取代的C1-6烷基或C3-6环烷基，其中所述取代基选自一个或多个卤素、-ORa、C1-6烷基或氨基；或
连接于同一个碳原子上的R6和R9或R7和R8可以一起形成＝O或＝S，或与它们所连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；
R2是任选被一个或多个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或氨基取代的C1-6烷基；任选被一个或多个卤素、-ORa、C1-6烷基或氨基取代的C3-6环烷基或C3-6杂环基；硝基、氰基、酰基、卤素、巯基、C1-6烷硫基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基亚磺酰基或羧基；
R3和R4各自独立地选自H、卤素、硝基、氰基、酰基或羧基；
Ra是H或C1-6烷基；
条件是R1和R2不同时为甲基。
在一种式I化合物的实施方式中，R1为C1-6烷基，例如但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2-乙基丁基；优选甲基、乙基或异丙基，它们任选被1、2或3个卤素(优选氟)、羟基、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)或氨基取代。
在一种式I化合物的实施方式中，R1为C3-6环烷基，优选环丙基、环丁基、环戊基或环己基，它们任选被1、2或3个卤素(优选氟)、羟基、C1-6烷基(优选甲基、乙基或异丙基)、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)或氨基取代，例如但不限于2-氟环丙基、2-和/或3-氟环丁基、2-和/或3-氟环戊基、2-、3-和/或4-氟环己基，或这些基团的相应位置被羟基、甲基、乙基、异丙基、甲氧基、乙氧基或氨基取代的各基团。
在一种式I化合物的实施方式中，R5为H。
在一种式I化合物的实施方式中，R5为卤素、羟基、C1-6烷氧基或C1-6烷基，例如但不限于氟、氯、溴、碘、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、甲基、乙基、丙基、异丙基等，任选被1、2或3个卤素(优选F)、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)、C1-6烷基(优选甲基、乙基)或氨基取代。
在一种式I化合物的实施方式中，R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)结构，其中R6和R9各自独立地是H、卤素、羟基、C1-6烷基或C3-6环烷基，且X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素、羟基、C1-6烷基或C3-6环烷基。优选地，R6和R9各自独立地是H、卤素或C3-6环烷基，且X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素或C3-6环烷基。
在该实施方式中，还优选R6和R9之一和/或R7和R8之一为C3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在该实施方式中，还优选R6和R9之一或二者和/或R7和R8之一或二者为卤素，优选氟。
在该实施方式中，最优选地，R6和R9都是H，且X是-CR7R8-，其中R7和R8都是H；还最优选R6和R9都是H，且X是-CHF-或-CF2-；还最优选R6和R9都是H，且X是-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8都是H；还最优选R6和R9都是H，且X是-CH2-CF2-或-CHF-CHF-。
在一种式I化合物的实施方式中，R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)结构，其中R6和R9各自独立地是H、卤素、羟基、C1-6烷基或C3-6环烷基，且X是＝CR7-或-CR7＝CR8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素、C1-6烷基或C3-6环烷基。更优选地，R6和R9各自独立地是H、卤素(优选氟)或C3-6环烷基，且X是＝CR7-或-CR7＝CR8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素(优选氟)或C3-6环烷基。
在该实施方式中，还优选R6和R9之一和/或R7和R8之一为C3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在一种式I化合物的实施方式中，R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)结构，其中X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中连接于同一个碳原子上的R6和R9或R7和R8一起形成＝O或＝S，或与它们所连接的碳原子一起形成环丙基、环丁基、环戊基或环己基；优选连接于同一个碳原子上的R7和R8一起形成环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在一种式I化合物的实施方式中，R2是C1-6烷基，例如但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2-乙基丁基；优选甲基、乙基、异丙基，它们任选被1、2或3个卤素(优选氟)、C1-6烷基(优选甲基、乙基或异丙基)、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)或氨基取代；最优选甲基、乙基、异丙基或三氟甲基。
在一种式I化合物的实施方式中，R2是C3-6环烷基或C3-6杂环基，例如但不限于环丙基、环丁基、环戊基或环己基，或四氢呋喃、四氢噻吩、氮杂环丁烷、吖啶、四氢吡咯、噻唑烷、噁唑烷、哌啶、哌嗪、吗啉、硫吗啉、噻嗪；优选环丙基；它们任选被1、2或3个卤素(优选氟)、羟基、C1-6烷基(优选甲基、乙基或异丙基)、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)或氨基取代。
在一种式I化合物的实施方式中，R3和R4各自独立地选自H或卤素，优选F、Cl、Br或I；更优选F。
本发明式I化合物涵盖以上各个独立、联合或任何组合或亚组合的实施方式，也涵盖以上任何优选、更优选或最优选定义的任何组合所构成的实施方式。
本发明第一方面式I化合物的一种实施方式为式I-a的化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，
Figure GDA0003227487180000061
其中R1是C1-6烷基；
R2是任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或C3-6环烷基；
R3和R4各自独立地选自H或卤素；且
条件是R1和R2不同时为甲基。
本发明第一方面还优选提供式I-b的化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，
Figure GDA0003227487180000062
其中
R2是任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或C3-6环烷基；
R3和R4各自独立地选自H或卤素；
R6和R9各自独立地是H、卤素、羟基、C1-6烷基或C3-6环烷基，且
X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素、羟基、C1-6烷基或C3-6环烷基，或连接在同一碳原子上的R7和R8一起形成C3-6环烷基
本发明第一方面还提供式II化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，
Figure GDA0003227487180000071
其中R1是C1-6烷基或C3-6环烷基，其任选被一个或多个卤素、-ORa、-SRa、C1-6烷基或氨基取代；
R5是H、卤素、-ORa、-SRa、或任选取代的C1-6烷基，所述取代基选自一个或多个卤素、-ORa、-SRa、C1-6烷基或氨基；
或者R1和R5与它们所连接的原子一起形成具有以下通式的环状结构：
Figure GDA0003227487180000072
其中X是-CR7R8-、＝CR7-、-CR7R8-CR7R8-或-CR7＝CR8-；
R6、R7、R8和R9各自独立地是H、卤素、-ORa、-SRa、任选取代的C1-6烷基或C3-6环烷基，其中所述取代基选自一个或多个卤素、-ORa、-SRa、C1-6烷基或氨基；或
连接于同一个碳原子上的R6和R9或R7和R8可以一起形成＝O或＝S，或与它们所连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；
R2是任选被一个或多个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的C1-6烷基；任选被一个或多个卤素、-ORa、-SRa、C1-6烷基或氨基取代的C3-6环烷基或C3-6杂环基；硝基、氰基、酰基、卤素、-SRb、-SO2Rb、-SORb、C(O)Rb或CO2Rb；或R2是-NRaRb或-ORb；
R3和R4各自独立地选自H、卤素、硝基、氰基、酰基或羧基；
R10是氢、卤素、氰基、硝基、-NRaRb、-ORb、-SRb、C(O)Rb、CO2Rb；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、C3-6杂环烷基、6-10元芳基、5-10元杂芳基；被一个或多个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的C1-6烷基或C2-6烯基或C2-6炔基；被一个或多个羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的C3-6环烷基或C3-6杂环烷基；被一个或多个羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的6-10元芳基或5-10元杂芳基；
Ra和Rb各自独立地是H、任选被一个或多个卤素、CN或硝基取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、CN或硝基取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素、CN或硝基取代的3-6元环；
条件是R1和R2不同时为甲基。
在一种式II化合物的实施方式中，R1为C1-6烷基，例如但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2-乙基丁基；优选甲基、乙基或异丙基，它们任选被1、2或3个卤素(优选氟)、羟基、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)、巯基、C1-6烷硫基(优选甲硫基或乙硫基)或氨基取代，最优选甲基。
在一种式II化合物的实施方式中，R1为C3-6环烷基，优选环丙基、环丁基、环戊基或环己基，它们任选被1、2或3个卤素(优选氟)、羟基、C1-6烷基(优选甲基、乙基或异丙基)、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)、巯基、C1-6烷硫基(优选甲硫基或乙硫基)或氨基取代，例如但不限于2-氟环丙基、2-和/或3-氟环丁基、2-和/或3-氟环戊基、2-、3-和/或4-氟环己基，或这些基团的相应位置被羟基、巯基、甲基、乙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、甲硫基、乙硫基或氨基取代的各基团。
在一种式II化合物的实施方式中，R5为H、卤素、羟基、C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷硫基或C1-6烷基，例如但不限于H、氟、氯、溴、碘、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、甲基、乙基、丙基、异丙基、巯基、甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基等，任选被1、2或3个卤素(优选F)、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)、C1-6烷硫基(优选甲硫基或乙硫基)、C1-6烷基(优选甲基、乙基)或氨基取代；最优选R5是H。
在一种式II化合物的实施方式中，R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)结构，其中R6和R9各自独立地是H、卤素、羟基、巯基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或C3-6环烷基，且X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素、羟基、巯基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或C3-6环烷基。优选地，R6和R9各自独立地是H、卤素、C1-6烷基或C3-6环烷基，且X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素、C1-6烷基或C3-6环烷基。
在该实施方式中，还优选R6和R9之一和/或R7和R8之一为C3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在该实施方式中，还优选R6和R9之一或二者和/或R7和R8之一或二者为卤素，优选氟。
在该实施方式中，最优选地，R6和R9都是H，且X是-CR7R8-，其中R7和R8都是H；还最优选R6和R9都是H，且X是-CHF-或-CF2-；还最优选R6和R9都是H，且X是-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8都是H；还最优选R6和R9都是H，且X是-CH2-CF2-、-CH2-CHF-、-CHF-CHF-或-CF2-CF2-。
在一种式II化合物的实施方式中，R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)结构，其中R6和R9各自独立地是H、卤素、羟基、巯基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或C3-6环烷基，且X是＝CR7-或-CR7＝CR8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素、C1-6烷基或C3-6环烷基。更优选地，R6和R9各自独立地是H、卤素(优选氟)、C1-6烷基或C3-6环烷基，且X是＝CR7-或-CR7＝CR8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素(优选氟)、C1-6烷基或C3-6环烷基。
在该实施方式中，还优选R6和R9之一和/或R7和R8之一为C3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在一种式II化合物的实施方式中，R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)结构，其中X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中连接于同一个碳原子上的R6和R9或R7和R8一起形成＝O或＝S，或与它们所连接的碳原子一起形成环丙基、环丁基、环戊基或环己基；优选连接于同一个碳原子上的R7和R8一起形成环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在一种式II化合物的实施方式中，R2是-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地选自H、任选被一个或多个卤素(优选氟)取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素(优选氟)取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素、优选氟取代的3-6元环，Ra和Rb优选各自独立地选自H或C1-6烷基，具体的R2例如但不限于-NH2、-NH-Me、-NH-Et、-NH-nPr、-NH-iPr、-NH-cPr、-NH-nBu、-NH-sec-Bu、-NH-iBu、-NH-tBu、-NH-cBu、-NH-戊基、-NH-异戊基、-NH-新戊基、-NH-环戊基、-NH-己基、-NH-(2-或3-乙基)丁基、-NH-(2,3-二甲基)丁基、-NH-(2-丙基)丙基、-N(Me)2、-N(Me)(Et)、-N(Et)2、-N(Pr)2以及这些被取代的氨基上的烷基或环烷基被一个或多个卤素如氟取代的相应基团等，更优选Ra和Rb同时为H。
在一种式II化合物的实施方式中，R2是-SRb，其中Rb选自H、任选被一个或多个卤素(优选氟)取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素(优选氟)取代的C3-6环烷基，优选任选被卤素(优选氟)取代的C1-6烷基或任选被卤素(优选氟)取代的C3-6环烷基，具体的R2例如但不限于-SH、-S-Me、-S-Et、-S-nPr、-S-iPr、-S-cPr、-S-nBu、-S-sec-Bu、-S-iBu、-S-tBu、-S-cBu、-S-戊基、-S-异戊基、-S-新戊基、-S-环戊基、-S-己基、-S-(2-或3-乙基)丁基、-S-(2,3-二甲基)丁基、-S-(2-丙基)丙基、-SCF3、-SCF2H、-SCH2CF3、-SCH2CH2F、-SCH2CHF2、-S-cPrF等，优选R2为-SMe。
在一种式II化合物的实施方式中，R2是-ORb，其中Rb选自H、任选被卤素(优选氟)取代的C1-6烷基或任选被卤素(优选氟)取代的C3-6环烷基，优选任选被卤素(优选氟)取代的C1-6烷基或任选被卤素(优选氟)取代的C3-6环烷基，具体的R2例如但不限于-OH、-OMe、-OEt、-O-nPr、-O-iPr、-O-cPr、-O-nBu、-O-sec-Bu、-O-iBu、-O-tBu、-O-cBu、-O-戊基、-O-异戊基、-O-新戊基、-O-己基、-O-(2-或3-乙基)丁基、-O-(2,3-二甲基)丁基、-O-(2-丙基)丙基、-OCF3、-OCF2H、-OCH2CF3、-O-cPrF等，优选的R2为-OH、-OMe、-OEt、-O-nPr、-O-iPr、-O-cPr、-OCF3、-OCF2H、-OCH2CF3，最优选R2为-OMe。
在一种式II化合物的实施方式中，R2是-SO2Rb或-SORb，其中Rb选自H、任选被卤素(优选氟)取代的C1-6烷基或任选被卤素(优选氟)取代的C3-6环烷基，优选任选被卤素(优选氟)取代的C1-6烷基，例如但不限于-SO2H、-SOMe、-SO2Me、-SOEt、-SO2Et、-SO-nPr、-SO2-nPr、-SO-iPr、-SO2-iPr、-SO-cPr、-SO2-cPr、-SO-nBu、-SO2-nBu、-SO-sec-Bu、-SO2-sec-Bu、-SO-iBu、-SO2-iBu、-SO-tBu、-SO2-tBu、-SO-cBu、-SO2-cBu、-SO-戊基、-SO2-戊基、-SO-异戊基、-SO2-异戊基、-SO-新戊基、-SO2-新戊基、-SO-己基、-SO2-己基、-SOCF3、-SO2CF3、-SOCF2H、-SO2CF2H、-SOCH2CF3、-SO2CH2CF3、-SO-cPrF、-SO2-cPrF等，优选R2为-SOMe、-SO-Et、-SO2-Me、-SO2-Et、-SOCF3、-SO2CF3。
在一种式II化合物的实施方式中，R2是-C(O)Rb或-CO2Rb，其中Rb如上文对-SO2Rb或-SORb中的Rb所定义。
在一种式II化合物的实施方式中，R2是C1-6烷基，例如但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2-乙基丁基；优选甲基、乙基、异丙基，它们任选被1、2或3个卤素(优选氟)、C1-6烷基(优选甲基、乙基或异丙基)、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)、C1-6烷硫基(优选甲硫基或乙硫基)或氨基取代；最优选甲基、乙基、异丙基、三氟甲基或环丙基。
在一种式II化合物的实施方式中，R2是C3-6环烷基或C3-6杂环基，例如但不限于环丙基、环丁基、环戊基或环己基，或四氢呋喃、四氢噻吩、氮杂环丁烷、吖啶、四氢吡咯、噻唑烷、噁唑烷、哌啶、哌嗪、吗啉、硫吗啉、噻嗪、咪唑烷等；优选环丙基；它们任选被1、2或3个卤素(优选氟)、羟基、巯基、C1-6烷基(优选甲基、乙基或异丙基)、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)、C1-6烷硫基(优选甲硫基或乙硫基)或氨基取代。
在一种式II化合物的实施方式中，R3和R4各自独立地选自H或卤素，优选F、Cl、Br或I；更优选F。
在一种式II化合物的实施方式中，R10是氢、卤素、氰基、硝基；以上对R2所定义的-NRaRb、-ORb、-SRb、C(O)Rb、CO2Rb、C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6杂环基；C2-6烯基、C2-6炔基、6-10元芳基、5-10元杂芳基；被一个或多个羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的C2-6烯基或C2-6炔基；被一个或多个羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的6-10元芳基或5-10元杂芳基。
在该实施方式中，R10优选5-6元杂芳基，包括但不限于吡唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、吡咯、咪唑、噁唑、异噁唑、三唑基、四唑、噁二唑、噻唑、异噻唑、噻二唑、呋喃、噻吩，以及这些杂芳基的饱和和部分不饱和形式，例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、咪唑烷、噁唑烷、噻唑烷、四氢呋喃等；吗啉、-氨基；C1-6烷基或C3-6环烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、异戊基、新戊基、环戊基、正己基、(2-或3-乙基)丁基、(2,3-二甲基)丁基、(2-丙基)丙基、环己基；C2-6烯基或C2-6炔基，包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、1、2或3-丁烯基、乙炔基、2-丙炔基、1、2或3-丁炔基；更优选吡唑、吡啶、-NH2、吗啉；R10最优选1H-吡唑-4基。
本发明第一方面式II化合物的一种实施方式为式II-a化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，
Figure GDA0003227487180000111
其中R1是C1-6烷基；
R2是卤素、氰基、任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基；或R2是-NRaRb、-SRb或-ORb；
R3和R4各自独立地选自H或卤素；
R10是-NRaRb、任选被一个或多个卤素取代的C3-6杂环基或任选被一个或多个卤素取代的5-10元杂芳基；
Ra和Rb各自独立地是H、任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素取代的3-6元环；
条件是R1和R2不同时为甲基。
在一种式II-a化合物的优选实施方式中，R1是C1-6烷基，优选甲基；R2是任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，或-ORb；R3和R4各自独立地选自卤素；R10是5-6元杂芳基，优选吡啶基或吡唑基；Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选F取代的C3-6环烷基；条件是R1和R2不同时为甲基。
在另一种式II-a化合物的优选实施方式中，R1是C1-6烷基，优选甲基；R2是-ORb，其中Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，R2优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙氧基、异丙氧基、三氟乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟；R10是5-6元杂芳基，优选吡啶基或吡唑基。
在另一种式II-a化合物的优选实施方式中，R1是C1-6烷基，优选甲基；R2是-ORb，其中Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，R2优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙氧基、异丙氧基、三氟乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟；R10是-NRaRb或C3-6杂环基，其中Ra或Rb各自独立地选自H、任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成3-6元环，R10优选-NH2或吗啉基。
本发明第一方面式II化合物的一种实施方式为式II-b化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，
Figure GDA0003227487180000121
其中X是-CR7R8-、＝CR7-、-CR7R8-CR7R8-或-CR7＝CR8-；
R6和R9各自独立地是H、卤素、-OH、C1-6烷基或C3-6环烷基；
R7和R8各自独立地是H、卤素、-OH、任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基，或连接于同一个碳原子上的R7和R8可以一起形成C3-6环烷基；
R2是卤素、氰基、任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基；或R2是-NRaRb、-SRb或-ORb；
R3和R4各自独立地选自H或卤素；
R10是-NRaRb、任选被一个或多个卤素取代的C3-6杂环基或任选被一个或多个卤素取代的5-10元杂芳基；
Ra和Rb各自独立地是H、任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素取代的3-6元环。
在一种式II-b化合物的优选实施方式中，X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-；R2是任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，或-ORb；R3和R4各自独立地选自卤素；R10是5-6元杂芳基，优选吡啶基或吡唑基；Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选F取代的C3-6环烷基。
在另一种式II-b化合物的优选实施方式中，X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-；R2是-ORb，其中Rb选自任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，R2优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙氧基、异丙氧基、三氟乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟；R10是5-6元杂芳基，优选吡啶基或吡唑基。
在另一种式II-b化合物的优选实施方式中，X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-；R2是-ORb，其中Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，R2优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙氧基、异丙氧基、三氟乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟；R10是-NRaRb或C3-6杂环基，其中Ra和Rb各自独立地选自H、任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素、优选氟取代的3-6元环，R10优选-NH2或吗啉基。
在一种式II-b化合物的优选实施方式中，X是＝CR7-或-CR7＝CR8-；R2是任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，或-ORb；R3和R4各自独立地选自卤素；R10是5-6元杂芳基，优选吡啶基或吡唑基；Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基。
在另一种式II-b化合物的优选实施方式中，X是＝CR7-或-CR7＝CR8-；R2是-ORb，其中Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，R2优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙氧基、异丙氧基、三氟乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟；R10是5-6元杂芳基，优选吡啶基或吡唑基。
在另一种式II-b化合物的优选实施方式中，X是＝CR7-或-CR7＝CR8-；R2是-ORb，其中Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，R2优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙氧基、异丙氧基、三氟乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；R3和R4各自独立地选自卤素；R10是-NRaRb或C3-6杂环基，其中Ra和Rb各自独立地选自H、任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素、优选氟取代的3-6元环，R10优选-NH2或吗啉基。
在以上式II-b化合物的各个优选实施方式中，R6和R9各自独立地是H、卤素、任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基；且R7和R8各自独立地是H、卤素、任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，或连接于同一个碳原子上的R7和R8可以一起形成C3-6环烷基。
本发明式II化合物涵盖以上各个独立、联合或任何组合或亚组合的实施方式，也涵盖以上任何优选、更优选或最优选定义的任何组合所构成的实施方式。
本发明第一方面还提供式III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，
Figure GDA0003227487180000141
其中R1是C1-6烷基或C3-6环烷基，其任选被一个或多个卤素、-ORa、-SRa、C1-6烷基或氨基取代；
R5是H、卤素、-ORa、-SRa、或任选取代的C1-6烷基，所述取代基选自一个或多个卤素、-ORa、-SRa、C1-6烷基或氨基；
或者R1和R5与它们所连接的原子一起形成具有以下通式的环状结构：
Figure GDA0003227487180000142
其中X是-CR7R8-、＝CR7-、-CR7R8-CR7R8-或-CR7＝CR8-；
R6、R7、R8和R9各自独立地是H、卤素、-ORa、-SRa、任选取代的C1-6烷基或任选取代的C3-6环烷基，其中所述取代基选自一个或多个卤素、-ORa、-SRa、C1-6烷基或氨基；或
连接于同一个碳原子上的R6和R9或R7和R8可以一起形成＝O或＝S，或与它们所连接的碳原子一起形成C3-6环烷基；
R2是-NRaRb或-ORb；
R3和R4各自独立地选自H、卤素、硝基、氰基、酰基或羧基；
R10是氢、卤素、氰基、硝基、-NRaRb、-ORb、-SRb、C(O)Rb、CO2Rb；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、C3-6杂环烷基、6-10元芳基、5-10元杂芳基；被一个或多个卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的C1-6烷基或C2-6烯基或C2-6炔基；被一个或多个羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的C3-6环烷基或C3-6杂环烷基；被一个或多个羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的6-10元芳基或5-10元杂芳基；
Ra和Rb各自独立地是H、任选被一个或多个卤素、CN或硝基取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、CN或硝基取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素、CN或硝基取代的3-6元环。
在一种式III化合物的实施方式中，R1为C1-6烷基，例如但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2-乙基丁基；优选甲基、乙基或异丙基，它们任选被1、2或3个卤素(优选氟)、羟基、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)、巯基、C1-6烷硫基(优选甲硫基或乙硫基)或氨基取代，最优选甲基。
