WO2022202930A1 - 組成物および医薬組成物 - Google Patents

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WO2022202930A1
WO2022202930A1 PCT/JP2022/013676 JP2022013676W WO2022202930A1 WO 2022202930 A1 WO2022202930 A1 WO 2022202930A1 JP 2022013676 W JP2022013676 W JP 2022013676W WO 2022202930 A1 WO2022202930 A1 WO 2022202930A1
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mir
pka
escs
differentiation
dox
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潤 山下
朋皓 皆川
哲哉 的場
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国立大学法人京都大学
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to compositions and pharmaceutical compositions for promoting myocardial differentiation for use in the prevention and/or treatment of heart disease.
  • Cardiac regenerative medicine is currently focused on the development of new treatments through the transplantation of cardiomyocytes and heart-like tissues (cell transplantation and tissue transplantation) derived from pluripotent stem cells.
  • cardiomyocytes and heart-like tissues cell transplantation and tissue transplantation
  • a component that promotes proliferation of cardiomyocytes or a mixture such as a culture containing the component is found, administration of the component will be more invasive than transplantation of cultured cardiomyocytes or heart-like tissue. It can be expected to be used for low-cost treatment.
  • Non-Patent Document 1 discloses the research content of transplanting a sphere-like mass of cells called a cardiosphere, which is cultured from heart tissue, to pediatric patients with dilated cardiomyopathy. This article lists microRNA-146 (miR-146) as a possible component functionally involved in this disease.
  • Non-Patent Document 1 mentions miR-146 as a component that may be involved in the function of pediatric patients with dilated cardiomyopathy. The mechanisms involved in proliferation have not been fully elucidated.
  • PSCs pluripotent stem cells
  • EVs extracellular vesicles derived from PSCs in the process of differentiation promote cardiomyocyte differentiation in PSCs and fetuses. Therefore, in order to use components that promote cardiomyocyte differentiation in the treatment of heart disease, we can search for molecules that contribute to concentric muscle differentiation in the components of the EV, mainly in the contents of the EV, and apply them to transportation means. I continued my research.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a composition for promoting myocardial differentiation that exhibits a high degree of function in promoting cardiomyocyte differentiation and is effective in improving cardiac function after heart disease. and to provide a pharmaceutical composition for promoting myocardial differentiation.
  • Aspect 1 of the present invention is a composition for promoting myocardial differentiation, containing miR-132 as an active ingredient.
  • the composition of aspect 1 is particulate.
  • Aspect 3 of the present invention is the composition of aspect 2, wherein the composition is lactic acid/glycolic acid copolymer (PLGA) nanoparticles or liposomes.
  • PLGA lactic acid/glycolic acid copolymer
  • Aspect 4 of the present invention is a pharmaceutical composition for treating or preventing heart disease, containing miR-132 as an active ingredient.
  • the composition of aspect 4 is particulate.
  • aspects 6 of the present invention is the composition of aspect 5, wherein the composition is lactic acid/glycolic acid copolymer (PLGA) nanoparticles or liposomes.
  • PLGA lactic acid/glycolic acid copolymer
  • Aspect 7 of the present invention is the pharmaceutical composition according to any one of aspects 4 to 6, wherein the heart disease is myocardial infarction.
  • a composition and a pharmaceutical composition that exhibit a high function in promoting cardiomyocyte differentiation and are effective in improving cardiac function after heart disease can be obtained.
  • FIG. 2 is a photographic diagram showing immunostaining of Flk1 during differentiation of PKA-ESCs.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing FACS analysis for the appearance of Flk1 in PKA-ESCs.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the percentage of PKA-ESCs expressing Flk1 by FACS analysis.
  • FIG. 11 is a photographic diagram showing immunostaining of Flk1 during differentiation of PKA-ESC and Control-ESC chimeric aggregates.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing FACS analysis of Flk1 appearance on chimeric aggregates.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the percentage of chimeric aggregates expressing Flk1 during differentiation. Schematic representation of chimeric aggregate co-culture differentiation system with inhibited EV secretion.
  • FIG. 10 is a graph showing the number of Flk1 cells by treatment with manumycin A, GW4869.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the percentage of PKA-ESCs and Control-ESCs in chimeric aggregates expressing Flk1 under Dox-conditions. The graph on the left shows the results of PKA-ESC and the graph on the right shows the results of Control-ESC in control, manumycin A treatment, and GW4869 treatment, respectively.
  • FIG. 10 is a graph showing the number of Flk1 cells by treatment with manumycin A, GW4869.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the percentage of PKA-ESCs and Control-ESCs in chimeric aggregates expressing Flk1 under Dox-conditions. The graph on the left shows the results of PKA-ESC and the
  • FIG. 11 is a photographic diagram showing immunostaining of Flk1+control-ESCs in chimeric aggregates using manumycin A, GW4869, or DMSO.
  • 1 is a schematic diagram of EV collection and processing;
  • FIG. 11 is a photographic diagram showing immunoblots of CD9, CD63, and CD81 in exosomal protein lysates from 10 mL of conditioned medium.
  • FIG. 2 is a photographic diagram showing transmission electron microscopy (TEM) images of EVs in conditioned medium.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the results of analysis of EV size distribution in Dox+ and Dox ⁇ media.
  • FIG. 10 is a graphical representation showing FACS analysis of Flk1+ cells in EV-treated Control-ESCs on D3.5.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the percentage of control ESCs expressing Flk1.
  • FIG. 11 is a photographic diagram showing immunostaining of mesoderm markers (Flk1, PDGFR ⁇ ) in EV-treated control-ESCs at D3.5.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing MA plots summarizing miRNAs differentially expressed in EVs from activated PKA-ESCs (Dox ⁇ ) and inactivated PKA-ESCs (Dox+). Schematic representation of cell chimera experiments and FACS plots showing recipient cells of chimeric aggregates containing miRNA-expressing cell lines on D3.5.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing data analyzed for the percentage of Flk1+ recipient cells in aggregates at a 1:3 ratio.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of detection of Spry1, Rasa1 and pCREB in capillary Western blot.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of pCREB and CREB levels measured by ELISA.
  • FIG. 10 is a graph showing qPCR analysis of ETV2 in Control-ESCs treated with or without EVs from PKA-ESCs (Dox+ or Dox-). Schematic representation of PSyC mechanisms involving EV secretion and miR-132 delivery.
  • 1 is a schematic diagram of the mouse embryo culture of this example.
  • FIG. FIG. 4 is a graphical representation showing FACS analysis of PDGFR ⁇ expression in E6.5 embryos.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the percentage of control ESCs expressing Flk1.
  • FIG. 11 Schematic representation of mouse embryo culture to investigate the effects of EVs (Dox-).
  • FIG. 11 is a photographic diagram showing immunostaining of cTnT in E3.5 mouse embryos.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the percentage of cTnT+ embryos when E3.5 mouse embryos were cultured with undifferentiated ESC-derived EVs (EV(UD)) or early differentiated PKA-ESC-derived EVs (EV(Dox-)) for 10 days.
  • Figure 33 is a graphical representation showing the percentage of beating embryos in cultures similar to Figure 32;
  • FIG. 10 is a photographic representation of a beating mouse embryo cultured from E3.5 for 10 days with miR-132-PLGA.
  • FIG. 2 is a graphical representation showing the percentage of beating of day 8 and day 10 embryos.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing cTnT immunostaining in E3.5 mouse embryos cultured for 10 days with or without miR-132-PLGA.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the percentage of cTnT+ embryos at day 10.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of aggregate culture used for examining differentiation stages of embryonic stem cells.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing FACS analysis of pure PKA-ESC aggregates of PDGFR ⁇ .
  • FIG. 4 is a graphical representation showing data analyzed using the Mann-Whitney U test for the percentage of PDGFR ⁇ +PKA-ESCs.
  • FIG. 11 is a photographic diagram showing immunostaining of PDGFR ⁇ during differentiation of pure PKA-ESC aggregates.
