CN112724274A - 响应面法优化一支黄花多糖超声波辅助提取工艺 - Google Patents

Abstract

本发明应面法优化一支黄花多糖超声波辅助提取工艺，包括以下步骤：步骤一：将一支黄花粉末经80％的乙醇加热回流两次，脱脂、脱色、出去低聚糖和小分子杂质，最后挥干溶剂，得到处理样品；在单因素试验的基础上，利用Box－Behnken Design(BBD)中心组合设计，以PPs提取得率Y(％)为响应值，考察三个独立变量对提取得率的影响。本发明以一支黄花为原料，采用超声提取法对一支黄花的多糖进行提取。在单因素实验的基础上，采用响应面法设计对一支黄花多糖的超声提取条件进行优化，以确定一支黄花多糖的最佳提取工艺条件。

Description

响应面法优化一支黄花多糖超声波辅助提取工艺

技术领域

本发明涉及一支黄花提取技术领域，具体涉及响应面法优化一支黄花多糖超声波辅助提取工艺。

背景技术

一支黄花是菊科一支黄花属植物。是一个多型性的种，叶形与花序式有极大变化。可以全草入药，性味辛、苦，微温，能袪风清热、解毒清肿。在一支黄花化学成分的研究中，多糖提取的研究较少。但是，大量药理及临床研究证实，一支黄花多糖具有抑菌、清热解毒,消肿,可治咽喉肿痛、感冒发热,亦可治疮痈,是一种很好的中药材。作为食品、饲料添加剂等方面具有广阔的前景。因此，优化一支黄花的多糖提取工艺具有重要意义。

目前，提取植物多糖的方法有热水浸提法、酸碱溶液提取法、微波提取法、超声提取法等多种方法，其中超声提取法操作简单，并且可以在较低温度、较短时间下获得较高的得率，已被开发运用在多种植物活性成分的提取中。超声提取法需考察的影响因素较多，而设计结合响应面法可确定影响得率的关键因素，并对其进行优化。响应面实验设计是一种回归试验设计方法，通过相关实验采集数据，采取多元二次回归方程进行拟合自变量(试验因素)和响应值(试验指标)之间的函数关系，建立相应的数学模型，对二次多项式回归方程的计算分析来寻求最优工艺参数，是解决多变量问题的一种统计方法，其预测结果可信度高，能够快速确定多因素系统的最佳实验条件；

基于此，本发明提供一种响应面法优化一支黄花多糖超声波辅助提取工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供响应面法优化一支黄花多糖超声波辅助提取工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

响应面法优化一支黄花多糖超声波辅助提取工艺，包括以下步骤：

步骤一：将一支黄花粉末经80％的乙醇加热回流两次，脱脂、脱色、出去低聚糖和小分子杂质，最后挥干溶剂，得到处理样品；

步骤二：通过处理样品分别进行单因素考察，考察三个独立变量，加酶量、酶解温度和pH值，所述加酶量、酶解温度和pH值分别用A、B和C表示；

步骤三：在单因素试验的基础上，利用Box－Behnken Design(BBD)中心组合设计，以PPs提取得率Y(％)为响应值，考察三个独立变量对提取得率的影响；

步骤四：在对一支黄花多糖得率的响应面实验结果进行回归分析，对三个因素进行回归拟合后得到回归方程：

提取率＝+4.53+0.14*A+0.12*B+0.26*C-0.29*A*B-0.18*A*C+0.82*B*C+1.22*A2+0.22*B2+0.81*C2。

优选地，所述提取工艺中糖含量的测定方法为：精确称取105℃干燥并恒重的葡萄糖标品0.01g，溶解于超纯水，并定容至100m1，得0.1mg/m1溶液；精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml至吸管中加超纯水补至2ml，各加入5％苯酚溶液1m1，摇匀，垂直液面快速加入浓硫酸5ml，摇匀；冷水浴至温度下降到室温，显色；以空白为对比，用紫外分光光度计测定490mm波长处的吸光度；以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y＝0.0063x-0.0077(R²＝0.9992)；x为葡萄糖标准品浓度，单位mg/ml，y为吸光度值；