在一种式III化合物的实施方式中，R1为C3-6环烷基，优选环丙基、环丁基、环戊基或环己基，它们任选被1、2或3个卤素(优选氟)、羟基、C1-6烷基(优选甲基、乙基或异丙基)、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)、巯基、C1-6烷硫基(优选甲硫基或乙硫基)或氨基取代，例如但不限于2-氟环丙基、2-和/或3-氟环丁基、2-和/或3-氟环戊基、2-、3-和/或4-氟环己基，或这些基团的相应位置被羟基、巯基、甲基、乙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、甲硫基、乙硫基或氨基取代的各基团。
在一种式III化合物的实施方式中，R5为H、卤素、羟基、C1-6烷氧基、巯基、C1-6烷硫基或C1-6烷基，例如但不限于H、氟、氯、溴、碘、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、甲基、乙基、丙基、异丙基、巯基、甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基等，任选被1、2或3个卤素(优选F)、C1-6烷氧基(优选甲氧基或乙氧基)、C1-6烷硫基(优选甲硫基或乙硫基)、C1-6烷基(优选甲基、乙基)或氨基取代；最优选R5是H。
在一种式III化合物的实施方式中，R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)结构，其中R6和R9各自独立地是H、卤素、羟基、巯基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或C3-6环烷基，且X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素、羟基、巯基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或C3-6环烷基。优选地，R6和R9各自独立地是H、卤素、C1-6烷基或C3-6环烷基，且X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素、C1-6烷基或C3-6环烷基。
在该实施方式中，还优选R6和R9之一和/或R7和R8之一为C3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在该实施方式中，还优选R6和R9之一或二者和/或R7和R8之一或二者为卤素，优选氟。
在该实施方式中，最优选地，R6和R9都是H，且X是-CR7R8-，其中R7和R8都是H；还最优选R6和R9都是H，且X是-CHF-或-CF2-；还最优选R6和R9都是H，且X是-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8都是H；还最优选R6和R9都是H，且X是-CH2-CF2-、-CH2-CHF-、-CHF-CHF-或-CF2-CF2-。
在一种式III化合物的实施方式中，R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)结构，其中R6和R9各自独立地是H、卤素、羟基、巯基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或C3-6环烷基，且X是＝CR7-或-CR7＝CR8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素、C1-6烷基或C3-6环烷基。更优选地，R6和R9各自独立地是H、卤素(优选氟)、C1-6烷基或C3-6环烷基，且X是＝CR7-或-CR7＝CR8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素(优选氟)、C1-6烷基或C3-6环烷基。
在该实施方式中，还优选R6和R9之一和/或R7和R8之一为C3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在一种式III化合物的实施方式中，R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)结构，其中X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中连接于同一个碳原子上的R6和R9或R7和R8一起形成＝O或＝S，或与它们所连接的碳原子一起形成环丙基、环丁基、环戊基或环己基；优选连接于同一个碳原子上的R7和R8一起形成环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在一种式III化合物的实施方式中，R2是-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地选自H、任选被一个或多个卤素(优选氟)取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素(优选氟)取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素、优选氟取代的3-6元环，Ra和Rb优选各自独立地选自H或C1-6烷基，具体的R2例如但不限于-NH2、-NH-Me、-NH-Et、-NH-nPr、-NH-iPr、-NH-cPr、-NH-nBu、-NH-sec-Bu、-NH-iBu、-NH-tBu、-NH-cBu、-NH-戊基、-NH-异戊基、-NH-新戊基、-NH-环戊基、-NH-己基、-NH-(2-或3-乙基)丁基、-NH-(2,3-二甲基)丁基、-NH-(2-丙基)丙基、-N(Me)2、-N(Me)(Et)、-N(Et)2、-N(Pr)2以及这些被取代的氨基上的烷基或环烷基被一个或多个卤素如氟取代的相应基团等，更优选Ra和Rb同时为H。
在一种式III化合物的实施方式中，R2是-ORb，其中Rb选自H、任选被一个或多个卤素(优选氟)取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素(优选氟)取代的C3-6环烷基，优选任选被卤素(优选氟)取代的C1-6烷基或任选被卤素(优选氟)取代的C3-6环烷基，具体的R2例如但不限于-OH、-OMe、-OEt、-O-nPr、-O-iPr、-O-cPr、-O-nBu、-O-sec-Bu、-O-iBu、-O-tBu、-O-cBu、-O-戊基、-O-异戊基、-O-新戊基、-O-己基、-O-(2-或3-乙基)丁基、-O-(2,3-二甲基)丁基、-O-(2-丙基)丙基、-OCF3、-OCF2H、-OCH2CF3、-O-cPrF等，优选的R2为-OH、-OMe、-OEt、-O-nPr、-O-iPr、-O-cPr、-OCF3、-OCF2H、-OCH2CF3，最优选R2为-OMe。
在一种式III化合物的实施方式中，R3和R4各自独立地选自H或卤素，优选F、Cl、Br或I；更优选F。
在一种式III化合物的实施方式中，R10是氢、卤素、氰基、硝基；以上式II化合物定义中对R2所具体定义的-NRaRb、-ORb、-SRb、C(O)Rb、CO2Rb、C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6杂环基；C2-6烯基、C2-6炔基、6-10元芳基、5-10元杂芳基；被一个或多个羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的C2-6烯基或C2-6炔基；被一个或多个羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或氨基取代的6-10元芳基或5-10元杂芳基。
在该实施方式中，R10优选5-6元杂芳基，包括但不限于吡唑、吡啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、吡咯、咪唑、噁唑、异噁唑、三唑基、四唑、噁二唑、噻唑、异噻唑、噻二唑、呋喃、噻吩，以及这些杂芳基的饱和和部分不饱和形式，例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、咪唑烷、噁唑烷、噻唑烷、四氢呋喃等；吗啉、-氨基；C1-6烷基或C3-6环烷基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、正戊基、异戊基、新戊基、环戊基、正己基、(2-或3-乙基)丁基、(2,3-二甲基)丁基、(2-丙基)丙基、环己基；C2-6烯基或C2-6炔基，包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、1、2或3-丁烯基、乙炔基、2-丙炔基、1、2或3-丁炔基；更优选吡唑、吡啶、-NH2、吗啉；R10最优选1H-吡唑-4基。
本发明第一方面式III化合物的一种实施方式为式III-a化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，
Figure GDA0003227487180000171
其中R1是C1-6烷基；
R2是-NRaRb或-ORb；
R3和R4各自独立地选自H或卤素；
Ra和Rb各自独立地是H、任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素取代的3-6元环。
在一种式III-a化合物的优选实施方式中，R1是C1-6烷基，优选甲基；R2是-ORb，其中Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选F取代的C3-6环烷基，R2优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙氧基、异丙氧基、三氟乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟。
在另一种式III-a化合物的优选实施方式中，R1是C1-6烷基，优选甲基；R2是-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地是H、任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素、优选氟取代的3-6元环；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟。
本发明第一方面式III化合物的一种实施方式为式III-b的化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，
Figure GDA0003227487180000181
其中R2是-NRaRb或-ORb；
X是-CR7R8-、＝CR7-、-CR7R8-CR7R8-或-CR7＝CR8-；
R6和R9各自独立地是H、卤素、-OH、C1-6烷基或C3-6环烷基；
R7和R8各自独立地是H、卤素、-OH、任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基，或连接于同一个碳原子上的R7和R8可以一起形成C3-6环烷基；
R3和R4各自独立地选自H或卤素；
Ra和Rb各自独立地是H、任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素取代的3-6元环。
在一种式III-b化合物的优选实施方式中，X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-；R2是-ORb，其中Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选F取代的C3-6环烷基，R2优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙氧基、异丙氧基、三氟乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟。
在另一种式III-b化合物的优选实施方式中，X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-；R2是-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地是H、任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素、优选氟取代的3-6元环；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟。
在一种式III-b化合物的优选实施方式中，X是＝CR7-或-CR7＝CR8-；R2是-ORb，其中Rb选自任选被一个或多个卤素、优选F取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选F取代的C3-6环烷基，R2优选甲氧基、乙氧基、丙氧基、环丙氧基、异丙氧基、三氟乙氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟。
在另一种式III-b化合物的优选实施方式中，X是＝CR7-或-CR7＝CR8-；R2是-NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地是H、任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，或Ra和Rb与它们所连接的N一起形成任选被一个或多个卤素、优选氟取代的3-6元环；R3和R4各自独立地选自卤素，优选氟。
在以上式III-b化合物的各个优选实施方式中，R6和R9各自独立地是H、卤素、任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基；且R7和R8各自独立地是H、卤素、任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素、优选氟取代的C3-6环烷基，或连接于同一个碳原子上的R7和R8可以一起形成C3-6环烷基。
本发明式III化合物涵盖以上各个独立、联合或任何组合或亚组合的实施方式，也涵盖以上任何优选、更优选或最优选定义的任何组合所构成的实施方式。
优选的式I化合物选自以下结构列表
Figure GDA0003227487180000191
Figure GDA0003227487180000201
Figure GDA0003227487180000211
Figure GDA0003227487180000221
或其异构体，或它们药学上可接受的盐或溶剂合物。
最优选的本发明化合物选自以下化合物：
Figure GDA0003227487180000222
Figure GDA0003227487180000231
本发明涵盖式I、II、III化合物及其优选实施方式的药学上可接受的盐，即无毒的、生物学上可耐受的或其他生物学上适合于给予治疗个体的本发明化合物的盐。上述本发明式I、II、III化合物属于胺类化合物，因此与许多无机酸或有机酸反应可形成药学上可接受的盐，例如包括但不限于与盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、硝酸、甲酸、乙酸、丙酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苯甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、肉桂酸酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、水杨酸等形成的盐。这类药学上可接受的酸加成盐及其常用制备方法是本领域众所周知的，一般参见例如S.M.Berge等人，“PharmaceuticalSalts”,J.Pharm.Sci.,1977,66:1-19,以及Handbook of Pharmaceutical Salts,Properties,Selection,and Use,Stahl和Wermuth编，Wiley-VCH and VHCA,Zurich,2002。
优选的本发明式I、II、III化合物的药学上可接受的盐是它们与对甲苯磺酸、苯磺酸和甲磺酸形成的盐。
应当了解，本文所描述的化合物，除非特别说明，涵盖且包括本发明化合物的所有异构体和稳定同位素变体，例如氘代化合物。本文中提供的化合物的所有同位素变体，无论是否有放射性，均应当包含在本发明的范围内。
还应当了解，式I、II、III化合物或其药学上可接受的盐可以以溶剂合物形式分离，因此任何该类溶剂合物均纳入本发明范围内。在适合或可行的情况下，式I、II、III化合物还可以以其前药形式存在，式I、II、III化合物的药学上可接受的前药具有化学上或代谢上可裂解的基团并且通过溶剂分解或在生理条件下在体内变成具有药物活性的式I、II、III化合物，其可以以常规方式并借助于化合物的官能团来形成。
本文所用的术语“C1-6烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子、优选1至4个碳原子、更优选1至3个碳原子的饱和直链或支链单价基团。实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2-乙基丁基。
本文所用的术语“C1-6烷氧基”是指-O-C1-6烷基基团，其中C1-6烷基如上文所定义。
本文所用的术语“C1-6烷硫基”是指-S-C1-6烷基基团，其中C1-6烷基如上文所定义。
本文所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘，优选是氟或氯。
本文所用的术语“氨基”是指-NH2、-NH-C1-6烷基或-N-(C1-6烷基)2，其中C1-6烷基如本文所定义。
本文所用的术语“C3-6环烷基”是指含有3、4、5或6个环碳原子的饱和环状烷基。实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基。所述环烷基任选被选自羟基或上文所定义的氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤素的取代基取代。
本文所用的术语“C3-6杂环基”是指含有3、4、5或6个环碳原子的饱和环状烷基，其除了包含至少三个碳原子外，还包含至少一个、例如1-3个或例如1或2个选自O、S和N的杂原子。C3-6杂环基的连接点可以在杂原子上或在碳原子上。杂环基的实例包括但不限于四氢呋喃、四氢噻吩、氮杂环丁烷、四氢吡咯、噻唑烷、噁唑烷、哌啶、哌嗪、吗啉、硫吗啉、噻嗪等。所述C3-6杂环基任选被羟基或选自上文所定义的氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基或卤素的取代基取代。
本文所有的术语“芳基”表示包含6至10个碳环原子的一价芳族碳环单环或双环环系。芳基部分的实例包括苯基和萘基。苯基是优选的芳基。所述芳基任选被羟基或选自上文所定义的氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或卤素的取代基取代。
本文所用的术语“5-10元杂芳基”表示具有5至10个环原子的一价芳族单环或双环环系，其包含1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，其余环原子为碳。杂芳基的连接点可以在杂原子上或在碳原子上。杂芳基部分的实例包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、吖庚因基、二吖庚因基、异噁唑基、苯并呋喃基、异噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、异苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基或喹喔啉基；优选5至6个环原子的一价芳族单环环系，其包含1-3个选自N、O和S的杂原子，其余环原子为碳。优选的5-6元杂芳基部分的实例包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基或异噁唑基。上述杂芳基任选被羟基或选自上文所定义的氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基或卤素的取代基取代。
本文所用的术语“硝基”是指-NO2基团。
本文所用的术语“氰基”是指-CN基团。
本文所用的术语“酰基”是指-C(O)R，其中R是指上文所定义的C1-6烷基。
本文所用的术语“巯基”是指-SH基团。
本文所用的术语“C1-6烷基磺酰基”是指-S(O)2-C1-C6烷基。
本文所用的术语“C1-6烷基亚磺酰基”是指-S(O)-C1-C6烷基。
本文所用的术语“羧基”是指–C(O)-OH基团。
本文所用的术语“溶剂合物”是指包含化学计量的或非化学计量的溶剂的溶剂加成形式，包括本发明化合物的任何溶剂化形式，包括例如与水的溶剂合物，例如水合物，或与有机溶剂的溶剂合物，例如甲醇、乙醇或乙腈，即分别作为甲醇化物、乙醇化物或乙腈化物；或为任何多晶型物的形式。应当理解的是，本发明化合物的这类溶剂合物还包括本发明化合物的药学上可接受盐的溶剂合物。
本文所用的术语“异构体”涵盖本发明式I、II、III化合物在结构上可能存在的任何“立体异构体”、“外消旋物”、“几何异构体”和/或“互变异构体”，所述异构体立体化学的确定和分离方法为本领域技术人员所熟知，故本发明涵盖上文所定义化合物的所有可能的异构体形式，及其药学可接受的盐或溶剂合物。
本发明还涵盖本文所定义化合物的“同位素变体”。本文中使用的术语“同位素变体”是指构成该化合物的一或多个原子上含有非天然比例同位素的化合物，例如一个化合物的“同位素变体”可以含有一或多个非放射性同位素，例如氘(2H或D)、碳-13(13C)、氮-15(15N)等。应当理解，在含有此类同位素取代基的化合物中，如果存在的话，下列原子可以改变，例如任何氢可以是2H/D，任何碳可以是13C，或任何氮可以是15N，此类原子的存在和安置由本领域技术人员确定。同样，本发明包括含有放射性同位素的本发明化合物同位素变体的制备，在此情况下，例如获得的化合物可以用作药物和/或底物组织分布研究。放射性同位素氚(即3H)和碳-14(即14C)可以特别用于该目的，因为它们易于结合并且有现成的检测方法。另外，可以制备被正电子发射同位素(例如11C、18F、15O和13N)取代的化合物，它们可以用于正电子断层扫描(PET)研究用于底物受体占有率检测。
本发明所定义的式I、II、III化合物是Trk抑制剂。如下文活性实施例部分所示，本发明的式I、II、III化合物、尤其是本发明实施例的化合物在所示细胞测定法中显示对多种NTRK基因融合的抑制作用，IC50在0.1nM～10μM范围，优选在0.1nM～0.5μM范围。故本发明化合物可用于治疗或预防可通过抑制Trk来治疗的疾病或病症或Trk活性在其中扮演角色或牵涉的疾病或病症，尤其是通过抑制Trk来治疗或预防肿瘤或癌症，尤其可靶向治疗荷有NTRK基因融合的肿瘤或癌症患者。
除显示Trk抑制活性外，本发明的式I、II、III化合物及其药学上可接受的盐、尤其是实施例化合物，因为其结构上的改良，还显示出相比现有技术已有的Trk抑制剂具有改善的活性靶点分布以及抗癌适应症和效果；具有改进的溶解和分散性能，有利于制备更简单和经济化的制剂；具有改进的P450(例如2C8和2C9等)抑制活性，从而具有较少的潜在药物相互作用；具有改进的代谢稳定性；减少代谢活性中间体(M1和/或M2，Oncotarget,2018,9(17),13796-13806)的形成，从而降低毒副作用，提供更为友好的成药性能。
此外，本发明人还考察了本发明化合物对其他各种激酶的抑制活性，结果表明：本文所定义的本发明化合物除了抑制TRKA、TRKB、TRKC激酶的活性外，还抑制其它确认的、研究中的、正在出现的诸多抗癌药激酶靶点(ROS1、RAF1、PDGFRB、CSF1R、LCK、IKKa、IKKb、PLK、AXL、TIE、LOK、TIE1、DDR)以及应用中的抗癌药靶点和它们的抗药突变体靶点(FLT3、FLT3(N841I)、FLT3(K663Q)、FLT3(D835V)、FLT3(ITD)、KIT、KIT(L576P)、KIT(V559D)、KIT(V559D,T670I)、MET、MET(Y1235D)、MET(Y1250T)、RET、RET(M918T)等，在激酶活性测定中对包括上述在内的众多激酶显示>90％的抑制活性，具体参见下文活性实施例部分的表10，因此在临床应用中将会表现出广谱抗癌效果。
因此，本发明第二方面提供用作药物、尤其是用作Trk抑制剂的以上定义的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物。
本发明第二方面还提供用作药物、尤其是用作本文表10所列激酶的抑制剂的以上定义的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物。
在具体实施方式中，本发明提供通过抑制Trk而用作抗癌药物的以上定义的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物。
本发明第三方面提供用于治疗或预防哺乳动物肿瘤或癌症的方法，包括将有效量的以上定义的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物或包含有效量的以上定义的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物的药物组合物施用于有需要的哺乳动物。
本发明第四方面提供用于治疗或预防肿瘤或癌症的药物组合物，包含以上定义的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，以及可药用载体、稀释剂或赋形剂。
本发明第五方面提供以上定义的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物在制备用于治疗或预防其中Trk活性扮演角色或被牵涉的疾病或病症的药物中的用途。优选地，本发明提供以上定义的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物在制备通过抑制Trk来治疗或预防肿瘤或癌症、尤其下文所定义肿瘤或癌症的药物中的用途；具体地，所述癌症荷有NTRK基因融合。
本发明第五方面还提供以上定义的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物在制备用于治疗或预防其中本文表10所列激酶扮演角色或被牵涉的疾病或病症的药物中的用途。优选地，本发明提供以上定义的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物在制备通过介导本文表10所列激酶来治疗或预防肿瘤或癌症、尤其下文所定义肿瘤或癌症的药物中的用途。
本发明第六方面提供药物组合，包含并行或相继施用的本发明的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物以及一种或多种通过相同或不同作用机制发挥作用的其他药物。所述其他药物的实例例如但不限于其他Trk抑制剂、激酶抑制剂、抗炎药、镇痛药、类鸦片物质、抗癌化疗剂以及抗体药。
在优选的实施方案中，对于本发明化合物、组合物、方法和用途而言的“Trk”为TrkA、TrkB或TrkC的任何一个；在更优选的实施方案中，对于本发明化合物、组合物、方法和用途而言的“Trk”为TrkA、TrkB或TrkC，或其中的至少两个。
对于上述用作药物的本发明化合物、本发明方法、药物组合物、药物组合或用途而言，式I的化合物优选
Figure GDA0003227487180000271
其中R1是C1-6烷基；
R2是任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或C3-6环烷基；
R3和R4各自独立地选自H或卤素；且
条件是R1和R2不同时为甲基；
或其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物；
或
Figure GDA0003227487180000281
其中R2是任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或C3-6环烷基；
R3和R4各自独立地选自H或卤素；
R6和R9各自独立地是H、卤素、羟基、C1-6烷基或C3-6环烷基，且
X是-CR7R8-或-CR7R8-CR7R8-，其中R7和R8各自独立地是H、卤素、羟基、C1-6烷基或C3-6环烷基，或连接在同一个碳原子上的R7和R8一起形成C3-6环烷基；或其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物。
对于上述用作药物的本发明化合物、本发明方法、药物组合物、药物组合或用途而言，还优选上文所定义的式II-a、II-b、III-a、III-b化合物及其优选的实施方式；更优选上文所列的具体化合物，即化合物1～化合物50；最优选上文所列的“最优选的本发明化合物”、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物。
上文所用的术语“癌症”或“肿瘤”是指赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，和所有的癌前期细胞和癌细胞和组织。对本发明的化合物、方法、药物组合物及用途而言，所述癌症或肿瘤包括但不限于肉瘤(尤其婴儿纤维肉瘤癌)、皮肤癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、唾液腺癌、多发性骨髓瘤、星形细胞瘤和成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、肺腺癌、大细胞神经内分泌肿瘤、头颈癌以及结肠直肠癌、胆管癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、分泌性乳腺癌、乳腺分泌型癌、急性髓样白血病、先天性中胚层肾瘤、先天性纤维肉瘤、急性成淋巴细胞性白血病、结肠腺癌、胃肠道间质瘤。对本发明的化合物、方法、药物组合物及用途而言，所述癌症或肿瘤优选是肺腺癌、肝内胆管癌、结直肠癌、乳头状甲状腺癌、spitzoid肿瘤、成胶质细胞瘤、肉瘤、星形细胞瘤、头颈癌、低级胶质瘤、分泌性乳腺癌、急性髓性白血病、先天性中胚层肾瘤、先天性纤维肉瘤、急性成淋巴细胞性白血病、结肠腺癌、甲状腺癌、皮肤黑素瘤和小儿胶质瘤。
对本发明的化合物、方法、药物组合物及用途而言，优选地，所述癌症或肿瘤为Trk活性在其中扮演角色或牵涉的癌症或肿瘤、或可以使用Trk抑制剂治疗的癌症或肿瘤、或由NTRK基因融合导致的癌症或肿瘤，包括但不限于上述肿瘤类型以及其优选范围。
本文所用的术语“治疗”是指给患有所述疾病、或者具有所述疾病的症状的哺乳动物、例如人施用一种或多种本文所述的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物用以治愈、缓解、减轻或影响所述疾病、所述疾病的症状。在本发明实施方案中，所述疾病是上文所定义的肿瘤或癌症。
本文所用的术语“预防”在本领域中是众所周知的，是给怀疑患上或易感于如本文所定义的癌症或肿瘤的哺乳动物、例如人施用一种或多种本文所述的式I、II、III化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，使得罹患所定义疾病的风险降低。术语“预防”包含在诊断或确定任何临床和/或病理症状以前使用本发明的化合物。
本文所用的术语“有效量”是指通常足以对需要治疗的肿瘤患者产生有益治疗效果的量或剂量。本领域技术人员可以通过常规方法、结合常规影响因素来确定本发明中活性成分的有效量或剂量。
本文所用术语“哺乳动物”包括但不限于豚鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、仓鼠以及包括人在内的灵长类动物。
上述本发明药物组合物，可以通过本领域技术人员已知的技术来配制，如在Remington’s Pharmaceutical Sciences第20版中公开的技术。本发明的药物组合物可以通过任何方便的途径、以任何方便的施用形式使用。例如，可以经胃肠道、经鼻、经肺、经肌肉或脉管系统或经皮施用，施用形式可以是片剂、粉剂、胶囊、溶液、分散液、混悬液、糖浆、喷雾剂、栓剂、凝胶、乳剂、贴片等。这些药物组合物可以含有药物制剂中的常规成分，如稀释剂、载体、pH调节剂、甜味剂、崩解剂等。
本发明的化合物可以作为唯一的活性成分进行施用，也可以与另外的药物或疗法组合进行施用，所述另外的药物或疗法可以具有或产生相同或不同的药理学功效。例如，所述另外的药物包括但不限于其他Trk抑制剂、激酶抑制剂、抗体药、免疫治疗剂、其它抗癌剂、抗炎药、镇痛药、心血管药物、降脂药、抗菌剂、抗病毒剂、抗糖尿病药、抗增殖剂、抗血管生成剂或抗过敏剂等。这些药物和疗法都是本领域技术人员已知的。
当式I、II、III化合物与其它药物组合施用时，共施用的其它药物的剂量当然将根据所用的共用药物的类型、所用具体药物、待治疗的病症、患者的一般健康状况、医师或兽医的判断等因素而变化。
本发明的化合物还可以与抗肿瘤疗法组合，所述抗肿瘤疗法包括但不限于手术、辐射治疗、移植(例如干细胞移植、骨髓移植)、肿瘤免疫疗法和化疗等。
与本发明组合使用的药物、即共用药物可以与本发明的化合物通过相同或不同的施用途径同时、分别或依次地进行施用。它们可以被包含在同一药物组合物中，也可以是单独形式、例如组合产品,优选为药盒形式。它们可以由相同或不同的制造商制备和/或配制。而且，本发明的化合物和另外的药物可以(i)在将组合产品发送给医师之前(例如在包含本发明的化合物和另外的药物的药盒的情形中)；(ii)在临施用前由医师自身(或在医师指导下)；(iii)由患者自身、例如在本发明的化合物和另外药物的依次施用期间一起加入组合治疗中。
本发明第七方面提供本发明式I化合物的制备方法，其包括：
(a)将式A化合物
Figure GDA0003227487180000301
与式B化合物在缩合剂存在下进行反应，以形成酰胺，
Figure GDA0003227487180000302
得到式C化合物
Figure GDA0003227487180000303
或(a’)将式A化合物
Figure GDA0003227487180000304
与式D化合物在缩合剂存在下进行反应，以形成酰胺，
Figure GDA0003227487180000311
得到式E化合物