  • FIG. 3 is a graphical representation showing FACS analysis of ESC aggregates.
  • FIG. 3 is a graphical representation showing FACS analysis of ESC aggregates.
  • FIG. 3 is a graphical representation showing FACS analysis of ESC aggregates.
  • FIG. 11 is a photographic diagram showing immunostaining of Flk1 during differentiation of pure Control-ESC aggregates.
  • FIG. 11 is a photographic diagram showing immunostaining of PDGFR ⁇ during differentiation of pure Control-ESC aggregates.
  • FIG. 11 is a photographic diagram showing immunostaining of PDGFR ⁇ during differentiation of chimeric aggregates.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing FACS analysis of PDGFR ⁇ expression in chimeric aggregates.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the percentage of differentiating chimeric aggregates expressing PDGFR ⁇ .
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the concentration of EV particles in conditioned medium.
  • FIG. 4 is a graph showing concentrations of proteins contained in EVs.
  • FIG. 10 is a graphical representation showing FACS analysis of PDGFR ⁇ expression in Control-ESCs treated with EVs from day 3.5 of differentiation and culture of PKA-ESCs (Dox+ or Dox ⁇ ).
  • FIG. 4 is a graphical representation showing the percentage of PDGFR ⁇ + cells.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing FACS analysis of PDGFR ⁇ expression in control-ESCs at day 2.5 of differentiation.
  • FIG. 3 is a graphical representation showing RNA expression levels of Flk1 and PDGFR ⁇ in control-ESCs at day 3.5.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing Flk1 mRNA expression levels in day 3.5 control-ESCs treated with or without miR-132-PLGA. Schematic representation of the procedure for the generation of miRNA-PLGA-NP.
  • FIG. 4 is a graphical representation showing a comparison of miR-132-3p amounts for each sample.
  • FIG. 2 is a photomicrograph of miR-132-3p-LNP administration to myocardial ischemia-reperfusion mouse model.
  • FIG. 4 is a graph diagram showing the results of quantification of the stained area;
  • FIG. 3 is a graph showing comparison of miR-132 expression levels by RT-PCR.
  • FIG. 10 is a graph showing a comparison of miR-132 expression levels by RT-PCR when liposomes were intravenously administered.
  • compositions and pharmaceutical composition according to the present invention will be described with reference to embodiments.
  • present invention is not limited to the following embodiments.
  • composition for promoting myocardial differentiation is a composition for promoting myocardial differentiation and contains miR-132 as an active ingredient.
  • miR-132 is a microRNA (miRNA), a class of short non-protein-coding RNA molecules.
  • the miR-132 family is found on the genomes of rodents such as mice and multiple mammals including humans.
  • various miR-132 family molecules can be selected.
  • commercially available miR-132 molecules can be used.
  • Various mutants of miR-132 molecules can also be used as long as they have a function as a microRNA.
  • RNA sequence is SEQ ID NO: 1 (genomic sequence is NCBI RefSeq: NC_000017.11), if mouse is mouse miR-132 (RNA sequence can be selected from SEQ ID NO: 2) (genome sequence is NCBI RefSeq: NC_000077.7), and the like.
  • PSCs pluripotent stem cells
  • EVs extracellular vesicles
  • PKA-ESCs protein kinase A-activated ESCs
  • miR-132 was identified when searching for a functional molecule that can reconstitute PKA activation and promote differentiation of the mesodermal lineage. Furthermore, we found that similar cardiomyocyte induction was reproduced by adding engineered nanoparticles containing miR-132 to ex vivo mouse embryo cultures.
  • miR-132 is a molecule that can have the effect of directly promoting cardiomyocyte induction. Since miR-132 effectively promotes cardiomyocyte induction, compositions containing miR-132 should be widely applied in fields such as cardiomyocyte proliferation, treatment of heart disease, and prevention of heart disease. can be done.
  • miR-132 is a type of microRNA, that is, a small molecule consisting of ten to several dozen nucleic acid residues. Therefore, it is easy to transport via various delivery systems, such as by encapsulating or mixing with other molecules. It can be used for less invasive treatment to patients by delivery via a delivery system mimicking EV, for example, nanoparticles. Also, since miR-132 is a small molecule, it is easy to modulate.
  • the composition of the present embodiment is also preferably particulate.
  • the term "particulate” generally refers to an object with a sufficiently small diameter that is less affected by shape and size. It refers to a massive object in which the difference between the diameter and the longest diameter is relatively small.
  • the largest diameter is preferably nano-sized, preferably 1 to 1000 nm. It is also preferable that the particles have a diameter of 50 to 500 nm. This size makes it easy to contain the microRNA in the particle, and it is not too large to make administration easy.
  • the components constituting the particles contain other components of miR-132 (hereinafter referred to as particle components).
  • This particle component defines to some extent the shape and/or size of the particle.
  • This particle component is preferably a highly biocompatible compound.
  • the particle component conventionally known compounds used for drug delivery and the like can be used.
  • the particle component of the particles is also preferably lactic acid/glycolic acid copolymer (PLGA) nanoparticles or liposomes.
  • PLGA nanoparticles and liposomes are easy to adjust and design in terms of size, etc., have high biocompatibility, and can be suitably applied to compositions used as therapeutic materials.
  • the PLGA compound is not particularly limited in terms of copolymerization ratio, production method, and molecular size used. You can choose.
  • LNPs lipid nanoparticles
  • fatty acids such as phospholipids and cholesterol.
  • the composition of this embodiment when the composition of this embodiment is a particle, it contains miR-132 in said particle.
  • miR-132 may be mixed or complexed with the particle component.
  • miR-132 may be arranged between the molecules of the particle components and fixed by intermolecular force.
  • miR-132 may be immobilized on the particle component. If the particle component and miR-132 are strongly adhered or immobilized, selecting a particle component that decomposes under certain conditions can provide a high degree of selectivity in molecular transport.
  • miR-132 is introduced into the particles.
  • a conventionally known means may be used for the introduction.
  • microRNA is added to the aqueous phase (W phase) and biotin-PLGA is added to the organic phase (O phase).
  • W phase aqueous phase
  • O phase organic phase
  • W/O phase aqueous phase
  • this W/O phase is added dropwise to another aqueous W phase, and the solvent is distilled off to obtain PLGA nanoparticles into which microRNAs have been introduced.
  • miR-132 As a means of introducing miR-132 into LNP, it may be performed along with preparation of liposomes. For example, while stirring the lipid solution containing the lipid described above, an aqueous nucleic acid solution containing miR-132 is added dropwise to prepare a lipid/nucleic acid solution, and this lipid/nucleic acid solution is added dropwise into a buffer solution. can get.
  • composition of the present embodiment can be used for cells in vitro to promote myocardial differentiation, and can also be used for myocardial tissue in vivo. As described above, the composition of the present embodiment can be easily transported and administered, so it is suitable for use in the body of living organisms.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is a pharmaceutical composition for treating or preventing heart disease, and contains miR-132 as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may be particulate.
  • Particulate pharmaceutical compositions may be polylactic-glycolic acid (PLGA) nanoparticles or liposomes.
  • the composition can be selected from the same composition as described for the composition for promoting myocardial differentiation described above.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can be used for treating human heart disease (cardiac disease).
  • the heart disease broadly includes diseases in the heart or diseases requiring treatment of the heart.
  • the obtained cardiomyocytes may be administered to a patient, or the obtained cardiomyocytes may be used as a therapeutic agent for heart disease.
  • a method for administering the myocardial cells a means of suspending the cells in a liquid and administering them to the myocardium, or attaching the cells via a sheet, bandage, or the like can be used.
  • the heart disease includes heart failure, ischemic heart disease, myocardial infarction, cardiomyopathy, myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, diastolic phase hypertrophic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, etc., or defects due to disorders. It is not limited as long as it is a disease affecting the heart.
  • the heart disease is myocardial infarction.
