CN112717142A - 靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向给药技术领域，具体为一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，包括以下制备步骤：构建pCMV‑lamp2b质粒；将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV‑Tag上；培养TRAP‑lamp2b细胞系；混合含外泌体的上清液和TEI试剂，离心获取外泌体；用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，实施药物递送。本发明公开一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的应用，在于外泌体特异性靶向破骨细胞，通过释放内部装载药物，抑制破骨细胞的活性，治疗骨质疏松。有益效果为：本发明利用TEI试剂盒和含外泌体的上清液聚合沉淀，可从少量标本中提取到浓度较高的外泌体，提取外泌体浓度较高，直径分布差异小，样本均质性好，不需要超速离心机，操作简便快捷。

Description

靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及靶向给药技术领域，具体为一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用。
背景技术
外泌体作为一种膜结构载体，能够通过其表面的膜蛋白与靶细胞膜融合，从而将其负载的药物直接运送到受体细胞中，避免了细胞吞噬-溶酶体途径带来的药物降解及细胞毒性等问题。因此，外泌体作为一种新型药物载体获得了广泛关注。
外泌体天然存在于体液中，在包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中广泛分布，而且，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体；但是，想要研究这个分布广泛的小不点可不是一件容易的事情，其中，最为困难的就是从体液或者细胞培养基中分离出高纯度的外泌体。
外泌体分离的传统方法为差速超速离心法和蔗糖密度梯度离心法。差速超速离心法是目前外泌体提取最常用的方法，但是此方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，质量不好，由于外泌体和微泡没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体；蔗糖密度梯度离心法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，产量少。而且，这两种传统方法都需要用到超速离心机，设备昂贵，耗时长。
因此，研发一种简单、高效、快速、经济的提取外泌体的方法成为本技术领域人员迫切解决的一个技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白lamp2b片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到TRAP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将TRAP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到TRAP-lamp2b细胞系。
步骤五：选择无血清培养基培养TRAP-lamp2b细胞系，培养24-48h后，当细胞融合度达到80％-90％时，于4℃以3×103g离心10-30min，去除TRAP-lamp2b细胞系中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中，先用0.45μm滤器过滤上清液，再用0.2μm滤器过滤上清液，得到含外泌体的上清液；
步骤六：向含外泌体的上清液中加入TEI试剂，于4℃混匀并静置20-40min后，于4℃以103g离心5-15min，用60-120μl PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤七：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
优选的，步骤二中，所述pCMV-lamp2b质粒的引物核酸序列为
TCGA-GGCAACAGCACCATGACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG-T或
CCGGA-CACGGTCACCAGGCCCTTCAGGTAGCTCAGGGGGGTCATGGTGCTGTTGCC。
优选的，步骤三中，所述哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP的核酸序列为：
ACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG。
优选的，步骤六中，所述TEI试剂为美国Invitrogen公司生产，TEI试剂和上清液的用量体积比为1：5。
优选的，步骤六中，所述PBS缓冲液采用pH为7.4的含0.05％吐温－20的磷酸盐缓冲液。
优选的，步骤七中，所述药物为双膦酸盐类抗骨质疏松药物。
一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的应用，所述外泌体特异性靶向破骨细胞，通过释放内部装载药物，抑制破骨细胞的活性，治疗骨质疏松。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明利用TEI试剂盒和含外泌体的上清液聚合沉淀，可从少量标本中提取到浓度较高的外泌体，提取外泌体浓度较高，直径分布差异小，样本均质性好，不需要超速离心机，操作简便快捷；
2.本发明用哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP作为外泌体的靶向多肽，分子质量小，能够增加携带基因的容量，与破骨细胞特异性结合，靶向性好，可以精准释放治疗骨质疏松的药物；
3.TRAP-lamp2b细胞系采用3×103g离心，可以有效去除TRAP-lamp2b细胞系中杂质和细胞碎片，有效提高上清液中外泌体的纯度，并通过0.45μm滤器和0.2μm滤器两次过滤上清液，进一步提高外泌体纯度。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种技术方案：一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备，包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白lamp2b片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到TRAP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将TRAP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到TRAP-lamp2b细胞系。