Figure GDA0003227487180000312
再将式E化合物进行铃木(Suzuki)偶联反应，得到式C化合物；
以及
(b)将式C化合物脱保护，得到式I化合物
Figure GDA0003227487180000313
其中R1至R5如上文所定义。
在步骤(a)和(a’)中，形成酰胺的反应可以通过本领域已知的缩合反应条件下进行，例如可以通过本领域已知的肽偶联反应条件进行。
优选地，在步骤(a)和(a’)中，形成酰胺的反应可以在EDCI、HCl、HOBT和DIPEA存在下、在适合的溶剂(例如DMF)中进行反应。
式A化合物可如下制备：
(1)将式1化合物
Figure GDA0003227487180000321
与式2化合物反应
Figure GDA0003227487180000322
得到式3化合物
Figure GDA0003227487180000323
(2)将式3化合物与式4化合物反应
Figure GDA0003227487180000324
得到式5化合物
Figure GDA0003227487180000325
(3)向式5化合物中加入浓H2SO4/H2O，反应得到式A化合物
Figure GDA0003227487180000326
其中R2和R4如上文所定义。
式A化合物还可以如下制备为式A-2形式：
(1)将式A-2-1化合物
Figure GDA0003227487180000331
与式A-1-1化合物反应，
Figure GDA0003227487180000332
得到A-2-2化合物，
Figure GDA0003227487180000333
(2)将A-2-2化合物与A-2-3化合物反应，
Figure GDA0003227487180000334
得到A-2-4化合物，
Figure GDA0003227487180000335
(3)将A-2-4化合物与A-2-5化合物反应
Figure GDA0003227487180000336
得到A-2-6化合物，
Figure GDA0003227487180000337
(4)将A-2-6化合物还原，例如加氢还原，脱去甲硫基，得到A-2-7化合物
Figure GDA0003227487180000341
(5)将A-2-7化合物水解，得到A-2-8化合物
Figure GDA0003227487180000342
(6)将A-2-8化合物的氨基转化为卤素，得到A-2-9化合物，
Figure GDA0003227487180000343
(7)将A-2-9化合物中卤素亲核取代，例如用亲核试剂R11X-Na(X可为O，S，C，N等)取代，得到A-2化合物，
Figure GDA0003227487180000344
其中R4如上文所定义，R15选自C1-6烷基、苄基、α-甲基苄酯、或对甲氧基苄酯等。R11选自H、被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基。
式A化合物也可以如下制备：
(1)将式A-3-1化合物
Figure GDA0003227487180000345
与式Z-R2化合物、例如R2I、R2Br、R2Cl、R2B(OH)2、R2NH、R2OH、R2SH、Togni试剂、二氟卡宾试剂反应，例如但不限于取代、缩合、偶联反应，得到A-3-2化合物，
Figure GDA0003227487180000351
(2)将A-3-2化合物氧化，例如用过氧化物氧化，得到A-3-3化合物，
Figure GDA0003227487180000352
(3)将A-3-3化合物重排后得到A-3-4化合物，
Figure GDA0003227487180000353
(4)将A-3-4化合物与A-3-5化合物反应，例如Chen-Lam反应、Ullmann反应，Z’为B(OH)2、I或Br，
Figure GDA0003227487180000354
得到A-3-6化合物，
Figure GDA0003227487180000355
(5)将A-3-6化合物水解，得到A-3化合物
Figure GDA0003227487180000356
其中R2和R4如上文所定义，R15选自C1-6烷基、苄基、或取代的苄基等；Togni试剂为1-(三氟甲基)-3,3-二甲基-1,2-苯并碘氧杂戊环(CAS号：887144-97-0)，且二氟卡宾试剂选自本领域技术人员所熟知的此类试剂，包括但不限于有机硅试剂如TMSCF2X(X选自卤素如氟、氯、溴、碘)和2,2-二氟-2-氟磺酰乙酸。
当式B化合物中的R5是H时，式B化合物为式B-1化合物:
Figure GDA0003227487180000361
式B-1化合物可如下制备，包括：
(1)将式6化合物进行溴化反应，
Figure GDA0003227487180000362
得到式7化合物，
Figure GDA0003227487180000363
(2)将式7化合物与式8化合物反应，
Figure GDA0003227487180000364
得到式9化合物
Figure GDA0003227487180000365
(3)将式9化合物与R1-NHNH2进行反应，得到式10化合物
Figure GDA0003227487180000371
(4)将式10化合物进行环化反应，得到式11化合物，
Figure GDA0003227487180000372
(5)将式11化合物进行铃木偶联反应，得到式12化合物，
Figure GDA0003227487180000373
(6)将式12化合物进行氢化，例如在钯碳存在下反应，得到式B-1化合物，
Figure GDA0003227487180000374
其中R1和R3如上文所定义。
当式D化合物中的R5是H时，式D化合物为式D-1化合物:
Figure GDA0003227487180000375
式D-1化合物可通过式11化合物进行氢化，例如在钯碳存在下反应而制备。
当式B化合物中的R5不是H时，式B化合物可以是式B-2化合物:
Figure GDA0003227487180000381
式B-2化合物可如下制备，包括：
(1)将式16化合物
Figure GDA0003227487180000382
形成式17的吲哚醌，例如将式16化合物与三氯乙醛和羟胺在盐酸催化下反应、然后在浓硫酸或路易斯酸(如三氟化硼等)作用下得到式17化合物，
Figure GDA0003227487180000383
(2)将式17化合物进行选择性还原反应，例如用水合肼或者用四氯化钛和金属锌处理，得到式18化合物，
Figure GDA0003227487180000384
(3)将式18化合物先后与R7X、R8X反应，其中X为卤素(优选溴或碘)，得到式19化合物(其中R7和R8如上文所定义，各自独立地是任选取代的C1-6烷基或C3-6环烷基)；或与DAST(二乙胺基三氟化硫)反应，得到式19化合物(其中R7和R8为氟)，
Figure GDA0003227487180000385
(4)将式19化合物还原，例如在氢化锂铝或硼烷存在下，得到式20化合物，
Figure GDA0003227487180000391
然后，将式20化合物进行重氮化反应，然后环合，得到式21化合物，例如将式20化合物在强酸(例如四氟硼酸)存在下，与重氮化试剂(例如亚硝酸钠))反应，然后在醋酸钾、18-冠-6和适当溶剂(例如三氯甲烷)存在下进行环化反应，得到式21化合物(其中R6和R9均为H)；
Figure GDA0003227487180000392
或者(4’)①将式19化合物与Lawesson试剂(劳森试剂)反应，从而将羰基化合物转化为硫代羰基化合物，或者将式19化合物与用含R6和R9结构部分的有机金属化合物(例如采用格氏试剂)反应，从而引入R6和R9结构部分，或者不进行处理，直接进行第②步反应；
②将第一步处理得到的产物或直接将式19的化合物进行重氮化反应，然后环合，得到式21化合物，例如将第一步处理得到的产物或式19化合物在强酸(如四氟硼酸)存在下，与重氮化试剂(如亚硝酸钠)反应，然后在醋酸钾、18-冠-6和适当溶剂(例如三氯甲烷)存在下进行环化反应，得到式21化合物(其中连接于同一个碳原子上的R6和R9一起形成＝S；或者R6和R9如上文所定义，各自独立地是任选取代的C1-6烷基或C3-6环烷基；或者连接于同一个碳原子上的R6和R9一起形成＝O)，
(5)将式21化合物进行脱甲基化反应，例如在三溴化硼存在下进行，得到式22化合物，
Figure GDA0003227487180000393
(6)将式22化合物与式8化合物进行反应，例如在碳酸钾存在下、在适当的溶剂中进行反应，
Figure GDA0003227487180000394
得到式23化合物
Figure GDA0003227487180000401
(7)将式23化合物进行铃木偶联反应，得到式24化合物
Figure GDA0003227487180000402
(8)将式24化合物进行氢化，例如在钯碳存在下反应，得到式B-2化合物
Figure GDA0003227487180000403
其中R3、R6、R7、R8和R9如上文所定义，除非上下文已经具体指明或化学上不可实现。
式B-2化合物也可以如下制备为式B-2-18和B-2-19化合物：
(1)将式B-2-1化合物
Figure GDA0003227487180000404
在酸催化下与三氯乙醛和羟胺反应，得到B-2-2化合物，
Figure GDA0003227487180000405
(2)将B-2-2化合物在酸性条件下如在硫酸作用下关环，生成B-2-3化合物，
Figure GDA0003227487180000411
(3)将B-2-3化合物水解脱羧，得到B-2-4化合物，
Figure GDA0003227487180000412
(4)将B-2-4化合物酯化，得到B-2-5化合物，
Figure GDA0003227487180000413
(5)将B-2-5化合物用亚硝酸盐或酯处理，得到吲唑B-2-6化合物，
Figure GDA0003227487180000414
(6)将B-2-6化合物的吲唑保护，例如用THP保护，得B-2-7化合物，
Figure GDA0003227487180000415
(7)还原B-2-7化合物，得到B-2-8化合物，
Figure GDA0003227487180000421
(8)将B-2-8化合物中的羟基活化，得到B-2-9化合物，
Figure GDA0003227487180000422
(9)将B-2-9化合物与TMS-CN反应，得到B-2-10化合物，
Figure GDA0003227487180000423
(10)选择性还原B-2-10化合物，得到醛B-2-11，
Figure GDA0003227487180000424
(11)继续还原B-2-11化合物至醇B-2-12，
Figure GDA0003227487180000425
(12)活化B-2-12化合物中的羟基，同时脱去保护基R13，得到B-2-13化合物，
Figure GDA0003227487180000431
(13)将B-2-13化合物在碱作用下关环，产生B-2-14化合物，
Figure GDA0003227487180000432
(14)将B-2-14化合物在酸作用下脱甲基，生成酚B-2-15，
Figure GDA0003227487180000433
(15)将B-2-15化合物与化合物8在碱性条件下反应
Figure GDA0003227487180000434
生成B-2-16化合物
Figure GDA0003227487180000435
(16)将化合物B-2-16偶联，例如在钯催化下与有机硼试剂偶联，生成B-2-17化合物，
Figure GDA0003227487180000441
(17)还原B-2-17化合物中的硝基，得B-2-18化合物，
Figure GDA0003227487180000442
(18)将上述反应13-17步中的任何产物进行氧化芳构化，依上述相同的合成路线可以得到B-2-19化合物
Figure GDA0003227487180000443
其中R3如上文所定义；其中R12选自C1-6烷基，例如甲基；R13为N保护基，例如但不限于THP；R14为OH活化基，例如但不限于Ms；X为离去基团，如OMs、OTs、氯、溴，优选氯。
当式D化合物中的R5不是H时，式D化合物可以是式D-2化合物:
Figure GDA0003227487180000444
式D-2化合物可通过式23化合物进行氢化，例如在钯碳存在下反应而制备。
本发明的式II化合物以及式III化合物可以参考以上合成路线、由本领域技术人员类似地制备。如果没有特别说明，以上合成路线中所用的原料或中间体可以由本领域技术人员商购获得或通过本领域已知的方法常规获得。
本文所述的铃木偶联反应是将卤代芳烃(例如溴代芳烃)与有机硼试剂(例如芳基硼酸酯或芳基硼酸)，在钯催化剂(优选PdCl2(dppf)或PdCl2Di-t-BPF)的存在下，在已知的铃木偶联反应条件下进行反应。所述芳基硼酸酯优选是
Figure GDA0003227487180000451
本文所用的有机硼试剂是通过本领域已知的方法制备的。
本文所用的术语“缩合剂”包括但不限于碳二亚胺缩合剂，例如1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDCI)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)，光气衍生物如N,N'-羰基二咪唑(CDI)或氯甲酸异丁酯，磷化合物如正丙烷膦酸酐(PPA)、氰基膦酸二乙酯、二苯基磷酰叠氮化物(DPPA)、双(2-氧代-3-噁唑烷基)磷酰氯、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐或苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐(PyBOP)，脲鎓化合物，例如O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU)、2-(2-氧代-1-(2H)-吡啶基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TPTU)，所述试剂任选与其它助剂，如1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)，以及作为碱的碱金属碳酸盐，例如碳酸钠或碳酸钾，或叔胺碱如三乙胺、N,N-二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉(NMM)、N-甲基哌啶(NMP)、吡啶或4-N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)组合。式I化合物的制备在以下通用合成方法和实施例中进一步详述。
通用合成方法
本发明的式I、II、III化合物或其溶剂合物或其药学上可接受的盐可以通过多种方法、包括下文给出的方法、实施例中给出的方法或与之类似的方法制备。下文举例说明了合成本发明化合物的通用合成方案。对于各反应步骤而言适当的反应条件是本领域技术人员已知的或可以常规确定的。在制备这些化合物中使用的原料和试剂通常可商购获得，或者可以通过下文的方法、与下文给出的方法类似的方法或本领域已知的方法制得。如果需要，合成反应流程中的原料和中间体可以采用常规技术进行分离和纯化，所述技术包括但不限于过滤、蒸馏、结晶、色谱法等。所述材料可以采用包括物理常数和波谱数据在内的常规方法表征。
本领域技术人员能认识到式I、II、III化合物中是否存在立体中心。在反应的所有阶段，所形成的异构体的混合物可被分离成单个异构体，例如非对映异构体或对映异构体，或者分离成任何所需的异构体混合物，例如外消旋物或非对映异构体的混合物，参见例如E.L.Eliel,S.H.Wilen和L.N.Mander的“Stereochemistry of Organic Compounds”(Wiley-Interscience,1994)。
用于合成本发明的化合物的方法步骤可以在本身已知的反应条件(包括具体提及的那些条件)下、在不存在或通常在存在溶剂或稀释剂(包括例如对所用试剂而言是惰性的且可溶解所用试剂的溶剂或稀释剂)的情况下、在不存在或存在催化剂、缩合剂或中和剂(例如离子交换剂，如阳离子交换剂，例如H+形式)的情况下、根据反应和/或反应物的性质在降低的、正常的或升高的温度(例如约-100℃至约190℃，包括例如约-78℃至约150℃，例如约0℃至约125℃、室温、-20至40℃或回流温度)下、在大气压力下或在密闭容器中、当适宜时在加压下、和/或在惰性气氛例如氩气或氮气气氛下进行。
除非在方法的描述中另有说明，否则适用于任何特定反应的那些溶剂的溶剂包括：具体提及的那些溶剂，或者例如水；酯类，如低级链烷酸低级烷基酯，例如乙酸乙酯；醚类，如脂肪族醚，例如乙醚，或环状醚，例如四氢呋喃或二噁烷；液体芳族烃类，如苯或甲苯；醇类，如甲醇、乙醇或1-或2-丙醇；腈类，如乙腈；卤化烃类，如二氯甲烷或氯仿；酰胺类，如二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺；碱类，如杂环氮碱类，例如吡啶或N-甲基吡咯烷-2-酮；羧酸酐类，如低级链烷酸酸酐，例如乙酸酐；环状、直链或支链烃类，如环己烷、己烷或异戊烷；或这些溶剂的混合物，例如水溶液。该类溶剂混合物也可用于后处理，例如通过色谱法或分配进行的后处理。
本发明还涉及如下制备方法：其中将可在上文所述各制备方法和下文的流程中的任何步骤以中间体形式获得的化合物，用作起始材料并且进行剩余的方法步骤，或者其中起始材料在反应条件下原位形成或以衍生物的形式例如以被保护的形式或盐形式使用，或者可按照本发明的方法获得的化合物在所述方法条件下生成并且被进一步原位处理。
下面的流程1举例说明了可用于制备式I化合物的一种通用合成路线。以下流程中的通式的各变量具有与上文相同的含义，另有说明除外。其中当式A化合物中的R4为F时，式A化合物为式A-1化合物。
流程1
Figure GDA0003227487180000461
以下流程2～5举例说明了式I化合物合成过程中的式A化合物的合成路线，以及其中所进一步使用的中间体的合成。
流程2
Figure GDA0003227487180000471
流程3
Figure GDA0003227487180000472
流程4
Figure GDA0003227487180000473
流程5
Figure GDA0003227487180000474
以下流程6～8举例说明了式I化合物合成过程中的式B-1、式D-1和式B-2化合物及其具体实施方案B-2-18和B-2-19的合成路线，以及其中所进一步使用的中间体的合成。
流程6
Figure GDA0003227487180000481
流程7
Figure GDA0003227487180000482
流程8
Figure GDA0003227487180000491
本发明的式II化合物以及式III化合物可以参考上述流程、由本领域技术人员类似地制备。
在本发明所述的制备方法以及上述流程中，当有必要时，例如反应物料含有在反应步骤的反应条件下不稳定或具有反应性的官能团，则可以应用本领域周知的方法在关键步骤之前引入合适的保护基(T.W.Greene和P.G.M.Wuts,"Protective Groups in OrganicSynthesis",第5版,Wiley,纽约2014)。这样的保护基可以在合成的稍后阶段使用本领域中已知的标准方法除去。氨基保护基的实例包括Boc(叔丁氧基羰基)、Pmb(对甲氧基苄基)、Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)和Cbz(苄氧基羰基)。
以上合成方法和流程中所用的实验材料和试剂，如无特别说明，均可从市售渠道获得、依据现有技术的方法制得或根据与本申请公开的类似的方法制得。以上合成方法和流程中所用的合成条件，如无特别说明，可由本领域技术人员常规确定。
本文所用的未具体定义的技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。
本发明的各种枚举的实施方案中指定特征的一般或优选定义可以与其它指定特征的一般或优选组合，得到本发明另外的实施方案。就如同在本文中具体地且逐一地列出了这些相互组合而得到的方案一样，除非上下文清楚地显示并非如此。
除非结构式明显存在错误，否则当本发明的任意化合物的化学名称与所给出的结构式不一致时，以结构式为准。
在本说明书中，引用了若干在先出版物。这些出版物，不被认为与本发明的可专利性相关，但以引用方式将其全部内容结合于本文。本说明书中对任何在先出版物(或从其衍生出的信息)的引用不是、也不应当被视为确认或承认或任何形式的启示，即相应的先前出版物(或从其衍生出的信息)构成本说明书涉及的技术领域中的公知常识。
附图说明
附图1：本发明化合物在KM12异种移植物小鼠模型中的抗肿瘤活性。附图1-A显示本发明化合物对肿瘤体积的作用；附图1-B显示给药后12天本发明化合物在血浆和肿瘤组织中的浓度；附图1-C显示给药后18天本发明化合物在血浆和肿瘤组织中的浓度。
附图2：本发明实施例12化合物与现有技术Merestinib化合物的活性谱比较。
实施例
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。需要说明的是，下述实施例不能作为对本发明保护范围的限制。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照这类反应的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。除非另外说明，否则液体的比为体积比。
以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得、依据现有技术的方法制得或根据与本申请公开的类似的方法制得。
在下列实施例中，1H-NMR谱是用Bruker 400MHz NMR和Agilent 500MHz NMR核磁共振仪记录，化学位移以δ(ppm)表示；质谱是用Agilent 1290液相色谱+6120B质谱LCMS液质联用仪记录。
缩写列表
ACN(MeCN) 乙腈
Ar 氩气
BBr3 三溴化硼
tBuONO 亚硝酸叔丁酯
CDCl3 氘代氯仿
Cs2CO3 碳酸铯
CuCl 氯化亚铜
DCM 二氯甲烷
DIBAL-H 二异丁基氢化铝
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMF 二甲基甲酰胺
DMF-DMA N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛
DMSO 二甲基亚砜
DMSO-d6 氘代二甲基亚砜
ESI 电子喷雾离子化
EA(EtOAc) 乙酸乙酯
EDCI 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺
EtOH 乙醇
FaSSGF 模拟人类饥饿状态下空胃时的胃液
FaSSIF 模拟人类饥饿状态下小肠内的肠液
FeSSIF 模拟人类饱食状态下小肠内的肠液
h 小时
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐
HCl 氯化氢或盐酸
HOBt 1-羟基苯并三唑
HPLC 高效液相色谱法
H2O 水
K3PO4 磷酸钾
LCMS 液相色谱法-质谱法联用
LiOH 氢氧化锂
MeOH 甲醇
MHz 兆赫兹
MS 质谱
MsCl 甲基磺酰氯
NaH 氢化钠
NaHCO3 碳酸氢钠
NaOH 氢氧化钠
NaOMe 甲醇钠
Na2SO4 硫酸钠
NMR 核磁共振
PE 石油醚
Pd/C 钯/碳
PdCl2(dbpf) [1,1’-双(叔丁基膦基)二茂铁]二氯化钯
PdCl2(dppf) [1,1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯
o/n 过夜
rt 室温
SOCl2 二氯亚砜
SiO2 二氧化硅，硅胶
TBAF 氟化四正丁基铵
TEA 三乙胺
TEMPO 四甲基哌啶氮氧化物
TFA 三氟乙酸
TMS-CN 三甲基硅氰
TFAA 三氟乙酸酐
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱
TMSCHN2 三甲基硅重氮甲烷
合成实施例
以下合成实施例中的各个缩写具有本领域技术人员通常理解的含义。除非另有说明，所有温度皆以摄氏度给出；所有试剂均商购可得且未经进一步纯化即可使用。
中间体1的制备：2,4-二溴-5-羟基苯甲醛
向20℃,3-羟基苯甲醛(4.48g，40mmol)的二氯甲烷(80ml)溶液中缓慢滴加溴(6.72g，84mmol)，所得的反应混合物在室温下搅拌24小时，然后在40℃加入15％硫代硫酸钠水溶液(40ml)淬灭反应。析出的产品经水洗和干燥后得到4.6g固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.17(s,1H),10.16-10.06(m,1H),8.01(d,J＝2.2Hz,1H),7.41(d,J＝2.2Hz,1H).MS(m/z)：279.0(M+H)。
中间体2的制备：2,4-二溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)苯甲醛
向2,4-二溴-5-羟基苯甲醛(中间体1，4.5g，16mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(50ml)溶液中加入碳酸钾粉末(3.26g，24mmol)和1,2-二氟-4-硝基苯(2.68g，16.9mmol)，所得的反应混合物在50℃下搅拌6小时，TLC显示反应完成。反应混合物用乙酸乙酯抽提三次(每次30ml)，水洗5次，干燥、减压蒸去溶剂，得到黄色固体5.6g。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.18(s,1H),8.08(dd,J＝10.1,2.5Hz,1H),7.99(d,J＝9.2Hz,1H),7.97(s,1H),7.44(s,1H),6.95(t,J＝8.4Hz,1H)。
中间体3的制备：(E)-1-(2,4-二溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)苯亚甲基)-2-异丙肼
向2,4-二溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)苯甲醛(中间体2，2.2g，5.3mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(50ml)溶液中加入异丙肼(0.641g，5.8mmol)，所得的反应混合物在20℃下搅拌0.5小时，TLC显示反应完成。反应混合物用乙酸乙酯抽提三次(每次30ml)，水洗5次，干燥、减压蒸去溶剂，得到黄色固体2.4g，直接用于下步反应。
中间体4的制备：6-溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-异丙基-1H-吲唑
向氮气保护下的(E)-1-(2,4-二溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)苯亚甲基)-2-异丙肼(中间体3，2.4g，5mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入碳酸钾粉末(1.1g，8mmol)和氯化亚铜(0.08g，0.8mmol)，所得的反应混合物在100℃下搅拌3小时，TLC显示反应完成。反应混合物冷却至室温后用乙酸乙酯抽提三次(每次30ml)，水洗5次，干燥、减压蒸去溶剂。粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯-石油醚(1:20至1:10)洗脱得到黄色固体0.7g。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(d,J＝10.3Hz,1H),8.01(s,1H),7.83(s,1H),7.45(s,1H),6.74(t,J＝8.5Hz,1H),4.83(dt,J＝13.0,6.5Hz,1H),1.64(d,J＝6.6Hz,6H).MS(m/z)：394.0(M+H)。
中间体5的制备：6-溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑
该中间体按照中间体4的合成路线、使用中间体2和甲基肼制得。MS(m/z)：366.0(M+H)。中间体6的制备：6-溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑
该中间体按照中间体4的合成路线、使用中间体2和乙基肼制得。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.98(dd,J＝10.3,2.5Hz,1H),7.84(s,1H),7.79(d,J＝9.1Hz,1H),7.66(s,1H),7.39(s,1H),6.58(t,J＝8.5Hz,1H),4.30(q,J＝7.2Hz,2H),1.42(t,J＝7.2Hz,3H)。
中间体7的制备：N-(4-氟苯基)-2-氰基乙酰胺
向4-氟苯胺(6.6g，56mmol)的二氯甲烷(200ml)溶液中加入HATU(25g，75mmol)、N,N-二异丙基乙胺(21.6g，166mmol)和2-氰基乙酸(5.6g，75mmol)，所得的反应混合物在室温下搅拌2小时后，用饱和氯化铵水溶液洗涤，干燥。浓缩得到的粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯-石油醚(1:5至2:1)洗脱得到白色固体5g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.38(s,1H),7.56(dd,J＝8.8Hz,4.9Hz,2H),7.18(t,J＝8.8Hz,2H),3.90(s,2H).MS(m/z)：179.1(M+H)。
中间体8的制备：1-三甲基硅-戊-1-炔-3-酮
向0℃双三甲基硅乙炔(5.6g，35mmol)的二氯甲烷溶液中加入丙酰氯(2.79g，30mmol)，所得的反应混合物搅拌10分钟后再加入三氯化铝(4.8g，36mmol)，继续在0℃搅拌2小时后自然升温至室温，再搅拌2小时。将反应混合物倾倒入10％盐酸(70ml)的冰水溶液中搅拌10分钟。两相分开后，水相用二氯甲烷抽提三次(每次25ml)，干燥、减压蒸去溶剂得到棕色油状物粗产品，直接用于下一步反应。
中间体9的制备：(E)-1-甲氧基-戊-1-烯-3-酮
向1-三甲基硅-戊-1-炔-3-酮(中间体8，全部粗品)的甲醇(20ml)溶液中缓慢加入1,4-二氮杂二环[2,2,2]辛烷(6.72g，60mmol)，所得的反应混合物在室温下搅拌20分钟后浓缩，再用乙酸乙酯(20ml)稀释，用饱和食盐水洗两次(每次10ml)，干燥，减压蒸去溶剂。粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯-石油醚(1:10)洗脱得到产物2.1g。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.62(d,J＝12.7Hz,1H),5.60(d,J＝12.7Hz,2.4Hz,1H),3.71(q,J＝7.8Hz,3H),1.11(t,J＝7.8Hz,3H)。
中间体10的制备：(E)-1-甲氧基-4-甲基-戊-1-烯-3-酮
该中间体是按照中间体9的合成路线、从异丁酰氯制得。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(d J＝12.5,1H),5.62(d,J＝12.5,1H),2.72–2.56(m,1H),1.12–1.09(d,6H)。
中间体11的制备：(E)-1-环丙基-3-甲氧基-丙-2-烯-1-酮
该中间体是按照中间体9的合成路线、从环丙基甲酰氯制得。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.64(d,J＝12.6Hz,1H),5.72(d,J＝12.6Hz,1H),3.72(d,J＝4.7Hz,3H),1.93(d,J＝4.5Hz,1H),1.10–1.02(m,2H),0.91–0.81(m,2H)。
中间体12的制备：1-(4-氟苯基)-6-甲基-3-氰基-2-氧代-1,2-二氢吡啶
向N-(4-氟苯基)-2-氰基乙酰胺(中间体7，1g，5.6mmol)的二乙二醇单乙醚(20ml)溶液中加入1,4-二氮杂二环[2,2,2]辛烷(0.62g，5.6mmol)和(E)-1-甲氧基-丁-1-烯-3-酮(0.84g，8.4mmol)，所得的反应混合物在摄氏120度搅拌14小时，冷却至室温后分别用1N盐酸和饱和氯化钠水溶液洗涤，粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯-石油醚(1:1)洗脱得到黄色固体产物0.7g。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝7.4Hz,1H),7.26(t,J＝7.7Hz,2H),7.22-7.16(m,2H),6.27(d,J＝7.4Hz,1H),2.09(s,3H).MS(m/z)：229.1(M+H)。
中间体13的制备：1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸
向1-(4-氟苯基)-6-甲基-3-氰基-2-氧代-1,2-二氢吡啶(中间体12，0.7g)加入浓硫酸/水(1ml/1ml)，所得的反应混合物在100℃搅拌15小时，冷却至室温后用乙酸乙酯抽提三次(每次20ml)，再用饱和氯化钠水溶液洗涤。减压蒸去溶剂后，粗产品溶于乙醇(2ml)，加入2N氢氧化钠溶液，再用乙酸乙酯洗涤两次(每次10ml)。水溶液用1N盐酸酸化，沉淀过滤、干燥得到产物0.5g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43(d,J＝7.5Hz,1H),7.54(dd,J＝8.8Hz,5.1Hz,2H),7.46(t,J＝8.7Hz,2H),6.82(d,J＝7.6Hz,1H),2.11(s,3H).MS(m/z)：248.1(M+H)。
中间体14的制备：1-(4-氟苯基)-6-乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸
该中间体是按照中间体13的合成路线、使用中间体7和中间体9制得。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.23(s,1H),8.45(dd,J＝7.7,2.6Hz,1H),7.58–7.49(m,2H),7.45(t,J＝10.0Hz,2H),6.76(dd,J＝7.8,2.5Hz,1H),2.31(q,J＝7.4Hz,2H),1.05(t,J＝7.4Hz,3H).MS(m/z)：262.3(M+H)。
中间体15的制备：1-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸
该中间体是按照中间体13的合成路线、使用中间体7和中间体10制得。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.47(d,J＝7.8Hz,1H),7.58(dd,J＝8.8,4.9Hz,2H),7.46(t,J＝8.7Hz,2H),6.86(d,J＝7.8Hz,1H),2.46(m,1H),1.13(t,J＝7.2Hz,6H).MS(m/z)：276.3(M+H)。
中间体16的制备：1-(4-氟苯基)-6-环丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸
该中间体是按照中间体13的合成路线、使用中间体7和中间体11制得。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.37(d,J＝7.8Hz,1H),7.56(d,J＝4.3Hz,2H),7.45(t,J＝8.6Hz,2H),6.54(d,J＝8.0Hz,1H),1.35(m,1H),0.93(m,2H),0.85(m,2H).MS(m/z)：274.3(M+H)。
中间体17的制备：1-(4-氟苯基)-6-三氟甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸
该中间体是按照中间体13的合成路线、使用中间体7和(E)-1-甲氧基-4,4,4-三氟-1-丁烯-3-酮(采用与合成中间体9的类似方法得到)制得。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.66(s,1H),8.42(d,J＝7.4Hz,1H),7.60–7.51(m,2H),7.42(t,J＝8.7Hz,2H),7.25(d,J＝7.5Hz,1H).MS(m/z)：302.1(M+H)。
中间体18的制备：6-溴-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-异丙基-1H-吲唑
在100ml的圆底烧瓶中加入6-溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-异丙基-1H-吲唑(中间体4，0.2g，0.5mmol)、10％钯/碳(0.1g)和乙酸乙酯。用氢气置换烧瓶中的气体5次，然后在室温下搅拌过夜。TLC和LCMS显示反应完成且为单一产物。过滤去除钯/碳催化剂，用乙酸乙酯(25ml)淋洗滤饼，所得产品直接用于下一步反应。MS(m/z)：364.0(M+H)
中间体19的制备：N-(3-氟-4-(1-异丙基-6-溴-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
在25ml的圆底烧瓶中加入6-溴-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-异丙基-1H-吲唑(中间体18，0.2g，0.5mmol)、1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体13，0.15g，0.6mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(0.215g，1.12mmol)、1-羟基苯并三唑(0.105g，0.75mmol)、N,N-二异丙基乙胺(0.325g，2.5mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(4.5ml)，该混合物在室温下搅拌过夜，然后分布在乙酸乙酯(25ml)和饱和氯化钠水溶液(25ml)中。有机相分出后用饱和氯化钠水溶液洗涤四次(每次25ml)，水相用乙酸乙酯抽提三次(每次25ml)，合并后的有机相干燥，浓缩，粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯-石油醚(1:5至1:3)洗脱得到黄色固体产物。MS(m/z)：593.1(M+H)。
中间体20的制备：N-(3-氟-4-(1-异丙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
在25ml的圆底烧瓶中加入N-(3-氟-4-(1-异丙基-6-溴-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(中间体19，0.5mmol)、磷酸三钾(0.223g，1.05mmol)、1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯(0.182g，0.62mmol)、二碳酸二叔丁酯(0.022g，0.1mmol)、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.005g，0.0075mmol)、水(1ml)和四氢呋喃(15ml)，该混合物用氮气置换8次，然后在45℃下搅拌过夜。减压蒸除溶剂，粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯-石油醚(1:3至1:2)洗脱得到黄色固体产物0.263g。MS(m/z)：680.2(M+H)。
中间体21的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体21是采用合成中间体20的路线、使用中间体6(6-溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体13(1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS(m/z)：667.2(M+H)。
中间体22的制备：N-(3-氟-4-(1-异丙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-异丙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体22是采用合成中间体20的路线、使用中间体4(6-溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-异丙基-1H-吲唑)和中间体15(1-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。
中间体23的制备：N-(3-氟-4-(1-异丙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-三氟甲基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体23是采用合成中间体20的路线、使用中间体4(6-溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-异丙基-1H-吲唑)和中间体17(1-(4-氟苯基)-6-三氟甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。
中间体24的制备：6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑
在100ml的圆底烧瓶中加入6-溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑(中间体5，2.334g，6.37mmol)、磷酸三钾(2.84g，13.4mmol)、1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯(2.81g，9.6mmol)、二碳酸二叔丁酯(0.278g，1.27mmol)、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.25g，0.383mmol)、水(10ml)和四氢呋喃(150ml)，该混合物用氮气置换8次，然后在45℃下搅拌过夜。减压蒸除溶剂，粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯-石油醚(1:3至1:2)洗脱得到黄色固体产物3.78g。MS(m/z)：454.2(M+H)
中间体25的制备：6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑
在250ml的圆底烧瓶中加入6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑(中间体24，1.89g，4.17mmol)、10％钯/碳(1g)和乙酸乙酯(75ml)，用氢气置换烧瓶中的气体5次，然后在40℃下搅拌1小时。TLC和LCMS显示反应完成且为单一产物。过滤去除钯/碳，减压蒸除溶剂后得产品1.2g直接用于下一步反应。MS(m/z)：424.2(M+H)
中间体26的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-乙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
在25ml的圆底烧瓶中加入6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑(中间体25，0.212g，0.5mmol)、1-(4-氟苯基)-6-乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸(中间体14，0.131g，0.5mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(0.215g，1.12mmol)、1-羟基苯并三唑(0.105g，0.75mmol)、N,N-二异丙基乙胺(0.325g，2.5mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(4.5ml)，该混合物在室温下搅拌过夜，然后分布在乙酸乙酯(25ml)和饱和氯化钠水溶液(25ml)中。有机相分出后用饱和氯化钠水溶液洗涤四次(每次25ml)，水相用乙酸乙酯抽提三次(每次25ml)，合并后的有机相干燥、浓缩，粗产品用硅胶柱纯化，乙酸乙酯-石油醚(1:1至2:1)洗脱得到黄色固体产物。MS(m/z)：667.2(M+H)
中间体27的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-异丙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体27是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体15(1-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS(m/z)：681.2(M+H)
中间体28的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-环丙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体28是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体16(1-(4-氟苯基)-6-环丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS(m/z)：679.2(M+H)
中间体29的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-三氟甲基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体29是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体17(1-(4-氟苯基)-6-三氟甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS(m/z)：707.2(M+H)
中间体30的制备：3-((4-氟苯基)氨基)-3-氧代-丙酸乙酯
丙二酸单乙酯(10g，8.93ml，75.69mmol)、4-氟苯胺(7.17ml，75.69mmol)、EDCIHCl(14.51g，75.69mmol)、HOBt(10.23g，75.69mmol)、TEA(21.04ml，151.38mmol)和DCM(120ml)的混合物在室温下搅拌16小时。加水(200ml)淬灭，用浓盐酸酸化至pH7，乙酸乙酯抽提(3x200ml)。有机相用饱和食盐水(200ml)洗涤，无水Na2SO4干燥。过滤、浓缩后，得到白色固体(17.2g，75.7％产率)。粗产品未纯化，直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.26(s,1H),7.54–7.50(m,2H),7.03(dd,J＝11.9,5.4Hz,2H),4.26(q,J＝7.1Hz,2H),3.47(s,2H),1.33(t,J＝7.2Hz,3H).MS-ESI(M+H+):226.2
中间体31的制备：3-二甲胺基-2-((4-氟苯基)甲酰胺基)丙烯酸乙酯
向3-((4-氟苯基)氨基)-3-氧代-丙酸乙酯(3g，13.32mmol)的甲苯(50ml)溶液中加入DMF-DMA(2.65ml，19.98mmol)。该化合物在90℃搅拌2小时。反应化合物浓缩后，粗产品用乙酸乙酯/石油醚(1:10，22ml)重结晶，得到白色固体(1.71g，45.8％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.03(s,1H),7.65-7.62(m,2H),7.50–7.43(m,1H),7.11(t,J＝8.8Hz,2H),4.07(q,J＝6.9Hz,2H),2.99(s,6H),1.17(t,J＝7.0Hz,3H).MS-ESI(M+H+):281.2
中间体32的制备：6-氨基-1-(4-氟苯基)-5-(甲硫基)-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯
向氰甲基二甲硫鎓溴化物(16.29g，89.48mmol)的DMSO(250ml)溶液中加入Cs2CO3(72.88g，223.69mmol)并在室温下搅拌0.5小时，然后加入3-二甲胺基-2-((4-氟苯基)甲酰胺基)丙烯酸乙酯。该混合物加热至100℃搅拌16小时。加水(300ml)淬灭，过滤、水洗(2x100ml)、粗产品用乙酸乙酯/石油醚(1:2，90ml)重结晶，得到白色固体(18g，74.9％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.15(s,1H),7.39–7.31(m,2H),7.30-7.26(m,2H),7.00(br,2H),4.09(q,J＝7.1Hz,2H),2.20(s,3H),1.19(t,J＝7.2Hz,3H).MS-ESI(M+H+):323.0
中间体33的制备：6-氨基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯
向6-氨基-1-(4-氟苯基)-5-(甲硫基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(1g，3.1mmol)的THF(30ml)溶液中加入PdCl2(55mg，0.31mmol)和三乙基硅烷(0.99ml，6.20mmol)并在室温下搅拌16小时。过滤浓缩后用乙酸乙酯(2x10ml)洗涤得到白色固体33(0.5g，58.3％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,J＝8.8Hz,1H),7.40–7.35(m,2H),7.28–7.25(m,2H),6.92(br,2H),5.61(d,J＝8.8Hz,1H),4.07(q,J＝7.2Hz,2H),1.18(t,J＝7.2Hz,3H).MS-ESI(M+H+):277.2
中间体34的制备：6-氯-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯
向6-氨基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(6g，21.7mmol)、CuCl(2.6g，26.1mmol)的ACN(50ml)混合物中滴加入t-BuONO(4.8mg，35.8mmol)并在室温下搅拌过夜。该反应液浓缩后，粗产品用硅胶柱纯化。用0-20％乙酸乙酯/二氯甲烷梯度洗脱，得到黄色固体34(1.6g，25％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.122(d,J＝8.0Hz,1H),7.46–7.39(m,4H),6.70(d,J＝8.0Hz,1H),4.22(q,J＝7.2Hz,2H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H).MS-ESI(M+H+):295.9
中间体35的制备：1-(4-氟苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
向6-氯-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(0.5g，1.69mmol)的THF(20ml)混合物中加入NaOMe(915mg，16.9mmol)并在室温下搅拌2小时。该反应液用1NHCl(100ml)淬灭，乙酸乙酯抽提(2x100ml)。有机相用饱和食盐水洗涤(100ml)、无水硫酸钠干燥。过滤浓缩后，粗产品用HPLC制备。得到白色固体(0.178g，40％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.77(s,1H),8.48(d,J＝8.8Hz,1H),7.47–7.36(m,4H),6.43(d,J＝8.8Hz,1H),3.93(s,3H).MS-ESI(M+H+):264.1
中间体36的制备：1-(4-氟苯基)-6-乙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
中间体36是采用合成中间体35的路线、从中间体34 6-氯-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯和乙醇钠得到。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.80(s,1H),8.46(d,J＝8.4Hz,1H),7.48–7.39(m,4H),6.43(d,J＝8.8Hz,1H),4.29(q,J＝6.8Hz,2H),1.16(t,J＝7.0Hz,3H).MS-ESI[M+H]+:278.1
中间体37的制备：1-(4-氟苯基)-6-环丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
中间体37是采用合成中间体35的路线、从中间体34(6-氯-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯)和氢化钠及环丙醇得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.78(s,1H),8.52(d,J＝8.8Hz,1H),7.44–7.37(m,4H),6.65(d,J＝8.4Hz,1H),4.23–4.18(m,1H),0.831(t,J＝6.4Hz,2H),0.371(t,J＝6.4Hz,7.2Hz,2H).MS-ESI(M+H)+:290.0
中间体38的制备：1-(4-氟苯基)-6-异丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
中间体38是采用合成中间体35的合成路线、从中间体34(6-氯-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯)和氢化钠及异丙醇得到。1H-NMR(400MHz,DMSO--d6)δ13.801(s,1H),8.436(d,J＝8.8Hz,1H),7.442–7.354(m,4H),6.468(d,J＝8.8Hz,1H),4.967–4.876(m,1H),1.180(d,J＝8.8Hz,6H).MS-ESI[M+H]+:292.0
中间体39的制备：1-(4-氟苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
中间体39是采用合成中间体35的路线、从中间体34(6-氯-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯)和氢化钠及2,2,2-三氟乙醇得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.68(s,1H),8.52(d,J＝8.5Hz,1H),7.54–7.32(m,4H),6.51(d,J＝8.6Hz,1H),5.05(q,J＝8.4Hz,2H).MS-ESI(M+H+):332.0
中间体40的制备：1-(4-氟苯基)-6-甲硫基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
中间体40是采用合成中间体35的路线、从中间体34(6-氯-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯)和甲基硫醇钠。粗产品直接用于下一步反应。MS-ESI[M+H]+:280.0
中间体41的制备：6-氨基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
向6-氨基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(1.0g，3.62mmol)和乙醇(15ml)中加入NaOH(2.90g，72.39mmol)和水(8ml)并在60℃下搅拌24小时。反应液浓缩后溶解于水(30ml)，用DCM(3x50ml)抽提。水溶液用浓HCl中和至Ph 6.0,乙酸乙酯抽提(3x50ml)。有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后，得到黄色固体(0.450g，50％产率)。粗产品直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.75(s,1H),8.00(d,J＝8.8Hz,1H),7.45(s,2H),7.43(d,J＝3.0Hz,2H),7.22(dd,J＝50.1,31.4Hz,2H),5.95(d,J＝8.8Hz,1H).MS-ESI(M+H+):249.0
中间体42的制备：1-(4-氟苯基)-6-氯-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
向6-氨基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸(0.45g，1.81mmol)和CuCl(0.179g，1.81mmol)的MeCN(10ml)混合物中滴加入t-BuONO(0.62ml，2.99mmol)并在室温下搅拌3天。反应用HCl水溶液(1M，20ml)淬灭、乙酸乙酯抽提(5x30ml)。有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后，粗产品用HPLC，得到黄色固体(0.080g，16.5％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.31(s,1H),8.55(d,J＝7.9Hz,1H),7.32–7.27(m,4H),6.80(d,J＝7.9Hz,1H).MS-ESI(M+H+):267.9
中间体43的制备：6-(Boc-氨基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯
向6-氨基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(0.32g，1.16mmol)的DCM(10ml)混合物中滴加入TEA(0.32ml，2.32mmol)和Boc2O(0.53ml，2.32mmol)并在室温下搅拌16小时。反应用水(10ml)淬灭、乙酸乙酯抽提(3x20ml)。有机相用无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后，粗产品用硅胶柱纯化。用1/10–1/5-1/2乙酸乙酯/二氯甲烷梯度洗脱，得到黄色固体(1.6g，25％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(d,J＝8.6Hz,1H),7.34–7.26(m,4H),7.12(d,J＝8.4Hz,1H),6.17(s,1H),4.33(q,J＝7.2Hz,2H),1.44(s,9H),1.35(t,J＝7.1Hz,3H).MS-ESI(M+H+):377.1
中间体44的制备：6-(Boc-氨基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
向6-(Boc-氨基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(0.18g，0.48mmol)的EtOH(2ml)混合物中滴加入NaOH(0.382g，9.56mmol)和水(2ml)并在室温下搅拌64小时。反应液用水(10ml)稀释、DCM抽提(2x10ml)。水相用浓HCl酸化至pH 6，再用乙酸乙酯抽提(4x10ml)。有机相用饱和食盐水洗涤(10ml)、无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后，得到黄色固体(0.12g，72％产率)。粗产品未纯化，直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.36(br s,1H),8.56(d,J＝8.8Hz,1H),7.44–7.39(m,3H),7.35–7.28(m,2H),6.29(s,1H),1.46(s,9H).MS-ESI(M+H+):349.1
中间体45的制备：6-(甲亚砜基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
向6-(甲硫基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸乙酯(0.15g，0.54mmol)的MeCN(3ml)混合物中滴加入30％H2O2(0.12ml，1.08mmol)和浓HCl(0.06ml)并在室温下搅拌16小时。反应液浓缩后，用HPLC制备得到白色固体(0.08g，50.4％产率)。MS-ESI(M+H+):296.0
中间体46的制备：(E)-N-(5-溴-4-甲氧基-2-甲基苯基)-2-肟乙酰胺
将三氯水合乙醛(11.0g，66.6mmol)、硫酸钠(16.0g，113mmol)、5-溴-4-甲氧基-2-甲基苯胺(13g，51.8mmol)、浓盐酸(8ml)、盐酸羟氨(13.4g，195mmol)、和水(500ml)的混合物在100℃下搅拌6小时。然后冷却至0℃。过滤收集产生的沉淀，水洗、干燥得棕色固体(9.0g，61％产率)。MS-ESI(M+H+):286.9
中间体47的制备：4-溴-5-甲氧基-7-甲基吲哚啉-2,3-二酮
将(E)-N-(5-溴-4-甲氧基-2-甲基苯基)-2-肟乙酰胺(9.0g，31mmol)和浓硫酸(26ml)的混合物加热至80℃搅拌2小时。然后冷却至室温，缓慢倾倒在冰块上，搅拌1小时。过滤收集产生的沉淀，分散在80℃乙醇(100ml)中搅拌1小时。冷却至室温析出固体，过滤、干燥得红色固体(6.3g，75％产率)。MS-ESI(M+H+):269.9
中间体48的制备：2-氨基-6-溴-5-甲氧基-3-甲基苯甲酸
在80℃下，向4-溴-5-甲氧基-7-甲基吲哚啉-2,3-二酮(6.0g，22mmol)的3N NaOH(0.7ml)溶液中缓慢滴加30％过氧化氢水溶液(6ml)，并继续搅拌2小时。然后冷却至室温，用浓盐酸调整溶液pH值至3-5，在室温下再搅拌1小时。过滤收集产生的沉淀，干燥得浅棕色固体(4.5g，78％产率)。MS-ESI(M+H+):259.9
中间体49的制备：2-氨基-6-溴-5-甲氧基-3-甲基苯甲酸甲酯
在室温下，向2-氨基-6-溴-5-甲氧基-3-甲基苯甲酸(4.5g，17mmol)的THF/MeOH(4:1，50ml)溶液中滴加三甲基硅重氮甲烷溶液(2M己烷,34ml)，并继续搅拌2小时。然后用3ml冰乙酸处理，蒸去溶剂，剩余物用硅胶柱色谱纯化。用3:1石油醚/乙酸乙酯洗脱，得浅黄色固体(3.0g，63％产率)。MS-ESI(M+H+):273.9
中间体50的制备：6-溴-5-甲氧基-1H-吲唑-7-甲酸甲酯
向2-氨基-6-溴-5-甲氧基-3-甲基苯甲酸甲酯(3.0g，10.98mmol)和冰乙酸(50ml)混合物中加入NaNO2(0.91g，13mmol)的水(10ml)溶液。加热至50℃继续搅拌16小时。蒸去溶剂，剩余物水洗、真空干燥得浅黄色固体(2.84g，91％产率)。MS-ESI(M+H+):285.0
中间体51的制备：6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-甲酸甲酯
将6-溴-5-甲氧基-1H-吲唑-7-甲酸甲酯(10g，35.2mmol)和DHP(20ml，70.4mmol)溶于THF/CHCl3(1:2，240ml)中，加入TsOH(1.0g，5.26mmol)。该混合物在50℃搅拌过夜。冷却至室温后，浓缩，剩余物用硅胶柱色谱纯化。用0-20％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得黄色固体(10g，77％产率)。MS-ESI(M+H+):369.1
中间体52的制备：6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-甲醇
在-20℃下，向6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-甲酸甲酯(10g，27.1mmol)的甲苯溶液中加入DIBAL-H(70ml，108.4mmol，1.5M甲苯)。该混合物缓慢升至室温，继续搅拌1小时。反应用水淬灭、乙酸乙酯抽提。有机相水洗、饱和食盐水洗、无水Na2SO4干燥后浓缩，粗产品用硅胶柱色谱纯化。用0-20％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得白色固体(9g，97％产率)。MS-ESI(M+H+):341.0
中间体53的制备：6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-甲基甲磺酸酯
在0℃下，向6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-甲醇(10.0g，29.4mmol)的DCM(200ml)溶液中加入TEA(16ml，117.6mmol)和MsCl(0.45ml，5.88mmol)。该混合物缓慢升至室温，继续搅拌1小时。反应用水淬灭、DCM抽提。有机相水洗、饱和食盐水洗、无水Na2SO4干燥后浓缩。粗产品直接用于下一步反应。MS-ESI(M+H+):356.9
中间体54的制备：2-(6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-基)乙腈
向6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-甲基甲磺酸酯(10.0g，29.4mmol)的ACN(20ml)溶液中加入TMS-CN(5.9ml，44.1mmol)和TBAF(1M，44ml，117.6mmol)。该混合物在室温下搅拌3小时后，反应用水稀释、乙酸乙酯抽提。有机相水洗、饱和食盐水洗、无水Na2SO4干燥后浓缩，粗产品用硅胶柱色谱纯化。用0-20％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得白色固体(3.5g，35％产率)。MS-ESI(M+H+):350.1
中间体55的制备：2-(6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-基)乙醛
在0℃下，向2-(6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-基)乙腈(2.50g，10mmol)的甲苯(35ml)溶液中加入DIBAL-H(7.16ml，15mmol，1.5M甲苯)。该混合物缓慢升至室温，继续搅拌2小时。反应用水淬灭、乙酸乙酯抽提，有机相水洗、饱和食盐水洗、无水Na2SO4干燥后浓缩，粗产品用硅胶柱色谱纯化。用0-20％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得白色固体(1.5g，59％产率)。MS-ESI(M+H+):269.0
中间体56的制备：2-(6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-基)乙醇
向2-(6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-基)乙醛(1.5g，2.6mmol)的甲醇(30ml)溶液中加入NaBH4(0.66g，5.2mmol)。该混合物在室温下搅拌2小时。反应用水淬灭、DCM抽提，有机相水洗、饱和食盐水洗、无水Na2SO4干燥后浓缩，粗产品用硅胶柱色谱纯化。用0-20％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得白色固体(1.3g，86％产率)。MS-ESI(M+H+):255.0