  • myocardial infarction Many cases of myocardial infarction are currently recognized, and it is a serious problem.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment contains a component for promoting myocardial differentiation, so it can supplement damaged cardiac tissue.
  • treatment can be performed by administering the pharmaceutical composition without resorting to surgery or the like, which reduces the burden on the patient and is particularly effective for treating patients with serious symptoms.
  • a guideline for the effective amount of the pharmaceutical composition of the present embodiment is preferably 0.4-40 ⁇ g/kg as the amount of miRNA-132 for heart disease patients.
  • a pharmaceutical composition containing particles when liposomes are used as the particle component 0.04-4.0 mg/kg is preferable. 0.004-0.4 mg/kg is preferred for pharmaceutical compositions containing particles when PLGA-NP is used as the particle component.
  • the cardiomyocyte proliferation agent may contain other ingredients as appropriate.
  • it may contain ingredients conventionally known as those used in the treatment of diseases of the heart and other circulatory systems.
  • Another aspect of this embodiment is a method of treating or preventing heart disease, comprising administering to a subject the effective amount of the pharmaceutical composition.
  • composition and effective amount of the pharmaceutical composition can be selected from those described above.
  • the heart disease to be treated or prevented according to the present embodiment can be selected from those described above, and the heart disease may be, for example, myocardial infarction.
  • Cardiac regeneration treatment method Another aspect of this embodiment is the cardiac regeneration treatment method of this embodiment, comprising the step of administering the effective amount of the pharmaceutical composition to a subject.
  • the composition and effective amount of the pharmaceutical composition can be selected from those described above.
  • Yet another aspect of this embodiment is a composition comprising miR-132 for use in promoting myocardial differentiation. Yet another aspect of this embodiment is a composition comprising miR-132 for use in treating or preventing heart disease. Yet another aspect of this embodiment is a composition comprising miR-132 for use in cardiac regenerative therapy. Yet another aspect of this embodiment is the use of miR-132 to manufacture a composition that promotes myocardial differentiation. Yet another aspect of this embodiment is the use of miR-132 to manufacture a pharmaceutical composition for treating or preventing heart disease. Yet another aspect of this embodiment is the use of miR-132 to manufacture a composition for use in cardiac regenerative therapy.
  • composition and pharmaceutical composition of the present embodiment contain miR-132 as an active ingredient, promote myocardial differentiation, and have the effect of treating or preventing heart disease.
  • the present inventors in the process of differentiation by cell-to-cell communication mediated by EV, in the process of advancing research on a new biological phenomenon "cell phenotype synchronization (PSyC)" in which cell phenotypes are synchronized, EV identified miR-132, one potential candidate molecule for We have found that this molecule can reconstitute the molecular link of PSyC in recipient cells and reproduce the in vivo effects of EVs to induce mesoderm derivatives.
  • PSyC cell phenotype synchronization
  • EVs are attracting attention as a new intercellular communication modality that acts through hormone-like distant effects. EVs are a heterogeneous group of cell-derived membrane structures, thought to include exosomes and microvesicles, each derived from the endosomal system or shed from the plasma membrane. For example, silencing of TSG101 has been reported to reduce exosome secretion, and consistently, TSG101 knockout inhibits cell proliferation and differentiation, and TSG101KO mice exhibit embryonic lethality before and after the implantation stage.
  • mice knocking out nSMase2 another factor involved in exosome production, show hypoplasia and growth retardation in all tissues, but no fetal lethality.
  • PSyC was significantly, but not completely blocked by nSMase2 inhibitors, suggesting the involvement of other EV generation mechanisms, exosomes and/or microvesicles. .
  • PSyC regulates tissue development and homeostasis, as it establishes cell subsets for building normal tissues through synchronized mechanisms that tightly coordinate cell fate decisions and stages of differentiation. was speculated to be an important mechanism for It was thought that tissues and organs might be established and maintained by more active and bulky molecular trafficking through EV exchange between adjacent cells.
  • the present inventors found that the administration of miR-132-containing nanoparticles tends to suppress the deterioration of cardiac function after myocardial infarction.
  • the myocardial infarction model is an ischemia-reperfusion injury (I/R) model, which is relevant to the clinical situation of recanalization by catheterization after myocardial infarction.
  • I/R ischemia-reperfusion injury
  • administration of nanoparticles is intravenous, which corresponds to normal clinical intravenous injection and drip infusion treatment, and is considered to be less invasive and highly clinically useful. Sufficient therapeutic application can also be expected in the form of transcoronary administration using a catheter.
  • composition and pharmaceutical composition of the present embodiment demonstrate that miR-132 is effective in promoting cardiomyocyte differentiation and improving cardiac function after myocardial infarction, and that nanoparticles are effective as a delivery system for miR-132 to the living body. It is expected that miR-132-containing nanoparticles can be applied as therapeutic agents for cardiac regeneration. In addition, if clinical application is possible in the form of intravenous injection or infusion, cardiac regeneration treatment will be possible even in small-scale medical facilities where cardiac catheterization cannot be performed, and the range of applications will be extremely wide.
  • mice are described by Yamamizu, K.; et al. , (2009), Blood 114, 3707-16.
  • EStTA5-4 cells were prepared by introducing a plasmid carrying the EGFP gene under the control of the CAG promoter by the ES cell Nucleofector kit (VPH-1001, Lonza).
  • a piggyBac vector carrying the primary miRNA gene under the tetracycline response element (TRE) promoter and a transposon vector were introduced using Lipofectamine LTX reagent (15338500, Thermo Fisher Science) to obtain seven mouse ESC lines.
  • TRE tetracycline response element
  • ssODN single-stranded oligodeoxynuclease
  • pX330 plasmids expressing Cas9 and sgRNAs targeting the miR-132 locus were introduced into PKA-ESCs using Lipofectamine LTX reagent.
  • Cells were selected by detecting HiBit protein using the Nano Glo HiBiT Lytic Detection System (N3030, Promega).
  • pX330 was provided by Dr. Feng Zhang (Massachusetts Institute of Technology).
  • ESC lines were cultured in Glasgow minimal essential medium (GMEM; 11710-035, Thermo Fisher) with 10% knockout serum replacement (KSR; 10828-028, Thermo Fisher Scientific), 1% fetal bovine serum (FBS; SAFC Biosciences, USA).
  • GMEM Glasgow minimal essential medium
  • KSR knockout serum replacement
  • FBS fetal bovine serum
  • ESC lines were seeded in low attachment dishes, PrimeSurface Dish 35 mm (MS-9035X, Sumitomo Bakelite), or low cell attachment 96-well plates with U-bottomed conical wells (9,000 cells per well, 100 mL; MS). . Culture used 9096U, Sumilon PrimeSurface plate, Sumitomo Bakelite) differentiation medium. After 24 hours, floating aggregates were collected and plated in multiwell plates (Falcon). To generate chimeric cell aggregates, ESC lines were mixed at the indicated ratios.
  • Tissue staining was performed as follows. Cultured cells were fixed with ice-cold 4% paraformaldehyde solution for 1 hour, blocked with 2% skimmed milk (232100, Becton Dickinson) for 24 hours at 4°C, and incubated with primary antibody for 24 hours at 4°C.
  • primary antibodies include Flk1 (AVAS12, manufactured in-house, 1:500,000), PDGFR ⁇ (3174S, Cell Signaling Technology, 1:500), Oct4 (sc-5279, Santa Cruz Biotechnology, 1:200) and Nanog (RCAB002P, ReproCELL, 1:300) was used.
  • RNA sequencing of miRNA For bulk RNA sequencing, miRCURY RNA Isolation Kit (300110, EXIQON) was used to extract small RNA. Sequencing libraries were prepared using the TruSeq Small RNA Library Prep Kit (Illumina). Libraries were sequenced on the HiSeq2500 in 50-cycle single-read mode. All sequence reads were extracted in FASTQ format using BCL2 FASTQ conversion software 1.8.4 in the CASAVA 1.8.2 pipeline. Sequence reads were mapped to the mm10 reference gene using MirDeep and normalized and quantified using RPKMforGenes (downloaded Dec. 10, 2012). Gene expression levels were expressed as log2(RPKM+1).