步骤五：选择无血清培养基培养TRAP-lamp2b细胞系，培养24h后，当细胞融合度达到80％时，于4℃以3×103g离心10min，去除TRAP-lamp2b细胞系中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中，先用0.45μm滤器过滤上清液，再用0.2μm滤器过滤上清液，得到含外泌体的上清液；
步骤六：向含外泌体的上清液中加入TEI试剂，于4℃混匀并静置20min后，于4℃以103g离心5min，用60μl PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤七：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
其中，pCMV-lamp2b质粒的引物核酸序列为
TCGA-GGCAACAGCACCATGACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG-T或
CCGGA-CACGGTCACCAGGCCCTTCAGGTAGCTCAGGGGGGTCATGGTGCTGTTGCC；
哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP的核酸序列为：
ACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG。
TEI试剂为美国Invitrogen公司生产，TEI试剂和上清液的用量体积比为1：5；PBS缓冲液采用pH为7.4的含0.05％吐温－20的磷酸盐缓冲；药物为双膦酸盐类抗骨质疏松药物。
实施例2
本发明提供一种技术方案：一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备，包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白lamp2b片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到TRAP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将TRAP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到TRAP-lamp2b细胞系。
步骤五：选择无血清培养基培养TRAP-lamp2b细胞系，培养32h后，当细胞融合度达到85％时，于4℃以3×103g离心20min，去除TRAP-lamp2b细胞系中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中，先用0.45μm滤器过滤上清液，再用0.2μm滤器过滤上清液，得到含外泌体的上清液；
步骤六：向含外泌体的上清液中加入TEI试剂，于4℃混匀并静置30min后，于4℃以103g离心12min，用80μl PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤七：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
其中，pCMV-lamp2b质粒的引物核酸序列为
TCGA-GGCAACAGCACCATGACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG-T或
CCGGA-CACGGTCACCAGGCCCTTCAGGTAGCTCAGGGGGGTCATGGTGCTGTTGCC；
哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP的核酸序列为：
ACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG。
TEI试剂为美国Invitrogen公司生产，TEI试剂和上清液的用量体积比为1：5；PBS缓冲液采用pH为7.4的含0.05％吐温－20的磷酸盐缓冲；药物为双膦酸盐类抗骨质疏松药物。
实施例3
本发明提供一种技术方案：一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备，包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白lamp2b片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到TRAP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将TRAP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到TRAP-lamp2b细胞系。
步骤五：选择无血清培养基培养TRAP-lamp2b细胞系，培养40h后，当细胞融合度达到88％时，于4℃以3×103g离心17min，去除TRAP-lamp2b细胞系中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中，先用0.45μm滤器过滤上清液，再用0.2μm滤器过滤上清液，得到含外泌体的上清液；
步骤六：向含外泌体的上清液中加入TEI试剂，于4℃混匀并静置36min后，于4℃以103g离心13min，用100μl PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤七：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
其中，pCMV-lamp2b质粒的引物核酸序列为
TCGA-GGCAACAGCACCATGACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG-T或
CCGGA-CACGGTCACCAGGCCCTTCAGGTAGCTCAGGGGGGTCATGGTGCTGTTGCC；
哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP的核酸序列为：
ACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG。
TEI试剂为美国Invitrogen公司生产，TEI试剂和上清液的用量体积比为1：5；PBS缓冲液采用pH为7.4的含0.05％吐温－20的磷酸盐缓冲；药物为双膦酸盐类抗骨质疏松药物。
实施例4
本发明提供一种技术方案：一种靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统的制备，包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白lamp2b片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到TRAP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将TRAP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到TRAP-lamp2b细胞系。