中间体57的制备：6-溴-7-(2-氯乙基)-5-甲氧基-1H-吲唑
在0℃下，向2-(6-溴-5-甲氧基-1-(四氢-2H-吡喃-2基)-1H-吲唑-7-基)乙醇(0.35g，0.99mmol)的ACN(35ml)溶液中加入DMF(2滴)和SOCl2(3.5ml)。该混合物升至室温，并继续搅拌48小时。反应液浓缩，得粗产物棕色固体，直接用于下一步反应。MS-ESI(M+H+):291.0
中间体58的制备：5-溴-4-甲氧基-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑
室温下，向6-溴-7-(2-氯乙基)-5-甲氧基-1H-吲唑(0.6g，2.07mmol)的DMF(60ml)溶液中加入Cs2CO3(3.38g，10.36mmol)。该混合物升至100℃，并继续搅拌4小时。反应液过滤、浓缩，粗产品用硅胶柱色谱纯化。用0-40％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得黄色固体58(0.11g，两步44％产率)。MS-ESI(M+H+):255.0
中间体59的制备：5-溴-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-4-醇
在0℃下，向5-溴-4-甲氧基-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑(0.15g，0.592mmol)的DCM(5ml)溶液中加入BBr3溶液(17％wt in DCM，5.93ml，10mmol)。该混合物升至室温并继续搅拌12小时。反应用冰水淬灭，DCM抽提。有机相浓缩，得棕色粗产品固体。MS-ESI(M+H+):241.1
中间体60的制备：5-溴-4-(2-氟-4-硝基苯氧基-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑
向5-溴-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-4-醇(0.25g)的DMF(10ml)溶液中加入NaHCO3(0.263g，3.14mmol)和1,2-二氟-4-硝基苯(0.166g，1.05mmol)。该混合物升至60℃搅拌12小时。反应液过滤、浓缩，粗产品用硅胶柱色谱纯化。用0-30％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得固体(0.08g，两步36％产率)。MS-ESI(M+H+):380.0
中间体61的制备：4-(4-(2-氟-4-硝基苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯
向5-溴-4-(2-氟-4-硝基苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑(60mg，0.158mmol)的THF(6ml)和水(0.6ml)溶液中加入K3PO4(67mg，0.316mmol)及Pd(dbpf)Cl2(4.9mg，0.08mmol)。该混合物升至60℃搅拌12小时。反应液水洗、乙酸乙酯抽提，有机相浓缩，粗产品用硅胶柱色谱纯化。用0-50％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得固体(40mg，54％产率)。MS-ESI(M+H+):466.2
中间体62的制备：4-(4-(4-氨基-2-氟-苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯
向4-(4-(2-氟-4-硝基苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯(50mg，0.1mmol)的THF(5ml)溶液中加入Pd/C(10％,30mg)。该混合物在氢气气氛下室温搅拌12小时。LCMS检测到羟胺中间体，反应混合物过滤，新加Pd/C(10％,30mg)，并在氢气气氛下室温再搅拌8小时。过滤、浓缩得粗产品固体(68mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.31(s,1H),8.55(d,J＝7.9Hz,1H),7.32–7.27(m,4H),6.80(d,J＝7.9Hz,1H).MS-ESI(M+H+):267.9
中间体63的制备：6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑
中间体63是采用合成中间体25的路线、从中间体14 6-溴-5-(2-氟-4-硝基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑得到。MS-ESI(M+H+):438.3
中间体64的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-氯-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体64是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体42(1-(4-氟苯基)-6-氯-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):673.3
中间体65的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-(Boc氨基)-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体65是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体44(1-(4-氟苯基)-6-(Boc氨基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):754.3
中间体66的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲硫基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体66是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体40(1-(4-氟苯基)-6-甲硫基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):685.2
中间体67的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲亚砜-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体67是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体45(1-(4-氟苯基)-6-甲亚砜基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):701.2
中间体68的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体68是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体35(1-(4-氟苯基)-6-甲氧-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):669.1
中间体69的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-乙氧-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体69是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体36(1-(4-氟苯基)-6-乙氧-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):683.2
中间体70的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-环丙氧-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体70是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体37(1-(4-氟苯基)-6-环丙氧-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):695.2
中间体71的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-异丙氧-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体71是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体38(1-(4-氟苯基)-6-异丙氧-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):697.2
中间体72的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体72是采用合成中间体26的路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体39(1-(4-氟苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):737.1
中间体73的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-乙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体73是采用合成中间体26的路线、从中间体63(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体14(1-(4-氟苯基)-6-乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):681.0
中间体74的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-环丙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体74是采用合成中间体26的路线、从中间体63(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体16(1-(4-氟苯基)-6-环丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):693.0
中间体75的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-氯-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体75是采用合成中间体26的路线、从中间体63(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体42(1-(4-氟苯基)-6-氯-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):687.1
中间体76的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-Boc氨基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体76是采用合成中间体26的路线、从中间体63(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体44(1-(4-氟苯基)-6-Boc氨基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):766.4
中间体77的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲硫-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体77是采用合成中间体26的路线、从中间体63(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体40(1-(4-氟苯基)-6-甲硫基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):699.1
中间体78的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲氧-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体78是采用合成中间体26的路线、从中间体63(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体35(1-(4-氟苯基)-6-甲氧-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):683.3
中间体79的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-乙氧-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体79是采用合成中间体26的路线、从中间体63(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体36(1-(4-氟苯基)-6-乙氧-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):697.3
中间体80的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-环丙氧-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体80是采用合成中间体26的路线、从中间体63(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体37(1-(4-氟苯基)-6-环丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):709.1
中间体81的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-异丙氧-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体81是采用合成中间体26的路线、从中间体63(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体38(1-(4-氟苯基)-6-异丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):711.3
中间体82的制备：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体82是采用合成中间体26的路线、从中间体63(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-乙基-1H-吲唑)和中间体39(1-(4-氟苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):751.2
中间体83的制备:4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯
中间体83是采用合成中间体26的路线、从中间体62(4-(4-(4-氨基-2-氟-苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)和中间体13(1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):665.5
中间体84的制备:4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯
中间体84是采用合成中间体26的路线、从中间体62(4-(4-(4-氨基-2-氟-苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)和中间体35(1-(4-氟苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):681.2
中间体85的制备:4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-乙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯
中间体85是采用合成中间体26的路线、从中间体62(4-(4-(4-氨基-2-氟-苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)和中间体36(1-(4-氟苯基)-6-乙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):695.2
中间体86的制备:4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-环丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯
中间体86是采用合成中间体26的路线、从中间体62(4-(4-(4-氨基-2-氟-苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)和中间体37(1-(4-氟苯基)-6-环丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):707.2
中间体87的制备:4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-异丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯
中间体87是采用合成中间体26的路线、从中间体62(4-(4-(4-氨基-2-氟-苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)和中间体38(1-(4-氟苯基)-6-异丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):709.3
中间体88的制备：6-二氟甲氧基尼克酸甲酯
向6-羟基尼克酸甲酯(1.5g，9.8mmol)的ACN(50ml)溶液中加入NaH(0.979g，24.49mmol)。室温搅拌0.5小时后加入2,2-二氟-2-氟磺酰乙酸(2.62g，14.69mmol)。该反应混合物在25℃搅拌2小时，加水(50ml)淬灭，乙酸乙酯抽提(5x50ml)。有机相用饱和食盐水(50ml)洗涤，无水Na2SO4干燥。过滤、浓缩后，粗产品用硅胶柱纯化。用0-10％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得到白色固体(1.70g，85.4％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(d,J＝2.3Hz,1H),8.32(dd,J＝8.6,2.3Hz,1H),7.53(t,J＝72.3Hz,1H),6.95(d,J＝8.6Hz,1H),3.94(s,3H).MS(m/z)：204.0(M+H)。
中间体89的制备：6-二氟甲氧基-5-甲氧羰基吡啶-1-氧化物
向6-二氟甲氧基尼克酸甲酯(0.8g，3.94mmol)的DCM(40ml)溶液中加入尿素-过氧化氢(3.70g，39.38mmol)和TFAA(5.5ml，39.38mmol)。该反应混合物在25℃搅拌16小时，加水(50ml)淬灭，乙酸乙酯抽提(5x50ml)。有机相用饱和硫代硫酸钠(50ml)、饱和NaHCO3(3x50ml)和饱和食盐水(50ml)依次洗涤，无水Na2SO4干燥。过滤、浓缩后得到粗产品白色固体(0.735g，85％产率)，直接用于下一步反应。MS(m/z)：220.0(M+H)。
中间体90的制备：6-二氟甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸甲酯
向6-二氟甲氧基-5-甲氧羰基吡定-1-氧化物(0.5g，2.28mmol)的THF(20ml)溶液中加入TFAA(1.29ml，9.13mmol)和TEA(1.27ml，9.13mmol)。该反应混合物在25℃搅拌2小时，浓缩后，粗产品用硅胶柱纯化。用0-5％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，得到白色固体(0.360g，72％产率)。MS(m/z)：220.0(M+H)。
中间体91的制备：6-二氟甲氧基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸甲酯
在Ar保护下向6-二氟甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸甲酯(150mg，0.684mmol)的1,4-二氧六环(3ml)溶液中加入4-氟苯硼酸(95.8mg，0.684mmol)，醋酸铜(248.7mg，1.36mmol)，TEMPO(128.4mg，0.821mmol)和吡啶(541.7mg，6.84mmol)。该反应混合物在80℃搅拌0.5小时，LCMS显示10％产物。每半小时补加0.5当量4-氟苯硼酸，共8次，LCMS产率达69％。过滤浓缩后，粗产品用硅胶柱纯化。用THF/石油醚(1:10)洗脱，得到黄色固体1.0g。再用反向制备HPLC纯化得白色固体(50mg，23％产率)MS(m/z)：314.0(M+H)。
中间体92的制备：6-二氟甲氧基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
向0℃的6-二氟甲氧基-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸甲酯(150mg，0.477mmol)的THF/水(4ml/0.8ml)溶液中加入LiOH H2O(22mg，0.525mmol)，该反应混合物在Ar保护下室温搅拌过夜。然后用1N HCl调节pH至3-4，乙酸乙酯抽提(3x20ml)，有机相用饱和食盐水洗涤(3x50ml)，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩。粗产品在石油醚中重结晶得白色固体(100mg，70％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.16(s,1H),8.37(d,J＝8.0Hz,1H),7.35(s,0.28H),7.26-7.22(m,4H),7.17(s,0.49H),6.99(s,0.23H),6.85(d,J＝8.4Hz,1H).MS-ESI(M+H+):300.0
中间体93的制备:4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯
中间体93是采用合成中间体26路线、从中间体62(4-(4-(4-氨基-2-氟-苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)和中间体39(1-(4-氟苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):749.2
中间体94的制备：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-二氟甲氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
中间体94是采用合成中间体26路线、从中间体25(6-(1-Boc-吡唑-4-基)-5-(2-氟-4-氨基苯氧基)-1-甲基-1H-吲唑)和中间体92(1-(4-氟苯基)-6-二氟甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):705.2
中间体95的制备:4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-二氟甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯
中间体95是采用合成中间体26路线、从中间体62(4-(4-(4-氨基-2-氟-苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)和中间体92(1-(4-氟苯基)-6-二氟甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-羧酸)得到。MS-ESI(M+H+):717.2
实施例1：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-三氟甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺单甲磺酸盐的制备
Figure GDA0003227487180000681
向N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-三氟甲基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺(中间体29,255mg，0.33mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中加入三氟乙酸(3ml)，所得的反应混合物在室温下搅拌1小时，减压蒸除溶剂。粗产品溶于乙酸乙酯(50ml)，加入饱和碳酸氢钠水溶液(25ml)中和，然后用饱和氯化钠水溶液洗涤两次(每次25ml)，干燥、浓缩后得到以上化学结构所示的游离碱固体200mg。
将上述游离碱溶于无水甲醇(5ml)和二氯甲烷(5ml)中，加入甲磺酸(32mg，0.33mmol)的甲醇(5ml)溶液，充分混合后，减压蒸除溶剂，干燥得到黄色固体约230mg。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.56(s,1H),8.55(d,J＝7.6Hz,1H),8.04(s,2H),7.94(s,1H),7.90(dd,J＝13.2,2.5Hz,1H),7.85(s,1H),7.51(dd,J＝8.6,4.9Hz,2H),7.35(t,J＝8.6Hz,2H),7.30–7.20(m,3H),6.79(t,J＝9.1Hz,1H),4.73(s,b,2H),4.01(s,3H),2.29(s,3H).MS(m/z)：607.1(M+H)。
实施例2：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-环丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000691
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体28(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-环丙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。MS(m/z)：579.2(M+H)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ11.82(s,1H),8.62(d,J＝7.8Hz,1H),8.23(s,2H),7.89(dd,J＝12.7,2.5Hz,1H),7.84(s,1H),7.57(s,1H),7.34–7.28(m,4H),7.20(d,J＝9.1Hz,1H),7.17(s,1H),6.88(t,J＝8.8Hz,1H),6.22(d,J＝7.8Hz,1H),4.11(s,3H),3.54(s,b,3H),2.95(s,3H),1.41–1.13(m,2H),1.00–0.64(m,2H).
实施例3：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000692
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体21(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.87(s,1H),8.40(d,J＝7.5Hz,1H),8.06(s,2H),7.97(s,1H),7.90(dd,J＝13.4,2.4Hz,1H),7.86(s,1H),7.52–7.27(m,4H),7.25–7.10(m,2H),6.80(t,J＝9.1Hz,1H),6.63(d,J＝7.6Hz,1H),5.29(s,b,2H),4.40(q,J＝7.2Hz,2H),2.30(s,4H),2.00(s,3H),1.35(t,J＝7.2Hz,3H).MS(m/z)：567.2(M+H)。
实施例4：N-(3-氟-4-(1-异丙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000701
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体20(N-(3-氟-4-(1-异丙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.87(s,1H),8.40(d,J＝7.6Hz,1H),8.06(s,2H),7.98(s,1H),7.90(dd,J＝13.3,2.5Hz,1H),7.87(s,1H),7.47–7.29(m,4H),7.23–7.10(m,2H),6.79(t,J＝9.1Hz,1H),6.63(d,J＝7.6Hz,1H),5.07(s,b,2H),5.01(h,J＝6.7Hz,1H),2.30(s,3H),2.00(s,3H),1.43(d,J＝6.5Hz,6H).MS(m/z)：581.2(M+H)。
实施例5：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000702
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体26(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-乙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.94(s,1H),8.52(d,J＝7.7Hz,1H),8.12(s,2H),8.01(s,1H),7.97(dd,J＝13.2,2.4Hz,1H),7.92(s,1H),7.58–7.34(m,4H),7.30–7.16(m,2H),6.86(t,J＝9.1Hz,1H),6.67(d,J＝7.7Hz,1H),5.27(s,b,2H),4.08(s,3H),2.37(s,3H),2.30(q,J＝7.4Hz,2H),1.05(t,J＝7.4Hz,3H).MS(m/z)：567.2(M+H)。
实施例6：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000703
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体27(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-异丙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.86(s,1H),8.46(d,J＝7.8Hz,1H),8.05(s,2H),7.94(s,1H),7.90(dd,J＝13.5,2.4Hz,1H),7.84(s,1H),7.46(dd,J＝8.7,4.9Hz,2H),7.36(t,J＝8.6Hz,2H),7.19(d,J＝7.7Hz,2H),6.79(t,J＝9.1Hz,1H),6.69(d,J＝7.9Hz,1H),5.05(s,b,2H),4.01(s,3H),2.39(h,1H),2.29(s,3H),1.05(d,J＝6.8Hz,6H).MS(m/z)：581.2(M+H)。
实施例7：N-(3-氟-4-(1-异丙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-异丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000711
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体22(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-异丙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。
1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ11.85(s,1H),8.69(d,J＝7.8Hz,1H),8.49(s,2H),7.93–7.85(m,2H),7.63(s,1H),7.31(t,J＝8.4Hz,2H),7.30–7.21(m,3H),7.12(s,1H),6.97(t,J＝8.7Hz,1H),6.56(d,J＝7.8Hz,1H),6.12(s,b,2H),4.88(s,1H),2.96(s,3H),2.60(hept,J＝6.8Hz,1H),1.61(d,J＝4.7Hz,6H),1.18(d,J＝6.8Hz,6H).