  • Isolated EVs were lysed with 2 ⁇ sample buffer solution (Nacalai Tesque, Japan) without 2-ME and incubated at 70° C. for 5 minutes. Samples were run on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using gradient gels (E-T1020L, Atto) and subsequently electrophoretically transferred to nitrocellulose membranes. After blotting, the membrane was incubated with blocking agent Blocking One (03953-95, Nacalai Tesque) for 1 hour and then incubated with primary antibody for 24 hours at 4°C.
  • blocking agent Blocking One (03953-95, Nacalai Tesque
  • an anti-mouse or rat IgG antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) was used (1:50,000).
  • HRP horseradish peroxidase
  • Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution Kit (NKB-101, Toyobo) was used. Immunoreactivity was detected using an enhanced chemiluminescence kit, Immobilon Western (WBKLS0500, Merck Millipore). Signal intensities were calculated using ImageQuant TL software (GE Healthcare Life Sciences).
  • ELISA ELISA
  • RNA isolation, RT-PCR (reverse transcription PCR) Total RNA was isolated from cultured cells using RNeasy (QIAGEN). cDNA was synthesized using SuperScript III (11752-050, Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's manual. Quantitative RT-PCR was performed using Power SYBR Green PCR Master Mix (4367659, Thermo Fisher Scientific) and a StepOnePlus system (Thermo Fisher Scientific). Values for each gene were normalized to the relative amount of GAPDH mRNA in each sample.
  • EVs were suspended in PBS (30 ⁇ g/mL), dropped (20 ⁇ L/drop) onto the membrane side of carbon-stabilized collodion-coated grids (400 mesh; Nisshin-EM) and left at room temperature for 10 minutes. The solution was removed with filter paper and rinsed with distilled water. A 1% solution of uranyl acetate in distilled water was applied to the grid and then left at room temperature for 1 minute. The reagent was then removed with filter paper and dried. EVs were imaged with a transmission electron microscope (TEM; H-7650, Hitachi High-Technologies, Japan).
  • TEM transmission electron microscope
  • E6.5 embryos were dissected for uterus and decidua in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (1:1) containing 5% FBS (SAFC Biosciences, USA) (11039-012, Thermo Fisher Scientific). separated by Isolated embryos were 0.4 ⁇ L using 500 ⁇ L DMEM (21063-029, Thermo Fisher Scientific) containing 50% rat serum, 0.1 mM NEAA, 1 mM sodium pyruvate and 0.5 mM 2-ME. Cultures were cultured in 12 mm transwells with ⁇ m pores (3460, Corning) (for low attachment).
  • E3.5 embryos were harvested by washing the uterus with KSOM medium (prepared in-house). Embryos were collected in drops of M2 medium (M7167, Sigma-Aldrich). The zona pellucida was removed by brief exposure to drops of acid Tyrode solution (T1788, Sigma-Aldrich). M2 medium drops and Tyrode's solution drops were overlaid with mineral oil (HiGROW OIL, Fuso Pharmaceutical Co., Ltd.) and pre-equilibrated at 37° C., 5% CO 2 .
  • IVC1 in vitro medium
  • DMEM/F12 Advanced DMEM/F12 (12634-010, Thermo Fisher Penicillin (25 units/mL)/streptomycin (25 ⁇ g/mL), 1 ⁇ insulin-transferrin-selenium-ethanolamine (ITS-X) (51500-056, Thermo Fisher Scientific), 8 nM-estradiol ( E8875, Sigma-Aldrich), 200 ng/mL progesterone (160-24511, Wako, Japan) and 25 ⁇ M N-acetyl-L-cysteine (A7250, Sigma-Aldrich)) was used to remove mineral oil and M2 medium.
  • ITS-X insulin-transferrin-selenium-ethanolamine
  • 8 nM-estradiol E8875, Sigma-Aldrich
  • 200 ng/mL progesterone 160-24511, Wako, Japan
  • 25 ⁇ M N-acetyl-L-cysteine
  • IVC2 medium Advanced DMEM/F12 containing 30% KSR and supplemented with 2 mM L-glutamine and penicillin (25 units/mL)). exchanged for Streptomycin (25 ⁇ g/mL), 1 ⁇ ITS-X, 8 nM-estradiol, 200 ng/mL progesterone and 25 ⁇ M N-acetyl-L-cysteine), embryo culture was performed at 37° C. in 5% CO 2 .
  • Embryos were treated with EV or polymer poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) nanoparticles every 2 days from day 0 to day 8. All animal experiments were conducted in accordance with the Japanese Guide for the Care and Use of Laboratory Animals and in accordance with Kyoto University guidelines for animal experiments.
  • PLGA polymer poly(DL-lactide-co-glycolide)
  • Biotinylated PLGA (Nanosoft Polymers, NC) with an average molecular weight of 20,000 Da and a copolymer ratio of lactide to glycolide of 75:25 was used as the nanoparticle matrix.
  • Polyvinyl alcohol (PVA-403, Kuraray) was used as a dispersant.
  • PLGA nanoparticles incorporating mirVana miRNA mimic hsa-mir-132-3p (4464066, Thermo Fisher Science) were prepared in RNAase-free water using the emulsion solvent diffusion method as previously described (Kawashima et al. , (1998), Eur. J. Pharm. Biopharm.45, 41-48).
  • miR-132-3p The sequences of human miR-132-3p and mouse miR-132-3p were identical.
  • miR-132-PLGA contained 11.6% (w/w) miR-132.
  • Particle size was determined using a sample of nanoparticle suspension in distilled water.
  • the median diameter of miR-132-PLGA based on dynamic light scattering was 262 nm.
  • ESCs are derived from the inner cell mass (ICM) of early blastocysts and can be used as a tool to study cell differentiation processes as they can differentiate in vitro from the pluripotent state into all three germ layers.
  • ICM inner cell mass
  • FIG. 1 shows the experimental system for PKA activation.
  • PKA-ESC express the constitutively active form of PKA (CA-PKA) through the doxycycline-regulated expression system (Dox-Off).
  • Dox-Off doxycycline-regulated expression system
  • PKA-ESCs were cultured in the presence of LIF and Dox to maintain an undifferentiated state. LIF is excluded for differentiation induction.
  • PKA-ESCs differentiate faster in Dox ⁇ than Dox+.
  • FIG. 38 shows a schematic diagram of aggregate culture.
  • FIG. 2 shows immunostaining of Flk1 during differentiation of PKA-ESCs.
  • FIG. 3 shows FACS analysis for the appearance of Flk1 in PKA-ESCs.
  • Figure 4 shows the percentage of PKA-ESCs expressing Flk1 by FACS analysis and the data analyzed using the Mann-Whitney U test. Under Dox- conditions, PKA-ESCs show earlier and significantly more Flk1+ cells (*P ⁇ 0.05 versus PKA-ESCs (Dox+)). This was less than 1% activation in non-activated PKA-ESCs and more than 40% in activated PKA-ESCs. Also, FIG. 39 shows FACS analysis of pure PKA-ESC aggregates of PDGFR ⁇ , and FIG.
  • FIG. 40 shows the percentage of PDGFR ⁇ +PKA-ESCs analyzed using the Mann-Whitney U test (*versus PKA-ESC (Dox+) P ⁇ 0.05),
  • FIG. 41 shows immunostaining of PDGFR ⁇ during differentiation of pure PKA-ESC aggregates.
  • PDGFR ⁇ another mesoderm marker, was also enhanced by PKA activation.
  • Figures 42-45 show the percentage of Flkl + Control-ESC and PDGFR ⁇ + Control-ESC in FACS analysis of pure Control-ESC aggregates of Flkl and PDGFR ⁇ .