计算多糖得率：

公式中，y：超声波提取多糖得率(％)；C：由标曲计算所得多糖浓度(mg/mL)；V：定容体积(mL)；N：稀释倍数；m：测定所用得粗多糖质量(mg)；M：粗多糖质量(g)；W：提取用一支黄花粉末质量(g)。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明以一支黄花为原料，采用超声提取法对一支黄花的多糖进行提取。在单因素实验的基础上，采用响应面法设计对一支黄花多糖的超声提取条件进行优化，以确定一支黄花多糖的最佳提取工艺条件，为以一支黄花为原料的植物多糖在中医药领域的进一步开发和利用提供参考；本次实验联合采用单因素实验及响应面实验，分析了料液比、提取时间、超声功率等关键工艺参数对一支黄花多糖提取率的影响，并得到了最佳的优化工艺。一支黄花多糖的研究目前只是属于起步阶段，本实验为一支黄花多糖进一步的开发应用提供了实验依据，具有一定的研究意义。

附图说明

图1为本发明料液比对一枝黄花多糖得率的影响示意图；

图2为本发明提取时间对一枝黄花多糖得率的影响示意图；

图3为本发明提取功率对一枝黄花多糖得率的影响示意图；

图4为本发明提取次数对一枝黄花多糖得率的影响示意图；

图5为本发明一支黄花多糖红外吸收图谱；

图6为本发明一支黄花多糖的紫外吸收图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例的响应面法优化一支黄花多糖超声波辅助提取工艺，包括以下步骤：

步骤一：将一支黄花粉末经80％的乙醇加热回流两次，脱脂、脱色、出去低聚糖和小分子杂质，最后挥干溶剂，得到处理样品；

步骤二：通过处理样品分别进行单因素考察，考察三个独立变量，加酶量、酶解温度和pH值，所述加酶量、酶解温度和pH值分别用A、B和C表示；

步骤三：在单因素试验的基础上，利用Box－Behnken Design(BBD)中心组合设计，以PPs提取得率Y(％)为响应值，考察三个独立变量对提取得率的影响；

步骤四：在对一支黄花多糖得率的响应面实验结果进行回归分析，对三个因素进行回归拟合后得到回归方程：

提取率＝+4.53+0.14*A+0.12*B+0.26*C-0.29*A*B-0.18*A*C+0.82*B*C+1.22*A2+0.22*B2+0.81*C2。

本实施例的提取工艺中糖含量的测定方法为：精确称取105℃干燥并恒重的葡萄糖标品0.01g，溶解于超纯水，并定容至100m1，得0.1mg/m1溶液；精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml至吸管中加超纯水补至2ml，各加入5％苯酚溶液1m1，摇匀，垂直液面快速加入浓硫酸5ml，摇匀；冷水浴至温度下降到室温，显色；以空白为对比，用紫外分光光度计测定490mm波长处的吸光度；以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y＝0.0063x-0.0077(R²＝0.9992)；x为葡萄糖标准品浓度，单位mg/ml，y为吸光度值；

计算多糖得率：

公式中，y：超声波提取多糖得率(％)；C：由标曲计算所得多糖浓度(mg/mL)；V：定容体积(mL)；N：稀释倍数；m：测定所用得粗多糖质量(mg)；M：粗多糖质量(g)；W：提取用一支黄花粉末质量(g)。

料液比对一支黄花多糖提取的影响

称取3g预处理样品，加入适量蒸馏水，浸泡2h，确定提取时间120min、超声功率200W条件下，按不同液料比1：15；1：20，1：25，1：30，1：35提取一枝黄花多糖，每组平行重复三次，并计算产率。收集上清液并减压浓缩至原体积的20％以下，加入无水乙醇至乙醇最终浓度为80％，在4℃温度下醇沉24h。离心后收集沉淀，，利用Sevag法脱蛋白，用截留分子量3500Da的透析袋流水透析48h，最后冻干得到一支黄花粗多糖(PPs)。采用硫酸—苯酚法测定多糖含量。PPs提取得率(Y)公式:Y(％)＝(M/W)×100％，其中M是多糖的含量，W代表样品净重。以葡萄糖浓度(C)为横坐标，吸光度(Abs)为纵坐标，线性拟合绘制葡萄糖标