步骤五：选择无血清培养基培养TRAP-lamp2b细胞系，培养48h后，当细胞融合度达到90％时，于4℃以3×103g离心30min，去除TRAP-lamp2b细胞系中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中，先用0.45μm滤器过滤上清液，再用0.2μm滤器过滤上清液，得到含外泌体的上清液；
步骤六：向含外泌体的上清液中加入TEI试剂，于4℃混匀并静置40min后，于4℃以103g离心15min，用120μl PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤七：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
其中，pCMV-lamp2b质粒的引物核酸序列为
TCGA-GGCAACAGCACCATGACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGG CCTGGTGACCGTG-T或
CCGGA-CACGGTCACCAGGCCCTTCAGGTAGCTCAGGGGGGTCATGGTGCTGTTGCC；
哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP的核酸序列为：
ACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG。
TEI试剂为美国Invitrogen公司生产，TEI试剂和上清液的用量体积比为1：5；PBS缓冲液采用pH为7.4的含0.05％吐温－20的磷酸盐缓冲；药物为双膦酸盐类抗骨质疏松药物。
统计含四组实施例中外泌体的上清液的质量，以及四组实施例中外泌体的质量，计算四组实施例中的外泌体收率，制成下表：
外泌体收率(％)
实施例1 24.23
实施例2 26.05
实施例3 25.17
实施例4 23.97
上述的四组实施例均可以得到本发明的靶向骨肉瘤细胞的外泌体药物递送系统，其中实施例2得到的外泌体的收率最高，为26.05％。
动物实验
选取SPF级雄性8周雌性大鼠，随机分为治疗组、假手术组和去卵巢组，治疗组和对照组中大鼠个数均为三十个。治疗组和去卵巢组均采用外科手术摘除大鼠双侧卵巢，其中治疗组在切除双侧卵巢后每隔日一次腹腔注射包裹氯膦酸盐的外泌体，每次注射100ul体积；去卵巢组在切除双侧卵巢后每隔日一次腹腔注射等量生理盐水；假手术组除不切除大鼠卵巢外，其余操作与去卵巢组相同。饲养五周后处死大鼠，取大鼠的双侧股骨及血清，用全自动生化分析仪检测血清碱性磷酸酶活性和血清钙浓度。
实验结果
与假手术组相比，去卵巢组中大鼠的血清碱性磷酸酶活性明显增加。去卵巢后，大鼠体内雌激素缺乏，导致骨转化率增加，与绝经后妇女的高转化型骨质疏松症一致。
与假手术组相比，治疗组中大鼠血清钙明显下降，由于氯膦酸盐可以显著提升血清钙浓度，而血清钙是骨形成的重要标记物，则说明注射包裹氯膦酸盐的外泌体可以有效逆转由于卵巢切除导致的血清钙的降低，有利于骨的形成。
一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的应用，外泌体特异性靶向破骨细胞，通过释放内部装载药物，抑制破骨细胞的活性，治疗骨质疏松。
本发明的有益效果是：本发明利用TEI试剂盒和含外泌体的上清液聚合沉淀，可从少量标本中提取到浓度较高的外泌体，提取外泌体浓度较高，直径分布差异小，样本均质性好，不需要超速离心机，操作简便快捷；用哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP作为外泌体的靶向多肽，分子质量小，能够增加携带基因的容量，与破骨细胞特异性结合，靶向性好，可以精准释放治疗骨质疏松的药物；TRAP-lamp2b细胞系采用3×103g离心，可以有效去除TRAP-lamp2b细胞系中杂质和细胞碎片，有效提高上清液中外泌体的纯度，并通过0.45μm滤器和0.2μm滤器两次过滤上清液，进一步提高外泌体纯度。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：包括以下制备步骤：
步骤一：以小鼠cDNA为模板，用PCR扩增获得外泌体膜蛋白lamp2b片段，PCR纯化，得到lamp2b基因；
步骤二：将lamp2b基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag上，构建pCMV-lamp2b质粒；
步骤三：将哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP插入到pCMV-lamp2b质粒上，得到TRAP-lamp2b重组质粒；
步骤四：将TRAP-lamp2b重组质粒转染小鼠的未成熟树枝状细胞，转染48h后，加入G418抗生素，筛选，得到TRAP-lamp2b细胞系。
步骤五：选择无血清培养基培养TRAP-lamp2b细胞系，培养24-48h后，当细胞融合度达到80％-90％时，于4℃以3×103g离心10-30min，去除TRAP-lamp2b细胞系中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中，先用0.45μm滤器过滤上清液，再用0.2μm滤器过滤上清液，得到含外泌体的上清液；
步骤六：向含外泌体的上清液中加入TEI试剂，于4℃混匀并静置20-40min后，于4℃以103g离心5-15min，用60-120μl PBS缓冲液重悬获得外泌体；
步骤七：用电穿孔仪把药物电转到外泌体中，使外泌体包裹药物，实施药物递送。
2.根据权利要求1所述的一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤二中，所述pCMV-lamp2b质粒的引物核酸序列为
TCGA-GGCAACAGCACCATGACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG-T或
CCGGA-CACGGTCACCAGGCCCTTCAGGTAGCTCAGGGGGGTCATGGTGCTGTTGCC。
3.根据权利要求1所述的一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤三中，所述哺乳动物破骨细胞特异性多肽TRAP的核酸序列为：
ACCCCCCTGAGCTACCTGAAGGGCCTGGTGACCGTG。
4.根据权利要求1所述的一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤六中，所述TEI试剂为美国Invitrogen公司生产，TEI试剂和上清液的用量体积比为1：5。
5.根据权利要求1所述的一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤六中，所述PBS缓冲液采用pH为7.4的含0.05％吐温－20的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法，其特征在于：步骤七中，所述药物为双膦酸盐类抗骨质疏松药物。
7.一种如权利要求1-6所述的靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的应用，其特征在于：所述外泌体特异性靶向破骨细胞，通过释放内部装载药物，抑制破骨细胞的活性，治疗骨质疏松。
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