  • Figures 46 and 47 are immunostainings for Flkl ( Figure 46) and PDGFR ⁇ ( Figure 47) during differentiation of pure Control-ESC aggregates. From these results, the rate of differentiation was not altered by Dox exposure. The amount of Flk1+ cells in both Dox+ and Dox- control ESCs was less than 10% (Fig. 42).
  • FIG. 5 shows a schematic of the chimeric aggregate co-culture differentiation system.
  • PKA-ESCs and Control-ESCs were seeded in low-adhesion dishes at a 3:1 ratio to generate chimeric aggregates, induction of differentiation was initiated by depletion of LIF, and 24 h later, aggregates were re-plated onto regular plates. Plated and allowed cell attachment after about 12 hours.
  • activation of PKA resulted in different differentiation kinetics between the two cell lines.
  • differentiation was expected to be accelerated only in PKA-ESCs after PKA activation with Dox depletion.
  • FIG. 6 shows immunostaining of Flk1 during differentiation of PKA-ESC and Control-ESC chimeric aggregates.
  • FIG. 7 shows FACS analysis of Flk1 appearance on chimeric aggregates. Under Dox- conditions, Flk1+ cells in the PKA-ESC population (blue) appeared earlier, but by D3.5 the proportion of Flk1+ cells in the Control-ESC population (green) was the same as the PKA-ESC population. .
  • FIG. 8 is the percentage of chimeric aggregates expressing Flk1 during differentiation, data are means ⁇ SE. D, data were analyzed using the Mann-Whitney U test (*P ⁇ 0.05 compared to Control-ESC). From these results, in chimeric aggregates, PKA activation in PKA-ESC induces the early appearance of mesoderm cells at the same level not only in PKA-ESC but also in D3.5 Control-ESC. The results were obtained.
  • FIG. 48 shows immunostaining of PDGFR ⁇ during differentiation of chimeric aggregates.
  • the number of PDGFR ⁇ + Control-ESCs (light colors) in chimeric aggregates increased in Dox-conditions.
  • Figure 49 shows FACS analysis of PDGFR ⁇ expression on chimeric aggregates. In each graph, the left side is PKA-ESC and the right side is control-ESC.
  • Figure 50 shows the percentage of differentiating chimeric aggregates expressing PDGFR ⁇ ; represents D. From these results, a similar early and synchronized appearance of PDGFR ⁇ + cells in the Control-ESC population was seen in chimeric cell aggregates after PKA activation. These results indicate that there is a new cellular mechanism that synchronizes the cellular phenotypes of different cell populations (ie PSyC).
  • EV includes exosomes and microvesicles (microvesicles, also called ectosomes).
  • Exosomes are 50-150 nm sized EVs produced by the inward budding of endosomes.
  • Microvesicles are 100-1000 nm sized EVs produced by direct budding of the plasma membrane.
  • Cells transmit several types of biomolecules via EVs, including mRNAs, miRs, and proteins.
  • FIG. 9 shows a schematic of a chimeric aggregate co-culture differentiation system with inhibited EV secretion.
  • PKA-ESCs and Control-ESCs were seeded in low-adhesion dishes at a ratio of 3:1 to generate chimeric aggregates, and induction of differentiation was initiated by depletion of LIF. After 24 hours, the aggregates were replated on regular plates and incubated with EV secretion inhibitors.
  • FIG. 10 shows the number of Flk1 cells upon treatment with manumycin A, GW4869, PKA-ESC and Control-ESC chimeric aggregates on D3.5 under Dox conditions analyzed by FACS.
  • manumycin A and GW4869 are two inhibitors of the enzyme neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2) that regulates exosome secretion.
  • the number of Flk1+ cells was reduced by treatment with EV secretion inhibitors manumycin A (10 ⁇ M) or GW4869 (5 ⁇ M).
  • FIG. 11 shows the percentage of PKA-ESCs and Control-ESCs in chimeric aggregates expressing Flk1 under Dox-conditions. Data were analyzed using the Kruskal-Wallis test followed by the Steel-Dwass test. These results indicated that either manumycin A or GW4869 treatment had no effect on PKA-ESCs in chimeric aggregates under PKA activation at D3.5, expressing Flk1+ cells only in the Control-ESC population. was specifically and significantly reduced.
  • FIG. 12 shows immunostaining of Flk1+control-ESC (light) in chimeric aggregates using manumycin A (10 ⁇ M), GW4869 (5 ⁇ M), or DMSO (control). It was found that Flk1 expression by Control-ESCs was decreased by inhibitor treatment. These results suggest that EVs are involved in PSyC.
  • FIG. 13 shows a schematic diagram of EV collection and processing. Control-ESC aggregates were plated without LIF and EVs were collected as pellets from PKA-ESC conditioned media and added to Control-ESC aggregates. To analyze the effects of EVs secreted from PKA-ESCs, EVs were isolated in conditioned media of PKA-ESCs under inactive (EV(Dox+)) and active (EV(Dox-)) PKA conditions.
  • FIG. 14 shows an immunoblot of CD9, CD63, and CD81 in exosomal protein lysates from 10 mL of conditioned medium. These EV markers are expressed mainly in exosomes and occasionally in microvesicles. Separation of EVs was confirmed from the results in the figure.
  • FIG. 15 shows transmission electron microscopy (TEM) images of EVs in conditioned medium.
  • Figure 16 shows the analysis of EV size distribution in Dox+ (left) and Dox- (right) media. EVs were observed as 100-150 nm diameter vesicles by these electron microscopy and EV tracing analyses.
  • FIG. 51 shows EV particles in the conditioned medium
  • FIG. 52 shows the concentration of proteins contained in EVs. These results showed no significant difference in particle number and protein concentration between EV(Dox+) and EV(Dox-).
  • FIG. 17 shows FACS analysis of Flk1 + cells in EV-treated Control-ESCs on D3.5.
  • Figure 18 shows the percentage of control ESCs expressing Flk1 and the data were analyzed using the Kruskal-Wallis test followed by the Steel-Dwass test. Also shown in FIG. 53 is FACS analysis of PDGFR ⁇ expression in EV-treated Control-ESCs from day 3.5 of differentiation and PKA-ESC cultures (Dox+ or Dox ⁇ ).
  • Figure 54 shows the percentage of PDGFR ⁇ + cells and the data were analyzed using the Kruskal-Wallis test followed by the Steel-Dwass test. Data are mean ⁇ S.E.M. represents D. Addition of EVs (Dox-) to pure Control-ESC aggregates was shown to induce a much higher proportion of Flk1+ and PDGFR ⁇ + cells than without EVs or EVs (Dox+).
  • FIG. 19 shows immunostaining of mesoderm markers (Flk1, PDGFR ⁇ ) in EV-treated control-ESCs at D3.5. Data are mean ⁇ S.E.M. represents D. Consistently, immunostaining showed a dramatic increase in Flk1 and PDGFR ⁇ expression after EV(Dox-) treatment. These results indicate that EVs from activated PKA-ESCs promote mesodermal differentiation from Control-ESCs to synchronize differentiation levels.
  • mesoderm markers Flk1, PDGFR ⁇
  • FIG. 20 shows MA plots summarizing miRNAs differentially expressed in EVs from activated PKA-ESCs (Dox ⁇ ) and inactivated PKA-ESCs (Dox+). These results revealed that activated Dox- is enriched for miR-126, miR-132, miR-184, miR-193a, miR-212, and miR-483.
  • FIG. 21 shows a schematic of the experiment and a FACS plot showing recipient cells of chimeric aggregates containing miRNA-expressing cell lines on D3.5.
  • GFP+ miR-expressing cells
  • GFP ⁇ recipient cells
  • a parental mouse ESC line of miR-overexpressing cells lacked miR or GFP genes and was used as recipient cells.
  • Chimeric cell aggregates were generated containing recipient cells and each miR-expressing cell line at a 1:3 ratio.