实施例8：N-(3-氟-4-(1-异丙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-三氟甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000712
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体23(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-异丙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。
1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ11.62(s,1H),8.78(d,J＝7.6Hz,1H),8.53(s,2H),7.89(s,1H),7.88(dd,J＝10.1Hz,2.5Hz,1H),7.64(s,1H),7.33–7.22(m,5H),7.14(s,1H),7.09(d,J＝7.6Hz,1H),6.98(t,J＝8.8Hz,1H),5.60(s,b,2H),4.88(hept,J＝6.7Hz,1H),2.95(s,3H),1.61(d,J＝6.6Hz,6H).
实施例9：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-氯-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000721
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体64(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-氯-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.97(s,1H),11.57(s,1H),8.51(d,J＝7.9Hz,1H),8.15(s,1H),8.02(s,1H),8.00(s,1H),7.95(d,J＝14.5Hz,1H),7.91(s,1H),7.56(s,2H),7.44(t,J＝8.5Hz,2H),7.28(s,2H),7.01(d,J＝8.0Hz,1H),6.85(t,J＝9.1Hz,1H),4.07(s,3H).MS-ESI(M+H+):573.1
实施例10：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-氨基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000722
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体65(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-(Boc氨基)-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.67(s,1H),11.73(s,1H),8.15(d,J＝8.8Hz,1H),8.10(s,2H),7.98(s,1H),7.94(dd,J＝13.6,2.4Hz,1H),7.89(d,J＝0.6Hz,1H),7.41(d,J＝1.8Hz,2H),7.40(s,2H),7.21(s,1H),7.14(d,J＝10.0Hz,1H),6.84(t,J＝9.2Hz,1H),5.88(d,J＝8.8Hz,1H),4.07(s,3H).MS-ESI(M+H+):554.2
实施例11：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲硫基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000723
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体66(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲硫基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ11.66(s,1H),8.62(d,J＝8.4Hz,1H),8.32(s,2H),7.90(dd,J＝12.4,2.4Hz,1H),7.84(s,1H),7.54(s,1H),7.30–7.27(m,4H),7.25–7.20(m,1H),7.14(s,1H),6.94(t,J＝8.8Hz,1H),6.33(d,J＝8.4Hz,1H),4.11(s,3H),2.47(s,3H).MS-ESI(M+H+):585.1
实施例12：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000731
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体68(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.95(br s,1H),11.69(s,1H),8.56(d,J＝8.6Hz,1H),8.09(br s,2H),7.99(s,1H),7.95(dd,J＝13.4,2.4Hz,1H),7.91(s,1H),7.46–7.33(m,4H),7.25(s,1H),7.23(d,J＝9.0Hz,1H),6.86(t,J＝9.1Hz,1H),6.34(d,J＝8.7Hz,1H),4.07(s,3H),3.90(s,3H).MS-ESI(M+H+):569.1
实施例13：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲亚砜基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000732
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体67(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲亚砜基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.96(br,1H),11.71(s,1H),8.75(d,J＝7.6Hz,1H),8.06(br,2H),8.00(s,1H),7.99–7.94(m,1H),7.92(s,1H),7.77–7.71(m,1H),7.67(d,J＝5.0Hz,1H),7.46(t,J＝8.8Hz,2H),7.30(d,J＝9.8Hz,2H),7.22(d,J＝7.7Hz,1H),6.86(t,J＝9.1Hz,1H),4.07(s,3H),2.60(s,3H).MS-ESI(M+H+):601.0
实施例14：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-乙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000741
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体69(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-乙氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.94(br s,1H),11.70(s,1H),8.53(d,J＝8.6Hz,1H),8.09(br s,2H),7.99(s,1H),7.95(d,J＝13.5Hz,1H),7.90(s,1H),7.46–7.33(m,4H),7.27–7.17(m,2H),6.85(t,J＝9.2Hz,1H),6.33(d,J＝8.6Hz,1H),4.30–4.20(q,J＝6.4Hz,2H),4.07(s,3H),1.14(t,J＝6.3Hz,3H).MS-ESI(M+H+):583.1
实施例15：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-环丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000742
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体70(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-环丙氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.62(s,1H),8.72(d,J＝8.4Hz,1H),8.27(br s,2H),7.89(dd,J＝12.8,2.0Hz,1H),7.84(s,1H),7.55(s,1H),7.24–7.09(m,6H),6.91(t,J＝8.8Hz,1H),6.35(d,J＝8.8Hz,1H),4.11(s,3H),3.93–3.90(m,1H),0.90–0.85(m,2H),0.76–0.72(m,2H).MS-ESI(M+H+):595.2
实施例16：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-异丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000743
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体71(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-异丙氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.60(s,1H),8.68(d,J＝8.8Hz,1H),8.15(br s,2H),7.88(dd,J＝12.8,2.2Hz,1H),7.83(s,1H),7.56(s,1H),7.22(d,J＝8.2Hz,2H),7.20–7.12(m,4H),6.84(t,J＝8.9Hz,1H),5.96(d,J＝8.8Hz,1H),4.73-4.67(m,1H),4.10(s,3H),1.27(d,J＝6.0Hz,6H).MS-ESI(M+H+):597.2
实施例17：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000751
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体72(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.63(s,1H),8.59(d,J＝8.8Hz,1H),8.09(s,2H),7.99(s,1H),7.95(dd,J＝13.2,2.4Hz,1H),7.91(s,1H),7.46–7.35(m,4H),7.28–7.21(m,2H),6.86(t,J＝9.1Hz,1H),6.45(d,J＝8.8Hz,1H),5.02(q,J＝8.4Hz,2H),4.07(s,3H).MS-ESI(M+H+):637.0
实施例18：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-乙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000752
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体73(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-乙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.58(d,J＝7.6Hz,1H),8.10(s,2H),7.93–7.81(m,3H),7.41–7.28(m,4H),7.23(s,1H),7.17–7.11(m,1H),6.86(t,J＝9.0Hz,1H),6.67(d,J＝7.8Hz,1H),4.49(q,J＝7.2Hz,2H),2.39(q,J＝7.4Hz,2H),1.49(t,J＝7.2Hz,3H),1.14(t,J＝7.4Hz,3H).MS-ESI[M+H]+:581.3
实施例19：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-环丙基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000761
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体74(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-环丙基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.54(d,J＝7.6Hz,1H),8.20(s,2H),7.89(s,2H),7.86(dd,J＝12.8,2.4Hz,1H),7.43–7.30(m,4H),7.24(s,1H),7.18–7.14(m,1H),6.88(d,J＝9.2Hz,1H),6.43(d,J＝8.0Hz,1H),4.50(q,J＝7.2Hz,2H),1.47(t,J＝7.2Hz,3H),1.45–1.41(m,1H),0.92-0.89(m,4H).MS-ESI[M+H]+:593.2
实施例20：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-氯-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000762
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体75(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-氯-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.96(br s,1H),11.57(s,1H),8.51(d,J＝8.0Hz,1H),8.02(br s,3H),7.96(dd,J＝13.2,2.5Hz,1H),7.93(d,J＝0.8Hz,1H),7.61–7.52(m,2H),7.49–7.40(m,2H),7.31–7.24(m,2H),7.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.01-6.86(m,1H),4.47(q,J＝7.2Hz,2H),1.42(t,J＝7.2Hz,3H).MS-ESI(M+H+):587.2
实施例21：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-氨基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000771
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体76(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-Boc氨基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.89(br s,1H),11.72(s,1H),8.16(d,J＝8.8Hz,1H),8.10(br s,2H),8.01(s,1H),7.94(dd,J＝13.6,2.4Hz,1H),7.91(s,1H),7.42-7.40(m,4H),7.21(s,1H),7.13(d,J＝10.0Hz,1H),6.85(t,J＝9.2Hz,1H),5.88(d,J＝8.8Hz,1H),4.46(q,J＝7.1Hz,2H),1.42(t,J＝7.2Hz,3H).MS-ESI(M+H+):568.2
实施例22：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲硫基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000772
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体77(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲硫基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.95(br s,1H),11.70(s,1H),8.43(d,J＝8.0Hz,1H),8.09(br,2H),8.02(s,1H),7.95(d,J＝15.2Hz,1H),7.92(s,1H),7.55–7.46(m,2H),7.42(t,J＝8.8Hz,2H),7.24(d,J＝12.8Hz,2H),6.85(t,J＝9.2Hz,1H),6.61(d,J＝8.4Hz,1H),4.46(q,J＝7.2Hz,2H),2.50(s,3H),1.42(t,J＝7.2Hz,3H).MS-ESI(M+H+):599.1
实施例23：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000773
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体78(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.94(br s,1H),11.69(s,1H),8.56(d,J＝8.6Hz,1H),8.09(br s,2H),8.02(s,1H),7.96(dd,J＝13.4,2.4Hz,1H),7.92(s,1H),7.47–7.33(m,4H),7.25(s,1H),7.22(d,J＝10.1Hz,1H),6.86(t,J＝9.2Hz,1H),6.34(d,J＝8.7Hz,1H),4.47(q,J＝7.1Hz,2H),3.90(s,3H),1.42(t,J＝7.2Hz,3H).MS-ESI(M+H+):583.1
实施例24：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-乙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000781
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体79(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-乙氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.97(br s,1H),11.70(s,1H),8.53(d,J＝8.4Hz,1H),8.09–8.04(m,2H),8.01(s,1H),7.95(dd,J＝13.4,2.3Hz,1H),7.92(s,1H),7.48–7.32(m,4H),7.25(s,1H),7.21(d,J＝9.2Hz,1H),6.86(t,J＝9.2Hz,1H),6.32(d,J＝8.8Hz,1H),4.46(q,J＝7.2Hz,2H),4.25(q,J＝7.2Hz,2H),1.42(t,J＝7.0Hz,3H),1.14(t,J＝7.0Hz,3H).MS-ESI(M+H+):597.1
实施例25：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-环丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000782
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体80(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-环丙氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.95(br s,1H),11.69(s,1H),8.59(d,J＝8.4Hz,1H),8.09(br s,2H),8.02(s,1H),7.96(dd,J＝13.3,2.4Hz,1H),7.92(s,1H),7.43–7.31(m,4H),7.27–7.18(m,2H),6.86(t,J＝9.1Hz,1H),6.56(d,J＝8.4Hz,1H),4.47(q,J＝7.2Hz,2H),4.17–4.13(m,1H),1.42(t,J＝7.2Hz,3H),0.84–0.76(m,2H),0.69–0.60(m,2H).MS-ESI(M+H+):609.1
实施例26：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-异丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000791
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体81(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-异丙氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.96(br,1H),11.71(s,1H),8.52(d,J＝8.8Hz,1H),8.09(br s,2H),8.02(s,1H),7.96(dd,J＝13.4,2.4Hz,1H),7.92(s,1H),7.43–7.30(m,4H),7.25(s,1H),7.21(d,J＝8.9Hz,1H),6.86(t,J＝9.1Hz,1H),6.37(d,J＝8.8Hz,1H),4.89-4.84(m,1H),4.47(q,J＝7.2Hz,2H),1.42(t,J＝7.2Hz,3H),1.17(d,J＝6.0Hz,6H).MS-ESI(M+H+):611.2
实施例27：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000792
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体82(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.63(s,1H),8.59(d,J＝8.4Hz,1H),8.09(s,2H),8.02(s,1H),7.96(dd,J＝13.3,2.4Hz,1H),7.92(s,1H),7.48–7.35(m,4H),7.24(d,J＝11.9Hz,2H),6.86(t,J＝9.1Hz,1H),6.45(d,J＝8.4Hz,1H),5.02(q,J＝8.4Hz,2H),4.47(q,J＝7.2Hz,2H),1.42(t,J＝7.2Hz,3H).MS-ESI(M+H+):651.1
实施例28：N-(4-((5-(1H-吡唑-4-基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000801
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体84(4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)得到。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(d,J＝8.8Hz,1H),8.07(s,2H),7.86–7.69(m,2H),7.19(m,4H),7.06(d,J＝8.8Hz,1H),6.96(s,1H),6.76(t,J＝8.8Hz,1H),5.99(d,J＝8.4Hz,1H),4.71(t,J＝6.4Hz,2H),4.04(t,J＝6.4Hz,2H),3.88(s,3H).MS-ESI[M+H]+:581.1
实施例29：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-羟基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000802
向实施例9(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-氯-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)(0.130g，0.19mmol)的THF(2ml)溶液中加入NaOH(0.076g，1.90mmol)和水(0.8ml)。该混合物在室温搅拌16小时，然后加水(5ml)稀释、浓HCl中和至pH 7、乙酸乙酯(5x10ml)抽提。有机相干燥浓缩后用HPLC纯化，得到黄色固体(3mg，2.8％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.95(br s,1H),12.19(s,1H),8.14–8.06(m,2H),8.00–7.92(m,2H),7.91–7.87(m,2H),7.27–7.16(m,3H),7.15–7.03(m,3H),6.95(s,1H),6.85(t,J＝9.2Hz,1H),5.34(d,J＝9.2Hz,1H),4.06(s,3H).MS-ESI(M+H+):553.1
实施例30：N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-羟基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000803
该化合物是采用合成实施例29的路线、从实施例20(N-(3-氟-4-(1-乙基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-氯-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.94(br s,1H),12.19(s,1H),8.11(br s,2H),7.99–7.92(m,2H),7.90(s,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,1H),7.26–7.08(m,6H),6.95(s,1H),6.85(t,J＝9.2Hz,1H),5.49(d,J＝9.1Hz,1H),4.46(q,J＝7.2Hz,2H),1.41(t,J＝7.2Hz,3H).MS-ESI(M+H+):567.1
实施例31：N-(4-((5-(1H-吡唑-4-基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000811
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体83(4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)得到。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.63(s,1H),8.62–8.46(m,1H),8.05–7.28(m,6H),7.21(s,2H),7.04–6.73(m,2H),6.45(d,J＝4.3Hz,2H),4.71(s,2H),4.06(s,2H),2.08(s,3H).MS-ESI[M+H]+:565.3
实施例32：N-(4-((5-(1H-吡唑-4-基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-乙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000812
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体85(4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-乙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.66(s,1H),8.52(d,J＝8.7Hz,1H),8.02–7.90(m,3H),7.82(s,1H),7.45–7.32(m,4H),7.14(d,J＝9.3Hz,1H),7.04(s,1H),6.73(t,J＝9.2Hz,1H),6.32(d,J＝8.8Hz,1H),4.71(t,J＝6.5Hz,2H),4.24(q,J＝7.0Hz,2H),4.07(t,J＝6.6Hz,2H),1.13(t,J＝7.0Hz,3H).MS-ESI[M+H]+:595.2
实施例33：N-(4-((5-(1H-吡唑-4-基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-环丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000821
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体86(4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-环丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.65(s,1H),8.57(d,J＝8.6Hz,1H),8.00–7.89(m,3H),7.82(s,1H),7.44–7.28(m,4H),7.21–7.12(m,1H),7.05(s,1H),6.73(t,J＝9.2Hz,1H),6.55(d,J＝8.6Hz,1H),4.71(t,J＝6.6Hz,2H),4.14(dd,J＝6.0,3.2Hz,1H),4.07(t,J＝6.5Hz,2H),0.88–0.81(m,2H),0.64(s,2H).MS-ESI[M+H]+:607.2
实施例34：N-(4-((5-(1H-吡唑-4-基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-异丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000822
该化合物是采用合成实施例1的路线、从中间体87(4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-异丙氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.67(s,1H),8.50(d,J＝8.6Hz,1H),8.03–7.88(m,3H),7.82(s,1H),7.45–7.30(m,4H),7.20–7.10(m,1H),7.04(s,1H),6.73(t,J＝9.2Hz,1H),6.36(d,J＝8.9Hz,1H),4.93–4.79(m,1H),4.71(t,J＝6.5Hz,2H),4.07(t,J＝6.6Hz,2H),1.16(d,J＝6.1Hz,6H).MS-ESI[M+H]+:609.2。
实施例35：N-(4-((5-(1H-吡唑-4-基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000823
该化合物是采用合成实施例1路线、从中间体93(4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.03(s,1H),11.60(s,1H),8.57(d,J＝8.6Hz,1H),7.94(dd,J＝13.4,2.6Hz,3H),7.83(s,1H),7.50–7.32(m,4H),7.21–7.13(m,1H),7.05(s,1H),6.74(t,J＝9.2Hz,1H),6.44(d,J＝8.7Hz,1H),5.00(t,J＝8.5Hz,2H),4.71(t,J＝6.6Hz,2H),4.07(t,J＝6.6Hz,2H).MS-ESI[M+H]+:649.1
实施例36：N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-6-二氟甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000831