准曲线，获得回归方程为:

Abs＝0.06329C-0.03835(R²＝0.994)

在料液比为1:25，提取次数为1次，提取提取功率为280w，考察不同提取提取时间为60、90、120、150、180min，每组平行重复三次，并计算产率。其他操作同1.2.2.1温度对一支黄花多糖提取的影响的操作冷冻干燥并计算多糖提取率；

在料液比为1:25，提取功率为280w，提取次数为1次，考察不同提取时间60min、90min、120min、150min、180min，每组平行重复三次，并计算产率。

其他操作同1.2.2.1温度对一支黄花多糖提取的影响的操作冷冻干燥并计算多糖提取率；

在料液比为1:25，提取次数为1次，提取时间为120min，考察不同提取功率200W、240W、280W、320W、360W，每组平行重复三次，并计算产率。其他操作同1.2.2.1温度对一支黄花多糖提取的影响的操作冷冻干燥并计算多糖提取率；

在单因素试验的基础上，利用Box－Behnken Design(BBD)中心组合设计，以PPs提取得率Y(％)为响应值，考察三个独立变量:加酶量(A)、酶解温度(B)和pH值(C)(每个因素取3个水平)对提取得率的影响。实验设计和PPs得率如表1所示，所有试验均进行3次；并利用Design Expert(8.0版)软件进行数据分析。采用ANOVA法进行方差分析。在P＜0.05时有统计学意义。

表1响应面水平实验设计

响应面优化实验设计

在单因素实验结果的基础上采用Box-Benhnken的中心组合设计对超声辅助提取一支黄花多糖工艺进行优化，响应面优化实验因素和水平表见表2。根据响应面优化设计实验结果进行验证实验，并比较预测多糖得率与实际多糖得率。

表2拟合二次多项式模型的方差分析

料液比对超声波辅助一支黄花多糖得率的影响见图1。由图1可知：随着液料比的增加，一支黄花多糖多糖得率逐渐升高，当液料比为1:25g/mL时，多糖得率最高。这是因为，当液料比较低时，溶剂与样品接触不充分从而导致提取不彻底。随着液料比的继续增加，多糖的得率呈下降趋势，这可能是因为随着液料比的增加使随后的料液的分离浓缩操作难度增加，导致多糖的损失增加。因此，最优液料比为1:25g/mL。

超声时间对超声波辅助白首乌多糖得率的影响见图2。由图2可知：随着超声时间的增加，一支黄花多糖得率逐渐升高，当超声时间为150min时，一支黄花多糖得率最高，这是因为，随着时间的增加多糖得率增加，当超声时间为40min时，多糖已经基本溶出，随着超声时间的增加，不会提高一支黄花多糖的得率，反而使部分小分子多糖降解，导致得率下降。因此最优的超声时间为150min。

超声功率对超声波辅助一支黄花多糖得率的影响见图3。由图3可知，随着超声功率的增加，一支黄花多糖得率逐渐升高，当超声功率为320W时，多糖得率最高，这是因为随着超声波产生的空穴效应和震动利于多糖的溶解。随着超声功率的继续增加，多糖得率呈下降趋势，这是因为过高的超声波功率会导致多糖的降解,因此最优的超声功率为320W。

如图4所示，在固定其它实验条件情况下，随着提取次数的增加，一支黄花多糖得率逐渐升高，当提取次数为4次时，一支黄花的得率最高，但由于考虑其经济性和操作性，舍弃次数条件。

表3响应面实验设计及结果

回归方程拟合及方差分析

对一支黄花多糖得率的响应面实验结果进行回归分析，结果见表(2)。对三个因素进行回归拟合后得到回归方程：

提取率＝+4.53+0.14*A+0.12*B+0.26*C-0.29*A*B-0.18*A*C+0.82*B*C+1.22*A2+0.22*B2+0.81*C2