  • FIG. 22 shows the percentage of Flk1+ recipient cells in aggregates at a 1:3 ratio and the data analyzed using the Kruskal-Wallis test followed by the Steel-Dwass test. According to these results, Flk1+ mesodermal differentiation in recipient cells (GFP ⁇ ) was significantly enhanced only when mixed with miR-132 or multimiR cell lines.
  • FIG. 56 Flk1 and PDGFR ⁇ RNA in day 3.5 control-ESCs treated with EVs from medium (Dox-) of PKA-ESCs, miR-132-KO PKA-ESCs or controls (no EVs). Expression levels are indicated. Values are normalized to controls.
  • FIG. 57 showed Flk1 mRNA expression levels in day 3.5 control-ESCs treated with or without miR-132-PLGA. Values are normalized to controls. Data were analyzed using the Mann-Whitney U test. EVs were prepared from supernatants of PKA-ESCs or miR-132 KO PKA-ESCs after PKA activation (Dox-) and added to differentiating recipient cells.
  • EVs from PKA-ESCs containing Dox- promoted mesoderm differentiation of recipient cells (similar to the results shown in Figure 17), but miR EVs derived from -132 KO PKA-ESCs (Dox-) did not promote mesoderm differentiation.
  • EV(Dox-) miR-132 is a key messenger molecule in enhancing mesodermal differentiation of recipient cells and contributes to PSyC.
  • FIG. 23 shows the results of detection of Spry1, Rasa1 and pCREB in capillary Western blot. Proteins in nuclear fractions were analyzed to determine Spry1 and pCREB expression levels and normalized with Lamin A/C. Cytoplasmic fraction proteins were analyzed to measure Rasa1 expression levels, normalized to ⁇ -actin, and data were analyzed using the Kruskal-Wallis test followed by the Steel-Dwass test. Spry1, an antagonist of the fibroblast growth factor pathway, and Rasa1, a RasGAP activator, are known targets of miR-132. The results in the figure show that treatment of Control-ESCs with EV (Dox-) significantly reduced Spry1 and Rasa1 protein levels, indicating that miR-132 acts on Control-ESCs through EV-mediated transduction.
  • Dox- significantly reduced Spry1 and Rasa1 protein levels
  • Figure 24 shows pCREB and CREB levels as measured by ELISA. Data were analyzed using the Kruskal-Wallis test followed by the Steel-Dwass test.
  • Figure 25 shows qPCR analysis of ETV2 in Control-ESCs treated with or without EVs from PKA-ESCs (Dox+ or Dox-). Data were analyzed using the Kruskal-Wallis test followed by the Steel-Dwass test. miR-132 has been reported to activate Ras/Raf1 signaling by inhibiting Spry1 and Rasa1. Raf1 has also been reported to phosphorylate CREB via the adenylate cyclase/cyclic AMP/PKA and ERK/RSK pathways.
  • pCREB enhances the expression of the ETS mutant transcription factor 2 (ETV2) and Flk1 genes, both of which are mesodermal inducers and miR-132. Therefore, it is hypothesized that decreased Spry1 and Rasa1 protein expression activates PKA signaling through pCREB, leading to mesoderm differentiation. According to the results in Figures 23-25, indeed, CREB phosphorylation and ETV2 mRNA levels in Control-ESCs are increased by the addition of EV (Dox-).
  • ETV2 ETS mutant transcription factor 2
  • Flk1 mesodermal inducers and miR-132
  • PKA-ESC-initiated PKA activation promotes Flk1+ mesodermal cell differentiation and miR-132 expression through CREB phosphorylation.
  • Activated PKA-ESCs then secrete EVs with high miR-132 content.
  • miR-132 is delivered to recipient cells via EV-mediated transfer and represses Spry1 and Rasa1. This activates the PKA pathway through CREB phosphorylation of Control-ESCs.
  • PKA activation initiated in the original PKA-ESC can be reconstituted in Control-ESC via EVs derived from PKA-ESC to evoke PSyC.
  • PSyC is a novel biological mechanism that reconstitutes similar intracellular environments of donor and recipient cells in close proximity via donor-derived EVs.
  • Figure 26 shows a schematic of the PSyC mechanism involving EV secretion and miR-132 delivery that we found.
  • FIG. 27 shows a schematic of mouse embryo culture. E6.5 mouse embryos were collected, subjected to EV (Dox-) treatment and cultured ex vivo for 2 days. Embryos were isolated and examined for PDGFR ⁇ + cells after 2 days of ex vivo culture by FACS.
  • Figure 28 shows FACS analysis of PDGFR ⁇ expression in E6.5 embryos cultured for 2 days in EVs isolated from undifferentiated (UD) control-ESCs or differentiated PKA-ESCs under Dox- conditions.
  • UD undifferentiated
  • Figure 29 shows the percentage of control ESCs expressing Flk1. Data were analyzed using the Mann-Whitney U test. The results in the figure show that significantly more PDGFR ⁇ + cells were observed in embryos when treated with EV(Dox-) compared to the untreated group, indicating that EV(Dox-) stimulated mesoderm differentiation during embryonic development. showed that it can be promoted.
  • FIG. 30 shows a schematic of mouse embryo culture. E3.5 mouse embryos were harvested and cultured ex vivo using EVs. E3.5 mouse embryos isolated from the uterus were cultured on microslides in IVC1 medium. After attaching the mouse embryos to the slides on day 2-3, the medium was changed to IVC2 medium and the embryos were cultured to day 8 or 10. EV was added once every two days.
  • FIG. 30 shows a schematic of mouse embryo culture. E3.5 mouse embryos were harvested and cultured ex vivo using EVs. E3.5 mouse embryos isolated from the uterus were cultured on microslides in IVC1 medium. After attaching the mouse embryos to the slides on day 2-3, the medium was changed to IVC2 medium and the embryos were cultured to day 8 or 10. EV was added once every two days.
  • FIG. 31 shows immunostaining of cTnT in E3.5 mouse embryos cultured for 8 days with EVs isolated from UDControl-ESCs or differentiated PKA-ESCs under Dox-conditions.
  • Figure 32 shows the percentage of cTnT+ embryos when E3.5 mouse embryos were cultured with undifferentiated ESC-derived EVs (EV(UD)) or early differentiated PKA-ESC-derived EVs (EV(Dox-)) for 10 days. rice field.
  • Figure 33 shows the percentage of beating embryos in similar cultures.
  • culturing early embryos with EV(Dox-) dramatically altered embryonic development. Appearance of cardiomyocytes with cardiac Troponin-T positive cells was enhanced in EV (Dox-) treated embryos (5 out of 17 embryos) but collected from undifferentiated Control-ESCs Embryos treated with EV (EV(UD)) were not enhanced (0/19 embryos) and untreated embryos were only slightly enhanced (1/21 embryos).
  • EV(Dox-) may convert cells into mesodermal derivatives, including cardiomyocytes, in the developing embryo.
  • miR-132 similarly affects cell fate decisions. To this end, it is formulated from the biodegradable polymer poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA), which traps a variety of molecules, including nucleic acids, penetrates cell membranes, and transports the encapsulated contents to cells. In particular, we adopted artificial polymer nanoparticles that can be delivered to the cytoplasm. PLGA nanoparticles containing miR-132 (miR-132-PLGA) were formulated. From the results of FIG.
  • PLGA biodegradable polymer poly(DL-lactide-co-glycolide)
  • miR-132-PLGA added to differentiating mouse ESCs succeeded in upregulating the expression of the mesoderm marker Flk1 mRNA, and miR-132-PLGA demonstrated the function of EV (Dox-). It shows that it is possible to imitate
  • FIG. 34 shows beating mouse embryos cultured with miR-132-PLGA from E3.5 for 10 days and FIG. 35 shows the percentage of embryos beating on days 8 and 10.
  • FIG. 36 showed cTnT immunostaining in E3.5 mouse embryos cultured for 10 days with or without miR-132-PLGA.
  • Table 1 shows the results of quality confirmation when 10 ⁇ g of has-miR-132-3p (mirVana (R) miRNA mimic) was used as the input nucleic acid.