该化合物是采用合成实施例1路线、从中间体94(N-(3-氟-4-(1-甲基-6-(1-Boc-吡唑-4-基)-1H-吲唑-5-基氧基)苯基)-6-二氟甲氧基-2-氧代-1-(4-氟苯基)-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.53(s,1H),8.24(d,J＝8.1Hz,1H),8.09(s,2H),7.99(s,1H),7.92–7.84(m,2H),7.44–7.18(m,7H),7.07–6.88(m,2H),4.07(s,3H).MS-ESI[M+H]+:605.1
实施例37：N-(4-((5-(1H-吡唑-4-基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-4-基)氧基)-3-氟苯基)-1-(4-氟苯基)-6-二氟甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺的制备
Figure GDA0003227487180000832
该化合物是采用合成实施例1路线、从中间体95(4-(4-(2-氟-4-(1-(4-氟苯基)-6-二氟甲氧基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯氧基)-6,7-二氢吡咯[3,2,1-hi]吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯)得到。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.03(s,1H),10.47(s,1H),8.23(d,J＝8.1Hz,1H),7.84(d,J＝12.2Hz,4H),7.44–7.16(m,6H),7.04(d,J＝8.2Hz,1H),6.91(d,J＝8.1Hz,1H),6.84(t,J＝9.2Hz,1H),4.72(t,J＝6.6Hz,2H),4.07(t,J＝6.5Hz,2H)。MS-ESI[M+H]+:617.1。
采用类似于以上实施例37的合成方法，制备了下表化合物：
Figure GDA0003227487180000841
Figure GDA0003227487180000851
Figure GDA0003227487180000861
活性实施例
实施例1：本发明的化合物对KM12细胞增殖的抑制活性
KM12是一种人结肠癌细胞系,NTRK1在其中高表达，并与TPM3发生基因融合形成TPM3-NTRK1。
【试验方法】：使用Promega公司的
Figure GDA0003227487180000862
Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒评估化合物对KM12细胞增殖的抑制活性。
【仪器】：Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪。
【试验材料】：KM12细胞系(ATCC机构，货号CRL-12496)，96孔透明平底黑壁细胞培养板(Corning公司，货号#3603)，RPMI-1640media(GE公司，货号#SH30027.01)，胎牛血清FBS(Thermo Fisher公司，货号#10099-141)，
Figure GDA0003227487180000863
Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒(Promega公司，货号#G7572)，PBS(Solarbio公司，货号#P1020)，胰酶(ThermoFisher，货号#25200072)，DMSO(Sigma公司，货号#D2650)。
【实验步骤】：复苏KM12细胞时，细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1分钟内融解。取融解后的细胞悬液与含10％FBS的RPMI1640培养基混匀，1000转/分钟离心5分钟，弃上清。取5mL完全培养基(含10％FBS的RPMI1640培养基)重悬细胞沉淀，置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、95％湿度和5％CO2的细胞培养箱中培养。细胞汇合率达到80％左右时进行细胞传代。细胞传代时，弃去旧培养基，使用PBS洗涤细胞两次，加入0.5mL胰酶消化细胞。细胞分散成单细胞，并从细胞培养瓶底脱落时，加入4.5mL新的完全培养基终止消化。将细胞悬液吹打均匀后，保留1/5细胞悬液，加入4mL新的完全培养基，吹打均匀后，细胞瓶置于细胞培养瓶中继续培养。细胞汇合率再次达到80％左右时进行细胞铺板。细胞铺板时，参照细胞传代方法，保留1/5细胞悬液继续培养，将剩余4/5细胞悬液置于15mL离心管中。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。使用完全培养基配制密度为3.33×104个活细胞/mL的细胞悬液，加90μL细胞悬液至96孔细胞培养板中，使细胞培养板中细胞密度为3000个活细胞/mL。设置不含细胞、不含化合物、仅含完全培养基的对照组(即培养液对照)，并设置不含化合物、含细胞的对照组(即细胞对照)。细胞板置于细胞培养箱中培养过夜。
首先使用DMSO连续稀释10mM化合物DMSO储备液，稀释倍数为3.16倍，稀释至第9个浓度，并设置第10个浓度不含化合物的DMSO对照。然后使用PBS稀释含不同浓度化合物的DMSO溶液，稀释倍数为100倍，使各浓度化合物溶液中DMSO含量为1％。最后加10μL上述溶液至对应的细胞培养板中，使化合物起始浓度为10μM，相邻浓度稀释倍数为3.16倍，细胞培养板中DMSO含量为0.1％。
细胞板置于细胞培养箱中继续培养72小时。终点检测时，融化CellTiter-Glo试剂并将细胞板移至室温平衡30分钟，加100μL的CellTiter-Glo至细胞板每个孔中，在定轨摇床上振动5分钟使细胞充分裂解，将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号，用多功能酶标仪全波长扫描各孔的冷光值。
【受试样品】实施例1-6的化合物和顺铂(Cisplatin)(阳性对照化合物)
LOXO-101：
Figure GDA0003227487180000871
(Doebele,R.C.等人，Cancer Discov.2015,5,1049-1057)
RXDX-101：
Figure GDA0003227487180000872
(C.Rolfo等人，Expert Opin.Investig.Drugs 2015,24(11),1493-1500)
Merestinib：
Figure GDA0003227487180000873
【数据分析】使用下列公式计算各浓度化合物作用下细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％
使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。
表1.实施例1-6化合物对KM12细胞增殖的抑制活性(IC50，μM)
化合物 KM-12，IC50(μM)
实施例1 0.0156
实施例2 0.0091
实施例3 0.0167
实施例4 0.0310
实施例5 0.0051
实施例6 0.0063
Merestinib 0.0087
LOXO-101 0.0083
RXDX-101 0.0051
Cisplatin 27.3059
采用基本上类似于上述的实验方法、条件和步骤，在分别的试验中考察了以下实施例化合物对照merestinib对KM12细胞增殖的抑制活性，结果见下表
表1-1
化合物 KM-12，IC50(μM)
Merestinib 0.033
实施例18 0.032
实施例19 0.032
实施例12 0.016
实施例23 0.032
表1-2
化合物 KM-12，IC50(μM)
Merestinib 0.059
实施例14 0.024
实施例15 0.017
实施例16 0.007
实施例17 0.019
实施例11 0.035
实施例25 0.029
表1-3
化合物 KM-12，IC50(μM)
Merestinib 0.027
实施例24 0.023
实施例26 0.018
实施例2：本发明的化合物对Ba/F3 ETV6-NTRK2细胞增殖的抑制活性
Ba/F3 ETV6-NTRK2是康源博创生物科技(北京)有限公司构建于小鼠原B细胞Ba/F3的一种稳转细胞系,NTRK2在其中高表达，并与ETV6发生基因融合形成ETV6-NTRK2。
【试验方法】：使用Promega公司的
Figure GDA0003227487180000891
Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒评估化合物对Ba/F3 ETV6-NTRK2C细胞增殖的抑制活性。
【仪器】：Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪。
【试验材料】：Ba/F3 ETV6-NTRK2细胞系(康源博创生物科技(北京)有限公司构建)，96孔透明平底黑壁细胞培养板(Corning公司，货号#3603)，RPMI-1640media(GE公司，货号#SH30027.01)，胎牛血清FBS(Thermo Fisher公司，货号#10099-141)，
Figure GDA0003227487180000892
Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega公司，货号#G7572)，PBS(Solarbio公司，货号#P1020)，DMSO(Sigma公司，货号#D2650)。
【实验步骤】：复苏Ba/F3 ETV6-NTRK2细胞时，细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1分钟内融解。取融解后的细胞悬液与含10％FBS的RPMI1640培养基混匀，1000转/分钟离心5分钟，弃上清。取5mL完全培养基(含10％FBS的RPMI1640培养基)重悬细胞沉淀，置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、95％湿度和5％CO2的细胞培养箱中培养。细胞数量达到106cells/mL左右时进行细胞传代。细胞传代时，直接将旧细胞悬液吹打均匀后，保留1/5细胞悬液，加入4mL新的完全培养基，吹打均匀后，细胞瓶置于细胞培养瓶中继续培养。细胞数量再次达到106cells/mL左右时进行细胞铺板。细胞铺板时，参照细胞传代方法，保留1/5细胞悬液继续培养，将剩余4/5细胞悬液置于15mL离心管中。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。使用完全培养基配制密度为5.56×104个活细胞/mL的细胞悬液，加90μL细胞悬液至96孔细胞培养板中，使细胞培养板中细胞密度为5000个活细胞/mL。设置不含细胞、不含化合物、仅含完全培养基的对照组(即培养液对照)，并设置不含化合物、含细胞的对照组(即细胞对照)。细胞板置于细胞培养箱中培养过夜。首先使用DMSO连续稀释10mM化合物DMSO储备液，稀释倍数为3.16倍，稀释至第9个浓度，并设置第10个浓度不含化合物的DMSO对照。然后使用PBS稀释含不同浓度化合物的DMSO溶液，稀释倍数为100倍，使各浓度化合物溶液中DMSO含量为1％。最后加10μL上述溶液至对应的细胞培养板中，使化合物起始浓度为10μM，相邻浓度稀释倍数为3.16倍，细胞培养板中DMSO含量为0.1％。细胞板置于细胞培养箱中继续培养72小时。终点检测时，融化CellTiter-Glo试剂并将细胞板移至室温平衡30分钟，加100μL的CellTiter-Glo至细胞板每个孔中，在定轨摇床上振动5分钟使细胞充分裂解，将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号，用多功能酶标仪全波长扫描各孔的冷光值。
【受试样品】实施例1-6化合物和LOXO-101(阳性对照化合物)、Merestinib(对比化合物)
【数据分析】使用下列公式计算各浓度化合物作用下细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％
使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。
表2.实施例化合物对Ba/F3 ETV6-NTRK2细胞增殖的抑制活性(IC50，μM)
化合物 Ba/F3 ETV6-NTRK2，IC50(uM)
实施例1 0.428
实施例2 0.269
实施例3 0.341
实施例4 0.876
实施例5 0.128
实施例6 0.209
Merestinib 0.211
LOXO-101 0.069
实施例3：本发明的化合物对Ba/F3 ETV6-NTRK3细胞增殖的抑制活性
Ba/F3 ETV6-NTRK3是康源博创生物科技(北京)有限公司构建于小鼠原B细胞Ba/F3的一种稳转细胞系,NTRK3在其中高表达，并与ETV6发生基因融合形成ETV6-NTRK3。
【试验方法】：使用Promega公司的
Figure GDA0003227487180000901
Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒评估化合物对Ba/F3 ETV6-NTRK3细胞增殖的抑制活性。
【仪器】：Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪。
【试验材料】：Ba/F3 ETV6-NTRK3细胞系(康源博创生物科技(北京)有限公司构建)，96孔透明平底黑壁细胞培养板(Corning公司，货号#3603)，RPMI-1640media(GE公司，货号#SH30027.01)，胎牛血清FBS(Thermo Fisher公司，货号#10099-141)，
Figure GDA0003227487180000902
Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega公司，货号#G7572)，PBS(Solarbio公司，货号#P1020)，DMSO(Sigma公司，货号#D2650)。
【实验步骤】：复苏Ba/F3 ETV6-NTRK3细胞时，细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1分钟内融解。取融解后的细胞悬液与含10％FBS的RPMI1640培养基混匀，1000转/分钟离心5分钟，弃上清。取5mL完全培养基(含10％FBS的RPMI1640培养基)重悬细胞沉淀，置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、95％湿度和5％CO2的细胞培养箱中培养。细胞数量达到106cells/mL左右时进行细胞传代。细胞传代时，直接将旧细胞悬液吹打均匀后，保留1/5细胞悬液，加入4mL新的完全培养基，吹打均匀后，细胞瓶置于细胞培养瓶中继续培养。细胞数量再次达到106cells/mL左右时进行细胞铺板。细胞铺板时，参照细胞传代方法，保留1/5细胞悬液继续培养，将剩余4/5细胞悬液置于15mL离心管中。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。使用完全培养基配制密度为5.56×104个活细胞/mL的细胞悬液，加90μL细胞悬液至96孔细胞培养板中，使细胞培养板中细胞密度为5000个活细胞/mL。设置不含细胞、不含化合物、仅含完全培养基的对照组(即培养液对照)，并设置不含化合物、含细胞的对照组(即细胞对照)。细胞板置于细胞培养箱中培养过夜。首先使用DMSO连续稀释10mM化合物DMSO储备液，稀释倍数为3.16倍，稀释至第9个浓度，并设置第10个浓度不含化合物的DMSO对照。然后使用PBS稀释含不同浓度化合物的DMSO溶液，稀释倍数为100倍，使各浓度化合物溶液中DMSO含量为1％。最后加10μL上述溶液至对应的细胞培养板中，使化合物起始浓度为10μM，相邻浓度稀释倍数为3.16倍，细胞培养板中DMSO含量为0.1％。细胞板置于细胞培养箱中继续培养72小时。终点检测时，融化CellTiter-Glo试剂并将细胞板移至室温平衡30分钟，加100μL的CellTiter-Glo至细胞板每个孔中，在定轨摇床上振动5分钟使细胞充分裂解，将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号，用多功能酶标仪全波长扫描各孔的冷光值。
【受试样品】实施例化合物和LOXO-101(阳性对照化合物)、Merestinib(对比化合物)
【数据分析】使用下列公式计算各浓度化合物作用下细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％
使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。
表3.实施例对Ba/F3 ETV6-NTRK3细胞增殖的抑制活性(IC50，uM)
化合物 Ba/F3 ETV6-NTRK3，IC50(uM)
实施例1 0.435
实施例2 0.094
实施例3 0.663
实施例4 0.762
实施例5 0.060
实施例6 0.284
Merestinib 0.684
LOXO-101 0.005
实施例4：本发明的化合物对Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C细胞增殖的抑制活性
Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C是康源博创生物科技(北京)有限公司构建于小鼠原B细胞Ba/F3的一种稳转细胞系,NTRK1在667位G突变为C且高表达，并与LMNA发生基因融合形成LMNA-NTRK1-G667C。
【试验方法】：使用Promega公司的
Figure GDA0003227487180000921
Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒评估化合物对Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C细胞增殖的抑制活性。
【仪器】：Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪。
【试验材料】：Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C细胞系(康源博创生物科技(北京)有限公司构建)，96孔透明平底黑壁细胞培养板(Corning公司，货号#3603)，RPMI-1640media(GE公司，货号#SH30027.01)，胎牛血清FBS(Thermo Fisher公司，货号#10099-141)，
Figure GDA0003227487180000922
Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega公司，货号#G7572)，PBS(Solarbio公司，货号#P1020)，DMSO(Sigma公司，货号#D2650)。
【实验步骤】：复苏Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C细胞时，细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1分钟内融解。取融解后的细胞悬液与含10％FBS的RPMI1640培养基混匀，1000转/分钟离心5分钟，弃上清。取5mL完全培养基(含10％FBS的RPMI1640培养基)重悬细胞沉淀，置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、95％湿度和5％CO2的细胞培养箱中培养。细胞数量达到106cells/ml左右时进行细胞传代。细胞传代时，直接将旧细胞悬液吹打均匀后，保留1/5细胞悬液，加入4mL新的完全培养基，吹打均匀后，细胞瓶置于细胞培养瓶中继续培养。细胞数量再次达到106cells/ml左右时进行细胞铺板。细胞铺板时，参照细胞传代方法，保留1/5细胞悬液继续培养，将剩余4/5细胞悬液置于15mL离心管中。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。使用完全培养基配制密度为5.56×104个活细胞/mL的细胞悬液，加90μL细胞悬液至96孔细胞培养板中，使细胞培养板中细胞密度为5000个活细胞/mL。设置不含细胞、不含化合物、仅含完全培养基的对照组(即培养液对照)，并设置不含化合物、含细胞的对照组(即细胞对照)。细胞板置于细胞培养箱中培养过夜。首先使用DMSO连续稀释10mM化合物DMSO储备液，稀释倍数为3.16倍，稀释至第9个浓度，并设置第10个浓度不含化合物的DMSO对照。然后使用PBS稀释含不同浓度化合物的DMSO溶液，稀释倍数为100倍，使各浓度化合物溶液中DMSO含量为1％。最后加10μL上述溶液至对应的细胞培养板中，使化合物起始浓度为10μM，相邻浓度稀释倍数为3.16倍，细胞培养板中DMSO含量为0.1％。细胞板置于细胞培养箱中继续培养72小时。终点检测时，融化CellTiter-Glo试剂并将细胞板移至室温平衡30分钟，加100μL的CellTiter-Glo至细胞板每个孔中，在定轨摇床上振动5分钟使细胞充分裂解，将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号，用多功能酶标仪全波长扫描各孔的冷光值。
【受试样品】实施例化合物和LOXO-101(阳性对照化合物)
【数据分析】使用下列公式计算各浓度化合物作用下细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％
使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。
表4.实施例化合物对Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C细胞增殖的抑制活性(IC50，uM)
化合物 Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C，IC50(uM)
实施例1 0.0020
实施例2 0.0011
实施例3 0.0016
实施例4 0.0028
实施例5 <0.001
实施例6 0.00066
Merestinib 0.0011
LOXO-101 2.409
采用基本上类似于上述的实验方法和步骤，在分别的试验中考察了若干本发明化合物对照merestinib对Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C细胞增殖的抑制活性，结果见下表
表4-1
化合物 Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C,IC50(μM)
Merestinib 0.001
实施例18 0.001
实施例19 0.002
实施例12 <0.001
实施例23 0.001
表4-2
化合物 Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C,IC50(μM)
Merestinib 0.0141
实施例14 0.0086
实施例15 0.0108
实施例16 0.0107
实施例11 0.0105
实施例24 0.0173
实施例26 0.0175
实施例5：本发明的化合物对Ba/F3 LMNA-NTRK1-G595R细胞增殖的抑制活性
Ba/F3 LMNA-NTRK1-G595R是康源博创生物科技(北京)有限公司构建于小鼠原B细胞Ba/F3的一种稳转细胞系,NTRK1在595位G突变为R且高表达，并与LMNA发生基因融合形成LMNA-NTRK1。
【试验方法】：使用Promega公司的
Figure GDA0003227487180000941
Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒评估化合物对Ba/F3 LMNA-NTRK1-G595R细胞增殖的抑制活性。
【仪器】：Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪。
【试验材料】：Ba/F3 LMNA-NTRK1-G595R细胞系(康源博创生物科技(北京)有限公司构建)，96孔透明平底黑壁细胞培养板(Corning公司，货号#3603)，RPMI-1640media(GE公司，货号#SH30027.01)，胎牛血清FBS(Thermo Fisher公司，货号#10099-141)，
Figure GDA0003227487180000942
Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega公司，货号#G7572)，PBS(Solarbio公司，货号#P1020)，DMSO(Sigma公司，货号#D2650)。
【实验步骤】：复苏Ba/F3 LMNA-NTRK1-G595R细胞时，细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1分钟内融解。取融解后的细胞悬液与含10％FBS的RPMI1640培养基混匀，1000转/分钟离心5分钟，弃上清。取5mL完全培养基(含10％FBS的RPMI1640培养基)重悬细胞沉淀，置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、95％湿度和5％CO2的细胞培养箱中培养。细胞数量达到106cells/ml左右时进行细胞传代。细胞传代时，直接将旧细胞悬液吹打均匀后，保留1/5细胞悬液，加入4mL新的完全培养基，吹打均匀后，细胞瓶置于细胞培养瓶中继续培养。细胞数量再次达到106cells/ml左右时进行细胞铺板。细胞铺板时，参照细胞传代方法，保留1/5细胞悬液继续培养，将剩余4/5细胞悬液置于15mL离心管中。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。使用完全培养基配制密度为5.56×104个活细胞/mL的细胞悬液，加90μL细胞悬液至96孔细胞培养板中，使细胞培养板中细胞密度为5000个活细胞/mL。设置不含细胞、不含化合物、仅含完全培养基的对照组(即培养液对照)，并设置不含化合物、含细胞的对照组(即细胞对照)。细胞板置于细胞培养箱中培养过夜。首先使用DMSO连续稀释10mM化合物DMSO储备液，稀释倍数为3.16倍，稀释至第9个浓度，并设置第10个浓度不含化合物的DMSO对照。然后使用PBS稀释含不同浓度化合物的DMSO溶液，稀释倍数为100倍，使各浓度化合物溶液中DMSO含量为1％。最后加10μL上述溶液至对应的细胞培养板中，使化合物起始浓度为10μM，相邻浓度稀释倍数为3.16倍，细胞培养板中DMSO含量为0.1％。细胞板置于细胞培养箱中继续培养72小时。终点检测时，融化CellTiter-Glo试剂并将细胞板移至室温平衡30分钟，加100μL的CellTiter-Glo至细胞板每个孔中，在定轨摇床上振动5分钟使细胞充分裂解，将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号，用多功能酶标仪全波长扫描各孔的冷光值。
【受试样品】实施例化合物和LOXO-101(阳性对照化合物)
【数据分析】使用下列公式计算各浓度化合物作用下细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％
使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。
表5.实施例对Ba/F3 LMNA-NTRK1-G595R细胞增殖的抑制活性(IC50，uM)
化合物 Ba/F3 LMNA-NTRK1-G595R，IC50(uM)
实施例1 1.435
实施例2 0.752
实施例3 3.152
实施例4 4.654
实施例5 0.799
实施例6 0.747
Merestinib 1.015
LOXO-101 3.657
实施例6：本发明的化合物对Ba/F3 ETV6-NTRK2-G639R细胞增殖的抑制活性
Ba/F3 ETV6-NTRK2-G639R是康源博创生物科技(北京)有限公司构建于小鼠原B细胞Ba/F3的一种稳转细胞系,NTRK2在639位G突变为R且高表达，并与ETV6发生基因融合形成ETV6-NTRK2。
【试验方法】：使用Promega公司的
Figure GDA0003227487180000951
Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒评估化合物对Ba/F3 ETV6-NTRK2-G639R细胞增殖的抑制活性。
【仪器】：Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪。
【试验材料】：Ba/F3 ETV6-NTRK2-G639R细胞系(康源博创生物科技(北京)有限公司构建)，96孔透明平底黑壁细胞培养板(Corning公司，货号#3603)，RPMI-1640media(GE公司，货号#SH30027.01)，胎牛血清FBS(Thermo Fisher公司，货号#10099-141)，
Figure GDA0003227487180000952
Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega公司，货号#G7572)，PBS(Solarbio公司，货号#P1020)，DMSO(Sigma公司，货号#D2650)。
【实验步骤】：复苏Ba/F3 ETV6-NTRK2-G639R细胞时，细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1分钟内融解。取融解后的细胞悬液与含10％FBS的RPMI1640培养基混匀，1000转/分钟离心5分钟，弃上清。取5mL完全培养基(含10％FBS的RPMI1640培养基)重悬细胞沉淀，置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、95％湿度和5％CO2的细胞培养箱中培养。细胞数量达到106cells/ml左右时进行细胞传代。细胞传代时，直接将旧细胞悬液吹打均匀后，保留1/5细胞悬液，加入4mL新的完全培养基，吹打均匀后，细胞瓶置于细胞培养瓶中继续培养。细胞数量再次达到106cells/ml左右时进行细胞铺板。细胞铺板时，参照细胞传代方法，保留1/5细胞悬液继续培养，将剩余4/5细胞悬液置于15mL离心管中。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。使用完全培养基配制密度为5.56×104个活细胞/mL的细胞悬液，加90μL细胞悬液至96孔细胞培养板中，使细胞培养板中细胞密度为5000个活细胞/mL。设置不含细胞、不含化合物、仅含完全培养基的对照组(即培养液对照)，并设置不含化合物、含细胞的对照组(即细胞对照)。细胞板置于细胞培养箱中培养过夜。首先使用DMSO连续稀释10mM化合物DMSO储备液，稀释倍数为3.16倍，稀释至第9个浓度，并设置第10个浓度不含化合物的DMSO对照。然后使用PBS稀释含不同浓度化合物的DMSO溶液，稀释倍数为100倍，使各浓度化合物溶液中DMSO含量为1％。最后加10μL上述溶液至对应的细胞培养板中，使化合物起始浓度为10μM，相邻浓度稀释倍数为3.16倍，细胞培养板中DMSO含量为0.1％。细胞板置于细胞培养箱中继续培养72小时。终点检测时，融化CellTiter-Glo试剂并将细胞板移至室温平衡30分钟，加100μL的CellTiter-Glo至细胞板每个孔中，在定轨摇床上振动5分钟使细胞充分裂解，将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号，用多功能酶标仪全波长扫描各孔的冷光值。
【受试样品】实施例化合物和LOXO-101(阳性对照化合物)
【数据分析】使用下列公式计算各浓度化合物作用下细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％
使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。
表6.实施例对Ba/F3 ETV6-NTRK2-G639R细胞增殖的抑制活性(IC50，uM)
化合物 Ba/F3 ETV6-NTRK2-G639R，IC50(uM)
实施例1 3.116
实施例2 1.878
实施例3 9.866
实施例4 >10
实施例5 2.691
实施例6 2.792
Merestinib 3.038
LOXO-101 >10
实施例7：本发明的化合物对Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C细胞增殖的抑制活性
Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C是康源博创生物科技(北京)有限公司构建于小鼠原B细胞Ba/F3的一种稳转细胞系,NTRK3在639位G突变为C且高表达，并与ETV6发生基因融合形成ETV6-NTRK3。
【试验方法】：使用Promega公司的
Figure GDA0003227487180000971
Luminescent Cell ViabilityAssay试剂盒评估化合物对Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C细胞增殖的抑制活性。
【仪器】：Molecular Devices公司的Spectramax M3多功能酶标仪。
【试验材料】：Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C细胞系(康源博创生物科技(北京)有限公司构建)，96孔透明平底黑壁细胞培养板(Corning公司，货号#3603)，RPMI-1640media(GE公司，货号#SH30027.01)，胎牛血清FBS(Thermo Fisher公司，货号#10099-141)，
Figure GDA0003227487180000972
Luminescent Cell Viability Assay试剂盒(Promega公司，货号#G7572)，PBS(Solarbio公司，货号#P1020)，DMSO(Sigma公司，货号#D2650)。
【实验步骤】：复苏Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C细胞时，细胞冻存管于37℃水浴中快速摇动使其在1分钟内融解。取融解后的细胞悬液与含10％FBS的RPMI1640培养基混匀，1000转/分钟离心5分钟，弃上清。取5mL完全培养基(含10％FBS的RPMI1640培养基)重悬细胞沉淀，置于底面积25cm2的细胞培养瓶中，放入37℃、95％湿度和5％CO2的细胞培养箱中培养。细胞数量达到106cells/ml左右时进行细胞传代。细胞传代时，直接将旧细胞悬液吹打均匀后，保留1/5细胞悬液，加入4mL新的完全培养基，吹打均匀后，细胞瓶置于细胞培养瓶中继续培养。细胞数量再次达到106cells/ml左右时进行细胞铺板。细胞铺板时，参照细胞传代方法，保留1/5细胞悬液继续培养，将剩余4/5细胞悬液置于15mL离心管中。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上。使用完全培养基配制密度为5.56×104个活细胞/mL的细胞悬液，加90μL细胞悬液至96孔细胞培养板中，使细胞培养板中细胞密度为5000个活细胞/mL。设置不含细胞、不含化合物、仅含完全培养基的对照组(即培养液对照)，并设置不含化合物、含细胞的对照组(即细胞对照)。细胞板置于细胞培养箱中培养过夜。首先使用DMSO连续稀释10mM化合物DMSO储备液，稀释倍数为3.16倍，稀释至第9个浓度，并设置第10个浓度不含化合物的DMSO对照。然后使用PBS稀释含不同浓度化合物的DMSO溶液，稀释倍数为100倍，使各浓度化合物溶液中DMSO含量为1％。最后加10μL上述溶液至对应的细胞培养板中，使化合物起始浓度为10μM，相邻浓度稀释倍数为3.16倍，细胞培养板中DMSO含量为0.1％。细胞板置于细胞培养箱中继续培养72小时。终点检测时，融化CellTiter-Glo试剂并将细胞板移至室温平衡30分钟，加100μL的CellTiter-Glo至细胞板每个孔中，在定轨摇床上振动5分钟使细胞充分裂解，将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号，用多功能酶标仪全波长扫描各孔的冷光值。
【受试样品】实施例化合物和LOXO-101(阳性对照化合物)
【数据分析】使用下列公式计算各浓度化合物作用下细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％
使用GraphPad Prism 5.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。
表7.实施例对Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C细胞增殖的抑制活性(IC50，uM)
化合物 Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C，IC50(uM)
实施例1 0.033
实施例2 0.020
实施例3 0.018
实施例4 0.034
实施例5 0.0068
实施例6 0.016
Merestinib 0.010
LOXO-101 1.891
采用基本上类似于上述的实验方法和步骤，在分别的试验中考察了若干本发明化合物对照merestinib对Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C细胞增殖的抑制活性，结果见下表
表7-1
化合物 Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C,IC50(μM)
Merestinib 0.013
实施例18 0.012
实施例19 0.014
实施例12 0.003
实施例23 0.011
表7-2
化合物 Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C,IC50(μM)
Merestinib 0.0017
实施例14 0.0016
实施例15 0.0019
实施例16 0.0012
实施例17 0.0037
实施例11 0.0018
实施例25 0.0063
实施例24 0.0035
实施例27 0.0030
实施例26 0.0031
实施例8：本发明的化合物对MKN45细胞增殖的抑制活性
MKN45是一种人类低分化胃癌细胞系，MET在其中高表达。细胞增殖实验根据文献方法进行(Zhang,D.et al.Bioorg.Med.Chem.2013,21,6804；Riss TL,Moravec RA,NilesAL,et al.Cell Viability Assays.2013May 1[Updated 2016Jul 1].In:SittampalamGS,Grossman A,Brimacombe K,et al.,editors.Assay Guidance Manual[Internet].Bethesda(MD):Eli Lilly&Company and the National Center for AdvancingTranslational Sciences；2004-.Available from:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/)
表8.部分实施例化合物对MKN45细胞增殖的抑制活性(IC50，μM)
化合物 MKN45，IC50(μM)
实施例12 0.004
实施例14 0.011
实施例16 0.009
实施例17 0.015
实施例11 0.012
Merestinib 0.019
LOXO-101 >10
实验结果表明，本发明的化合物对Merestinib主要作用靶点Met高表达的细胞MKN45具有更有效的抑制作用。
实施例9：所选本发明化合物对KM12、Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C、Ba/F3ETV6-NTRK3-G696C细胞增殖的抑制作用
采用类似于以上活性实施例1、4和7的实验方法和条件，考察了以下所选本发明化合物在各个细胞系中的抑制活性，结果见下表：
表9.部分实施例化合物的细胞增殖抑制活性(IC50，μM)
化合物 KM12 Ba/F3 LMNA-NTRK1-G667C Ba/F3 ETV6-NTRK3-G696C
实施例28 0.056 0.0198 0.0036
实施例31 0.071 0.0330 0.0053
实施例32 0.067 0.0190 0.0047
实施例34 0.037 0.0237 0.0048
实施例10：本发明化合物对其他致癌激酶的抑制活性
该实验根据Eurofins DiscoverX Corporation(11180Roselle St.Suite D,SanDiego,CA USA,www.discoverX.com)公司的激酶活性测定的标准方法完成。具体而言，实验采用KINOMEscanTM筛选平台进行，该平台采用活性位点导向的竞争结合测定法，定量测量供试化合物和超过数百种人类激酶和疾病相关突变体之间的相互作用。该筛选平台的工作原理和激酶测定方法为本领域所熟知，例如可参见www.discoverX.com。
本发明化合物实施例12在2μM浓度时对下表10所列激酶显示>90％的抑制活性。
表10
Figure GDA0003227487180001001
实验结果表明，本发明的化合物除了抑制TRKA、TRKB、TRKC激酶的活性外，还抑制其它确认的、研究中的、正在出现的诸多抗癌药激酶靶点(ROS1、RAF1、PDGFRB、CSF1R、LCK、IKKa、IKKb、PLK、AXL、TIE、LOK、TIE1、DDR)，以及应用中的抗癌药靶点和它们的抗药突变体靶点(FLT3、FLT3(N841I)、FLT3(K663Q)、FLT3(D835V)、FLT3(ITD)、KIT、KIT(L576P)、KIT(V559D)、KIT(V559D,T670I)、MET、MET(Y1235D)、MET(Y1250T)、RET、RET(M918T)等，在临床应用中将会表现出广谱抗癌效果。
实施例11：本发明化合物在KM12异种移植物小鼠模型中的抗肿瘤活性
【仪器】：API-400-Qtrap Shimadzu 20AC
【试验材料和条件】：KM12细胞系由维亚生物科技提供，BALB/c裸鼠，雌性，购自上海灵畅生物科技有限公司
【实验步骤】：将7周无胸腺雌性裸鼠在右肋侧皮下注射5x106个KM12细胞，以3个尺寸每3天测量肿瘤1次，并计算体积V＝Dxdxd/2，同时获得小鼠体重。当平均肿瘤尺寸达到180mm3时，在肿瘤接种后约6天开始给药，给药12天(或18天)处死小鼠。为了药代动力学和药效学分析，在最后一次给药后的4小时和8小时从动物取得血浆样品和肿瘤样品。
将来自以上处理的动物的肿瘤样品称重，加入9体积的冰水，通过组织匀浆机将该肿瘤组织均化。转移50μL血浆或肿瘤均化物样品至96孔板，加入250μL ACN(含有260ng/ml地塞米松作为内标)以沉淀蛋白。将板在4℃以4000rpm离心20分钟，转移150μL上清液至另一新的96孔板，与150μL 0.1％FA水混合，取10μL注射至LC-MS/MS，采集数据。
【实验结果】
给药后第12天的数据表明，所测试的本发明实施例化合物均显著抑制了肿瘤的生长，例如部分化合物显示出比Merestinib更为优异的抑制肿瘤生长活性(图1-A)。对给药后第12天和18天血浆和肿瘤中的药物浓度的检测显示，所测试的本发明实施例化合物相比Merestinib能够以更高的浓度被富集在血浆和肿瘤组织中(图1-B、图1-C)，从而有望发挥更强的抗肿瘤活性。
实施例12：本发明化合物与Merestinib的激酶谱比较
将本发明化合物实施例12在2μM浓度时对各类激酶的抑制活性与Merestinib做了对比。实验根据Eurofins DiscoverX Corporation(11180Roselle St.Suite D,SanDiego,CA USA,www.discoverX.com)公司的激酶活性测定的标准方法完成。在2μM浓度下，本发明化合物实施例12与现有技术Merestinib相比，在激酶活性谱方面显示出明显不同的趋势，见图2(抑制率差异>20％的激酶)。
化合物的理化性质决定其成药性，影响化合物成药性的性质参数以及业内认可的实验方法参见(Kerns,Edward H.and Di Li(2008).Drug-like Properties:Concepts,Structure Design and Methods:from ADME to Toxicity Optimization.San Diego:Academic Press)。本发明的实验结果显示，本发明化合物显示出在诸多成药性质方面显著优于现有技术的抑制剂例如merestinib。以下通过肝微粒体代谢稳定性、P450酶系抑制、溶解性示例说明本发明化合物整体成药性相对于现有技术的显著优势。
实施例13：本发明化合物的肝微粒体代谢稳定性试验
根据本领域常规的体外代谢稳定性研究的标准方法，例如(Kerns,Edward H.andDi Li(2008).Drug-like Properties:Concepts,Structure Design and Methods:fromADME to Toxicity Optimization.San Diego:Academic Press；Di,Li等人，Optimizationof a Higher Throughput Microsomal Stability Screening Assay for ProfilingDrug Discovery Candidates,J.Biomol.Screen.2003,8(4),453.)中所述的方法，类似地如下进行本发明化合物的肝微粒体代谢稳定性试验。
通过肝微粒体稳定性实验评价化合物在5个物种(小鼠、大鼠、狗、猴、人)的体外代谢稳定性。配制0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH 7.4，含1.0mM EDTA)。将待测化合物和对照化合物配制成10mM的DMSO溶液，然后取10μL 10mM DMSO化合物溶液加入到190μL乙腈中，从而制备为500uM的化合物溶液。将肝微粒体(Sekisui XenoTech,LLC.，人肝微粒体，货号H0610；比格犬肝微粒体，货号D1000；食蟹猴肝微粒体，货号P2073；大鼠肝微粒体，货号R1073；小鼠肝微粒体，货号M1000)取出放在冰上缓慢融化后，取18.75μL该肝微粒体溶液(20mg/mL)加入和1.5μL的500μM化合物溶液加入到479.75μL的0.1M磷酸钾缓冲溶液，制备浓度为1.5μM化合物的0.75mg/mL的肝微粒体工作溶液。配制6mM的NADPH(SIGMA，货号V900362)水溶液。取0.2mL 2mg/mL的内标储存液(丙咪嗪的乙腈溶液)加入到1000mL乙腈(SIGMA,货号271004)中，配制成反应终止液并保存于4℃。
取6个深孔板，分别标记为T0、T5、T15、T30、T45和NCF60(无NADPH阴性对照)。向对应板各孔中分别加入30μL1.5μM对照化合物或待测化合物的0.75mg/mL的肝微粒体工作溶液。用封板膜封闭后，将所有微孔板放置于37℃水浴锅预热5分钟，将6mM NADPH溶液放置于37℃水浴锅预热5分钟，然后按照逆序时间点依次取15μL的NADPH溶液加入到各个孔中，首先加T45板，15分钟后加T30板，然后15分钟后加T15板，10分钟后加T5板。NCF60板不加NADPH，加入15μL的去离子水。此时向T0板中加入135μL的冰预冷的反应终止液，并加入15μLNADPH溶液。待反应时间结束，依次向T5、T15、T30、T45板中各孔加入135μL的冰预冷的反应终止液。所有样品在4度600rpm离心10分钟，然后在5594g离心15分钟(ThermoMultifugex3R)。取6个96-孔板，分别对应标记并在各孔中加入50μL超纯水(Millipore，ZMQS50F01)，然后取50μL的离心上清加入到对应板的对应孔中，然后用LC-MS/MS-014(API4000),UPLC-MS/MS-11(API4000),LC-MS/MS-034(API-6500+)进行分析。将T0时间点待测化合物的浓度(C0)作为100％，其他孵育时间点的浓度转换为百分剩余量，将各时间点的百分剩余量的自然对数对孵育时间作线性回归，得斜率k，然后按照下面公式计算肝微粒体清除速率
Figure GDA0003227487180001021
和体外半衰期(T1/2)：
Figure GDA0003227487180001022
Figure GDA0003227487180001023
Figure GDA0003227487180001024
表11：本发明化合物实施例12与Merestinib的肝微粒体代谢参数比较
Figure GDA0003227487180001031
本发明的研究显示，本发明化合物如实施例12相比现有技术的抑制剂merestinib，显示出在肝微粒体中显著改进的代谢稳定性，代谢半衰期更长，且固有清除率更低，从而有望在临床使用中提供更为持久的药效，相应地可降低为达到相同的治疗强度所需的药物剂量。
实施例14：本发明化合物对细胞色素P450酶系的抑制作用
根据本领域常规的细胞色素P450酶系研究的标准方法，例如(Kerns,EdwardH.and Di Li(2008).Drug-like Properties:Concepts,Structure Design and Methods:from ADME to Toxicity Optimization.San Diego:Academic Press；Lin,Tong等人，InVitro Assessment of Cytochrome P450 Inhibition:Strategies for Increasing LC/MS-Based Assay Throughput Using a One-Point IC50 Method and MultiplexingHigh-Performance Liquid Chromatography；J.Pharm.Sci.2007,96(9),2485.)中所述的方法，类似地如下考察本发明化合物对细胞色素P450酶系的抑制作用。
通过检测人肝微粒体对Cyp450不同亚型的底物的代谢情况来评价待测化合物。各Cyp450酶的代谢物、底物以及特异性抑制剂的信息见表12-14。将肝微粒体(SekisuiXenoTech,LLC.，人肝微粒体，货号H0610)取出放在冰上缓慢融化后，取0.482mL该肝微粒体溶液(20mg/mL)加入到30mL 100mM的磷酸钾溶液，制备浓度为0.316mg/mL的肝微粒体工作溶液。将待测化合物和不同亚型Cyp450的特异性抑制剂(作为对照)配制成10mM的DMSO溶液，然后取20μL 10mM DMSO化合物溶液加入到180μL的乙腈中得到1mM的化合物溶液。取2μL1mM的待测化合物或抑制剂溶液加入到150μL 0.316mg/mL的肝微粒体工作溶液中，得到13.16μM的化合物的工作溶液。称取45.3mg NADPH(SIGMA，货号V900362)加入到13.59mL的去离子水中配制成4mM NADPH水溶液。取0.2mL 2mg/mL的内标储存液(地塞米松的乙腈溶液)加入到1000mL的乙腈(SIGMA,货号271004)中，配制成反应终止液并保存于4℃。
表12：P450代谢物来源
P450亚型酶 代谢物 供应商 货号
1A2 对乙酰氨基酚(Acetaminophen) Sigma PHR1531
2C9 4’-羟基双氯芬酸(4’-Hydroxydiclofenac) Sigma 32412
2C19 4'-羟基美芬妥因(4'-Hydroxymephenytoin) Sigma H146
2D6 右羟吗喃(Dextrorphan) Sigma PHR1974
3A4 1'-羟基咪达唑仑(1'-Hydroxymidazolam) Caymen 10385
3A4 6'-羟基睾酮(6'-Hydroxytestosterone) Sigma H2898
表13：P450特异性抑制剂来源
P450亚型酶 特异性抑制剂 供应商 货号
1A2 7-乙氧基香豆素(7-ethoxycoumarin) Sigma E1379
2C9 磺胺苯吡唑(Sulfaphenazole) Sigma S0758
2C19 奥美拉唑(Omeprazole) Sigma PHR1059
2D6 异丙嗪(Promethazine) Sigma PHR1467
3A4 氟康唑(Fluconazole) Sigma PHR1160
3A4 酮康唑(Ketoconazole) Sigma PHR1385
表14：P450底物来源及底物溶液(稀释到磷酸钾溶液中)
Figure GDA0003227487180001041
表15：按照下表配制人肝微粒体溶液(用磷酸钾溶液稀释)
P450亚型酶 工作溶液的蛋白浓度(mg/ml) 蛋白终浓度(mg/ml)
1A2 0.133 0.10
2C9 0.0668 0.05
2C19 0.266 0.20
2D6 0.133 010
3A4(咪达唑仑) 0.0668 0.05
3A4(睾酮) 0.133 0.10
取96-孔深孔板，每孔加入150μL 0.316mg/mL人肝微粒体工作溶液，并向对应孔中加入2μL 1mM的特异性的抑制剂或者待测化合物溶液，然后向每孔中加入50μL预热的各底物的工作溶液(在4mM的NADPH溶液中)，然后分别孵育5-40分钟(不同的酶孵育时间不同)后，加入200μL预冷的反应终止液。所有样品4000rpm离心20分钟。取150μL的离心上清液加入到新的96-孔深孔板中，并在各孔中加入150μL 0.1％的甲酸水溶液，然后用LC/MS/MS(SCI AP4000)进行分析。按照下面的公式计算单点IC50值。
Figure GDA0003227487180001051
(假设Hill斜率＝1)
C0＝供试化合物和抑制剂溶液的浓度
表16：本发明化合物实施例12与Merestinib对若干CYP450同工酶的抑制活性比较
Figure GDA0003227487180001052
(对照10μM,供试化合物10μM)
在所测试的CYP450同工酶中，P450 2C9基因编码的蛋白在人肝微粒体中含量丰富，约占P450总量的20％；P450 2C9能代谢许多不同性质的药物，并在前致癌物/前毒物和致突变剂的活化中也起到一定作用。本实验的结果显示，本发明化合物如实施例12对2C9的抑制活性显著低于现有技术中的抑制剂Merestinib，这表明本发明化合物相比merestinib对P4502C9的影响更小，从而在药物施用过程中，将对可能同时使用的其他药物的代谢产生更小的影响，即产生药物相互作用的可能性有望被明显降低。
实施例15：本发明化合物的溶解度的考察
根据本领域技术人员熟知的、本领域常规的溶解度测定标准方法，例如(Kerns,Edward H.and Di Li(2008).Drug-like Properties:Concepts,Structure Design andMethods:from ADME to Toxicity Optimization.San Diego:Academic Press)中所述的方法，以FaSSGF(pH1.6)(Biorelevant，模拟人禁食空胃的胃液)、FeSSIF(pH5.8)(Biorelevant，模拟人餐后饱食小肠肠液)、FaSSIF(pH6.5)(Biorelevant，模拟人餐前饥饿状态下的小肠肠液)和PBS缓冲液(Hyclone，Cat No.SH30256.01B)为试验系统，如下考察本发明化合物的溶解性质。
精确称取约1mg待测化合物干粉置于玻璃瓶中，加入适当体积的上述各个试验系统溶液中，配制成4mg/mL的工作溶液。将样品瓶于室温(25℃)放置摇床，1000rpm摇动1小时，然后静置过夜平衡。然后将所有样品于12000rpm，25℃离心10分钟。配制各化合物的不同浓度的DMSO溶液作为标准溶液。取三块微孔板，在每孔中加入580μL 20％(v/v)乙腈水溶液(含有40ng/mL的甲苯磺丁脲作为内标)，混匀。在第一块微孔板的孔中加入20μL 4mg/mL的工作溶液或者标准溶液并混匀。然后从第一块微孔板中取20μL加入到第二块微孔板对应孔中，混匀。然后从第二块微孔板的各孔中取20μL到第三块微孔板对应的孔中，混匀。然后用质谱分析样品(LC-MS/MS-014(API4000)，根据标准溶液的浓度制定标准曲线，并计算待测化合物的溶解度。
表17：本发明化合物实施例12与Merestinib的溶解度比较
Figure GDA0003227487180001061
以上数据显示，本发明化合物如实施例12相比Merestinib显示显著提高的溶解度，该改进的理化性质由此可提供更好的成药性质、有望具有更好的生物利用度。

Claims (25)

1.式I化合物:
Figure FDA0004166728190000011
其中R1是甲基；
R5是H；
或者R1和R5与它们所连接的原子一起形成具有以下通式的环状结构：
Figure FDA0004166728190000012
其中X是-CR7R8-、＝CR7-、-CR7R8-CR7R8-或-CR7＝CR8-；
R6、R7、R8和R9各自独立地是H；
R2是任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基；任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基；或C1-6烷硫基；
R3和R4各自独立地选自卤素、硝基或氰基；
条件是R1和R2不同时为甲基，
或它们药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)的环状结构，其中-X-是-CR7R8-或＝CR7-。
3.根据权利要求1的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R2是任选被1、2或3个卤素取代的C1-6烷基。
4.根据权利要求3的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R2选自甲基、乙基、异丙基或三氟甲基。
5.根据权利要求1的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R2是C3-6环烷基。
6.根据权利要求5的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R2是环丙基。
7.根据权利要求1至6任一项的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R3和R4各自独立地选自卤素。
8.根据权利要求7的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R3和R4各自独立地为F。
9.式II化合物:
Figure FDA0004166728190000021
其中R1是甲基；
R5是H；
或者R1和R5与它们所连接的原子一起形成具有以下通式的环状结构：
Figure FDA0004166728190000022
其中X是-CR7R8-、＝CR7-、-CR7R8-CR7R8-或-CR7＝CR8-；
R6、R7、R8和R9各自独立地是H；
R2是-SRb或-ORb；
R3和R4各自独立地选自卤素、硝基或氰基；
Rb是任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基；
R10是1H-吡唑-4基；
或它们药学上可接受的盐。
10.根据权利要求9的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R5是H，或R1和R5与它们所连接的原子一起形成式(a)的环状结构，其中-X-是-CR7R8-或＝CR7-。
11.根据权利要求9的化合物或它们药学上可接受的盐，其中Rb是任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基，或C3-6环烷基。
12.根据权利要求11的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R2选自-S-Me、-OMe、-OEt、-O-nPr、-O-iPr、-O-cPr、-OCF3、-OCF2H和-OCH2CF3。
13.根据权利要求9至12任一项的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R3和R4各自独立地是卤素。
14.根据权利要求13的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R3和R4各自独立地是F。
15.式III-a化合物或它们药学上可接受的盐，
Figure FDA0004166728190000031
其中R1是甲基；
R2是-ORb；
R3和R4各自独立地选自卤素；
Rb是任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基。
16.权利要求15的化合物、其异构体或它们药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R2选自-OMe、-OEt、-O-nPr、-O-iPr、-O-cPr、-OCF3、-OCF2H和-OCH2CF3；R3和R4各自独立地是氟。
17.式III-b化合物或它们药学上可接受的盐，
Figure FDA0004166728190000032
其中R2是-ORb；
X是-CR7R8-或＝CR7-；
R6、R7、R8和R9各自独立地是H；
R3和R4各自独立地选自卤素；
Rb各自独立地是任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基或任选被一个或多个卤素取代的C3-6环烷基。
18.权利要求17的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R2是-ORb，其中Rb选自任选被一个或多个卤素取代的C1-6烷基；R3和R4各自独立地是氟。
19.权利要求18的化合物或它们药学上可接受的盐，其中R2选自-OMe、-OEt、-O-nPr、-O-iPr、-OCF3、-OCF2H和-OCH2CF3。
20.化合物或它们药学上可接受的盐，所述化合物选自：
Figure FDA0004166728190000041
Figure FDA0004166728190000051
Figure FDA0004166728190000061
21.根据权利要求1至20任一项的化合物或它们药学上可接受的盐，其中药学上可接受的盐是对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐或甲磺酸盐。
22.药物组合物，包含根据权利要求1至21任一项的化合物或它们药学上可接受的盐及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，以及任选的选自以下的其他治疗活性剂：其他Trk抑制剂、激酶抑制剂、抗体药物、免疫治疗剂、抗癌剂、抗炎药、镇痛药、心血管药物、降脂药、抗菌剂、抗病毒剂、抗糖尿病药、抗增殖剂、抗血管生成剂或抗过敏剂。
23.根据权利要求1至21任一项的化合物或它们药学上可接受的盐或根据权利要求22的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤或癌症的药物中的用途，其中所述肿瘤或癌症选自肉瘤、皮肤癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、唾液腺癌、多发性骨髓瘤、星形细胞瘤和成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、肺腺癌、大细胞神经内分泌肿瘤、头颈癌以及结肠直肠癌、胆管癌、成胶质细胞瘤、胶质瘤、分泌性乳腺癌、乳腺分泌型癌、急性髓样白血病、先天性中胚层肾瘤、先天性纤维肉瘤、急性成淋巴细胞性白血病、结肠腺癌、胃肠道间质瘤。
24.根据权利要求23的用途，其中所述肿瘤或癌症选自肺腺癌、肝内胆管癌、结直肠癌、乳头状甲状腺癌、spitzoid肿瘤、成胶质细胞瘤、婴儿纤维肉瘤癌、星形细胞瘤、头颈癌、低级胶质瘤、分泌性乳腺癌、急性髓性白血病、先天性中胚层肾瘤、先天性纤维肉瘤、急性成淋巴细胞性白血病、结肠腺癌、甲状腺癌、皮肤黑素瘤和小儿胶质瘤肉瘤。
25.根据权利要求1至21任一项的化合物或它们药学上可接受的盐的制备方法，其包括：(a)将式A化合物
Figure FDA0004166728190000071
与式B化合物在缩合剂存在下进行反应，以形成酰胺，
Figure FDA0004166728190000072
得到式C化合物
Figure FDA0004166728190000073
或(a’)将式A化合物
Figure FDA0004166728190000074
与式D化合物在缩合剂存在下进行反应，以形成酰胺，
Figure FDA0004166728190000075
得到式E化合物
Figure FDA0004166728190000081
再将式E化合物进行铃木偶联反应，得到式C化合物；
以及
(b)将式C化合物脱保护，得到其中R10为1H-吡唑-4基的下式化合物
Figure FDA0004166728190000082
其中R1至R5如权利要求1至21任一项所定义。
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