由方差分析可知，校正系数R²＝0.9777,R²模型的P值小于0.0001，为极显著；失拟项P值大于0.05，不显著。这说明模型拟合度较好，说明实验的二次模型拟合度较高，可正确反映个因素与响应值之间的变化关系。由模型的方差分析可得出提取温度(A)、提取时间(B)、PH(C)、提取温度与时间交互项(AB)、提取温度与PH交互项(AC)、提取时间与PH交互项(BC)及个因素的二次项对响应值有显著影响。各因素对响应值的影响显著性排序为B＞A＞C。

由响应面和等高线图可知，各因素之间的响应面均较陡峭，说明各因素之间的交互作用均较强。根据所得到的模型，预测最优工艺条件为提取时间为145.30min，提取功率为360.00w，预计得率为5.4030％。

如图5所示，在3600～3000^-1处，一个吸收较强的宽峰：Z3420.16cm^-1，为-OH伸缩振动峰。在2325cm^-1处有振动，在1400cm^-1处存在C-H变角振动，分别为1235.81cm^-1吸收峰。在1200～1000cm^-1处的吸收峰是由吡喃糖环的醚键(C-O-C)和-OH伸缩振动引起的，其吸收峰是1168.68cm^-1，此4组吸收峰均是糖类物质的特征吸收峰，说明本实验方法获得的提取物均为多糖类物质。另外，1654.66cm^-1处分别有一强的吸收峰，为酰胺Ⅰ带的吸收峰；1558.26cm^-1是N—H的变角振动，为酰胺Ⅱ带的吸收峰，证明多糖中有少量与糖结合的蛋白(如糖蛋白)存在。592.95cm^-1是O-H面外弯曲振动吸收峰。

从一支黄花的紫外吸收图谱分析，一支黄花多糖在280nm处有轻微吸收。

验证实验

经Design-Expert8.0.6预测模型极值点，结果显示最佳提取条件为料液比为1:24.38，提取时间为145.30min，提取功率为360.00w，根据实际操作设计验证实验，其提取条件为：料液比为1:24.38，提取时间为145.30min，提取功率为360.00w，取条件进行3次平行实验，实验结果为在次条件下的多糖得率为4.85％±0.02％，验证实验结果与预测值接近，表明该模型拟合度良好，对此提取条件取白一支黄花多糖的工艺优化合理、有效。

因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.响应面法优化一支黄花多糖超声波辅助提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将一支黄花粉末经80％的乙醇加热回流两次，脱脂、脱色、出去低聚糖和小分子杂质，最后挥干溶剂，得到处理样品；

步骤二：通过处理样品分别进行单因素考察，考察三个独立变量，加酶量、酶解温度和pH值，所述加酶量、酶解温度和pH值分别用A、B和C表示；

步骤三：在单因素试验的基础上，利用Box－Behnken Design(BBD)中心组合设计，以PPs提取得率Y(％)为响应值，考察三个独立变量对提取得率的影响；

步骤四：在对一支黄花多糖得率的响应面实验结果进行回归分析，对三个因素进行回归拟合后得到回归方程：

提取率＝+4.53+0.14*A+0.12*B+0.26*C-0.29*A*B-0.18*A*C+0.82*B*C+1.22*A2+0.22*B2+0.81*C2。

2.根据权利要求1所述的响应面法优化一支黄花多糖超声波辅助提取工艺，其特征在于，所述提取工艺中糖含量的测定方法为：精确称取105℃干燥并恒重的葡萄糖标品0.01g，溶解于超纯水，并定容至100m1，得0.1mg/m1溶液；精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml至吸管中加超纯水补至2ml，各加入5％苯酚溶液1m1，摇匀，垂直液面快速加入浓硫酸5ml，摇匀；冷水浴至温度下降到室温，显色；以空白为对比，用紫外分光光度计测定490mm波长处的吸光度；

以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y＝0.0063x-0.0077(R²＝0.9992)；x为葡萄糖标准品浓度，单位mg/ml，y为吸光度值；

计算多糖得率：

公式中，y：超声波提取多糖得率(％)；C：由标曲计算所得多糖浓度(mg/mL)；V：定容体积(mL)；N：稀释倍数；m：测定所用得粗多糖质量(mg)；M：粗多糖质量(g)；W：提取用一支黄花粉末质量(g)。

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