  • the recovery rate is the recovery rate by nucleic acid quantification (Ribogreen), and converted to M (mol/L) assuming that the molecular weight of miRNA is 14000. The same applies to other samples.
  • Table 2 shows the results of quality confirmation when 10 ⁇ g of has-miR-132-3p (mirVana (R) miRNA inhibitor) was used as the input nucleic acid.
  • Table 3 shows the results of quality confirmation when 10 ⁇ g of mirVana (TM) miRNA Inhibitor Negative Control #1 was used as the input nucleic acid.
  • Lyophilizer FDU-1200, using EYELA, using eggplant type $ 29: 300 mL, 500 mL, 1000 mL EYELA as a sample flask, vacuum: ⁇ 10 Pa, temperature: -48 ° C., time: freeze-drying overnight did As a specific operation, a 50 ml tube was immersed in liquid nitrogen, and while rotating, it was confirmed that the pre-frozen sample had been frozen.
  • the miRNA molecular weight is 14,000, Input: miR-132 1800 ⁇ g/PLGA 180 mg Yield: 11.19 mg as miR-132-PLGA-NP Theoretical value: 160.9 ⁇ g miR132-3p/1 mg PLGA-NP Nucleic acid quantification (NanoDrop): 116 ⁇ g RNA/1 mg PLGA-NP Nucleic acid recovery rate 72.1%, encapsulation rate 11.6% Met.
  • miRNA-encapsulating lipid nanoparticles LNPs
  • PLGA nanoparticles as described above were prepared. Also, cultured cells were prepared. Cells were cultured in RAW264.7 (P3), 1.35 ⁇ 10 6 cells/well (24-well plate), medium: DMEM (10% FBS, 1% P/S). The nanoparticles prepared above were adjusted to match the concentration of miRNA. PLGA nanoparticles: 1 mg (powder) was diluted in 60 ml of PBS, and the lipid nanoparticles were used as they were. The miRNA-encapsulated nanoparticles or miRNA (naked) were applied to the medium according to the following concentrations.
  • Fig. 59 shows a comparison of the amount of miR-132-3p for each sample.
  • Administration of miRNA alone (naked) did not result in transfection, but nano-DDS enabled miRNA transfection in a dose-dependent manner.
  • Myocardial ischemia was induced by ligating the left anterior descending artery (LAD) using an 8-0 nylon suture with a silicone tube placed laterally to the LAD. Thirty minutes after occlusion, the silicone tubing was removed to restore blood flow (reperfusion). At the time of reperfusion, miRNA-LNP containing 100 ng of miRNA (mir132-LNP or miRNA-negative control-LNP) diluted with PBS (100 microL in total) was injected through the tail vein. After treatment, mice were placed on a heating board until fully recovered.
  • mice were anesthetized with 2% isoflurane in 2 L/min oxygen and intubated 24 hours after reperfusion.
  • the left anterior descending artery was ligated and 2% Evans blue dye (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) was injected via the inferior vena cava.
  • the heart was then excised, perfused with saline and cut into serial cross sections with a thickness of 1 mm. Sections were incubated with 1% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) for 10 min at 37° C., then placed in formaldehyde and exposed to a stereomicroscope (Nikon, HC-2500). ) was observed.
  • TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride
  • the unstained LV area by TTC was considered the infarct area. as MI regions (TTC negative, white), non-MI regions within the AAR (TTC positive/Evans blue negative, red), non-ischemic regions (TTC positive/Evans blue positive, purple), and AAR (Evans blue negative), These were quantified using ImageJ software (version 1.51h).
  • Fig. 60 shows a micrograph of miR-132-3p-LNP administration to a mouse model of myocardial ischemia-reperfusion.
  • left (a) is control LNP (ie, liposome only)
  • right (b) is miR132-LNP, that is, miR-132 at a ratio of 100 ng/100 ⁇ L was administered.
  • the left (a) shows that the unstained (white and light colors in the figure) area is wide and the infarct area is large, while the right (b) shows that the unstained area is small. That is, in a mouse model of myocardial infarction, administration of liposome particles containing miR-132 reduced the infarcted/ischemic area of the heart.
  • Fig. 61 shows the results of quantification of the stained area.
  • FIG. 63 shows a comparison of miR-132 expression levels by RT-PCR.
  • Endogenous miR-132 expression is enhanced in the ischemic region 24 hours after coronary artery ligation in mice not administered miR-132 (Control LNP administration). It was suggested that endogenous miR-132 may play a protective role in the pathophysiology of acute myocardial infarction.
  • FIG. 64 shows a comparison of miR-132 expression levels by RT-PCR when liposomes were intravenously administered.
  • a total of 4 samples were tested in the non-ischemic area and the ischemic area, with administration of miR-132-Liposome and control (LNP only).
  • miR-132-Liposome was intravenously administered after myocardial infarction, and miR-132 delivery was confirmed in non-ischemic and ischemic areas of cardiac tissue 24 hours later. It was shown that miR-132 encapsulated in Lipid Nanoparticles was delivered to cardiac tissue and contributed to the reduction of myocardial infarction.
  • the present invention provides a composition for promoting myocardial differentiation and a pharmaceutical composition for promoting myocardial differentiation, which exhibits a high function in promoting cardiomyocyte differentiation and is effective in improving cardiac function after heart disease. can provide.

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Abstract

心筋細胞の分化の促進に高い機能を発揮し、心疾患後の心機能改善に効果を有する、心筋分化を促進するための組成物および心筋分化を促進するための医薬組成物を提供する。ｍｉＲ－１３２を有効成分として含有する組成物および医薬組成物である。

Description

組成物および医薬組成物
　本発明は、心疾患の予防および／または治療に用いる、心筋分化を促進するための組成物および医薬組成物に関する。
　本願は、２０２１年３月２３日に米国に仮出願された米国特許出願番号６３／１６４，５８１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　現在、日本では心筋梗塞の症例が年間１０万例弱認められる。心臓の治療において、ヒトの心臓組織が傷害後も修復可能となれば、心筋梗塞による死を激減させうる可能性がある。しかしながら、ヒトの心臓は原則として再生しない臓器とされている。心臓の再生能力の有無は、心筋細胞の増殖能の有無によって決定されているのではないかとの説に則って、心筋細胞を増殖可能とすることにより、心臓の再生が可能になるのでは、と期待され、種々の研究がなされている。
　心臓再生医療は、現在多能性幹細胞から誘導した心筋細胞や心臓様組織の移植（細胞移植や組織移植）による新規治療開発が中心である。その一方で、より材料の調製が簡易で患者への侵襲性が低い治療法の開発へとシフトしていくことは必定である。心筋細胞の増殖を促進するような成分、またはその成分を含む培養物等の混合物等が見つかれば、その成分を投与することで、培養した心筋細胞や心臓様組織を移植するよりも侵襲性が低い治療法に用いることが期待できる。
　一方、治療に用いることができる可能性のある培養物として、細胞や細胞外小胞の培養物、培養上清等が治療用材料として研究が進められている。例えば、その中でエクソソームを含む細胞外小胞（ＥＶ）などが、現在注目されている大きな研究ターゲットの一つである。
　非特許文献１では、Ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅと呼ばれる心臓組織から培養してＳｐｈｅｒｅ状にした細胞の塊を、小児拡張型心筋症患者に移植する研究内容を開示している。この文献では、機能的にこの疾患への関与のある可能性のある成分として、マイクロＲＮＡ－１４６（ｍｉＲ－１４６）が挙げられている。
Ｈｉｒａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｅｘｏｓｏｍａｌ　ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ　ｆｏｒ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｒｅｐａｉｒ　ｉｎ　ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　ｄｉｌａｔｅｄ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ，　Ｓｃｉ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ．　２０２０　Ｄｅｃ　９；１２（５７３）
　非特許文献１では、小児拡張型心筋症患者に対する機能に関与している可能性のある成分としてｍｉＲ－１４６が挙げられているが、この成分の心臓組織に対する影響、例えば心筋細胞自体の分化、増殖に関与しているかの機序は充分に明らかになっていない。
　組織から培養した細胞塊、細胞外小胞（ＥＶ）などについては、内容物はそれが由来する細胞種や培養条件等々により大きく異なることが知られてきており、治療材料として製造しようとした際に、品質等を一定に保ちにくい側面がある。そのため、これらを単純に直接の治療材料とするには難がある。そこで、これらのＥＶ等の内容物のうち、治療効果のある成分が何であるかを特定し、また、その成分をＥＶ等の構成を模した手段により輸送して、治療材料として用いる手法を開発することが考えられる。
　本発明者らは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の分化機構の研究から、分化途上のＰＳＣ由来の細胞外小胞（ＥＶ）がＰＳＣや胎仔における心筋細胞分化を促進することを見出した。そこで、心筋細胞分化を促進する成分を、心疾患への処置に役立てるべく、さらに同ＥＶの成分、主にＥＶの内容物において、同心筋分化に寄与する分子を探索し、輸送手段に応用できるようさらに研究を進めていった。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、心筋細胞の分化の促進に高い機能を発揮し、心疾患後の心機能改善に効果を有する、心筋分化を促進するための組成物および心筋分化を促進するための医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明の実施態様は、以下の側面を有する。
　本発明の態様１は、ｍｉＲ－１３２を有効成分として含有する、心筋分化を促進するための組成物である。
　本発明の態様２は、態様１の組成物において、粒子状である。
　本発明の態様３は、態様２の組成物において、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子またはリポソームである。
　本発明の態様４は、ｍｉＲ－１３２を有効成分として含有する、心疾患を治療または予防するための医薬組成物である。
　本発明の態様５は、態様４の組成物において、粒子状である。
　本発明の態様６は、態様５の組成物において、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子またはリポソームである。
　本発明の態様７は、態様４～６のいずれか１項の医薬組成物において、前記心疾患が心筋梗塞である。
　本発明によれば、心筋細胞の分化の促進に高い機能を発揮し、心疾患後の心機能改善に効果を有する、組成物および医薬組成物が得られる。
ＰＫＡ活性化の実験システムを示す概略図である。 ＰＫＡ－ＥＳＣの分化中のＦｌｋ１の免疫染色を示す写真図である。 ＰＫＡ－ＥＳＣでのＦｌｋ１の出現に関するＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 ＦＡＣＳ分析によるＦｌｋ１を発現するＰＫＡ－ＥＳＣのパーセンテージを示すグラフ図である。 キメラ骨材共培養分化システムの概略図である。 ＰＫＡ－ＥＳＣおよびＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣキメラ凝集体の分化中のＦｌｋ１の免疫染色を示す写真図である。 キメラ凝集体上のＦｌｋ１外観のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 分化中にＦｌｋ１を発現するキメラ凝集体のパーセンテージを示すグラフ図である。 ＥＶ分泌が阻害されたキメラ凝集体共培養分化システムの概略図である。 マヌマイシンＡ、ＧＷ４８６９の処理によるＦｌｋ１細胞の数を示すグラフ図である。 Ｄｏｘ－条件下でＦｌｋ１を発現するキメラ凝集体におけるＰＫＡ－ＥＳＣおよびＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣのパーセンテージを示すグラフ図である。コントロール、マヌマイシンＡ処理、ＧＷ４８６９処理のそれぞれにおいて、左のグラフがＰＫＡ－ＥＳＣ、右のグラフがＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣの結果を示している。 マヌマイシンＡ、ＧＷ４８６９、またはＤＭＳＯを使用したキメラ凝集体におけるＦｌｋ１＋コントロール－ＥＳＣの免疫染色を示す写真図である。 ＥＶの収集と処理の概略図である。 １０ｍＬの馴化培地からのエクソソームタンパク質溶解物中のＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１のイムノブロットを示す写真図である。 馴化培地内のＥＶの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す写真図である。 Ｄｏｘ＋およびＤｏｘ－培地におけるＥＶサイズ分布の分析結果を示すグラフ図である。 Ｄ３．５上のＥＶ処理されたＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣにおけるＦｌｋ１　＋細胞のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 Ｆｌｋ１を発現するコントロールＥＳＣのパーセンテージを示すグラフ図である。 Ｄ３．５のＥＶ処理コントロール－ＥＳＣにおける中胚葉マーカー（Ｆｌｋ１、ＰＤＧＦＲα）の免疫染色を示す写真図である。 活性化ＰＫＡ－ＥＳＣ（Ｄｏｘ－）からのＥＶと不活性化ＰＫＡ－ＥＳＣ（Ｄｏｘ＋）からのＥＶで差次的に発現するｍｉＲＮＡをまとめたＭＡプロットを示すグラフ図である。 細胞キメラ実験の概略、およびＤ３．５上のｍｉＲＮＡ発現細胞株を含むキメラ凝集体のレシピエント細胞を示すＦＡＣＳプロットを示すグラフ図である。 １：３の比率での凝集体におけるＦｌｋ１＋レシピエント細胞のパーセンテージの分析したデータを示すグラフ図である。 キャピラリーウエスタンブロットにおけるＳｐｒｙ１、Ｒａｓａ１およびｐＣＲＥＢの検出結果を示すグラフ図である。 ｐＣＲＥＢおよびＣＲＥＢレベルをＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフ図である。 ＰＫＡ－ＥＳＣ（Ｄｏｘ＋またはＤｏｘ－）からのＥＶで処理された、またはＥＶなしで処理されたＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣにおけるＥＴＶ２のｑＰＣＲ分析を示すグラフ図である。 ＥＶ分泌およびｍｉＲ－１３２送達を含むＰＳｙＣメカニズムの概略図である。 本実施例のマウス胚培養の概略図である。 Ｅ６．５胚でのＰＤＧＦＲα発現のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 Ｆｌｋ１を発現するコントロールＥＳＣのパーセンテージを示すグラフ図である。 ＥＶ（Ｄｏｘ－）の影響を調べるためのマウス胚培養の概略図である。 Ｅ３．５マウス胚でのｃＴｎＴの免疫染色を示す写真図である。 Ｅ３．５マウス胚を未分化ＥＳＣ由来ＥＶ（ＥＶ（ＵＤ））または早期分化ＰＫＡ－ＥＳＣ由来ＥＶ（ＥＶ（Ｄｏｘ－））とともに１０日間培養した際の、ｃＴｎＴ＋胚のパーセンテージを示すグラフ図である。 図３２と同様の培養での拍動胚のパーセンテージを示すグラフ図である。 ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡを用いてＥ３．５から１０日間培養した鼓動するマウス胚を示す写真図である。 ８日目と１０日目の胚の拍動のパーセンテージを示すグラフ図である。 ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡの有無それぞれにおいて１０日間培養されたＥ３．５マウス胚でのｃＴｎＴの免疫染色を示すグラフ図である。 １０日目のｃＴｎＴ＋胚のパーセンテージを示すグラフ図である。 胚性幹細胞の分化段階の検討に用いる骨材培養の概略図である。 ＰＤＧＦＲαの純粋なＰＫＡ－ＥＳＣ凝集体のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 ＰＤＧＦＲα＋ＰＫＡ－ＥＳＣのパーセンテージを、マンホイットニーＵ検定を使用して分析したデータを示すグラフ図である。 純粋なＰＫＡ－ＥＳＣ凝集体の分化中のＰＤＧＦＲαの免疫染色を示す写真図である。 ＥＳＣ凝集体のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 ＥＳＣ凝集体のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 ＥＳＣ凝集体のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 ＥＳＣ凝集体のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 純粋なＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣ凝集体の分化中のＦｌｋ１の免疫染色を示す写真図である。 純粋なＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣ凝集体の分化中のＰＤＧＦＲαの免疫染色を示す写真図である。 キメラ凝集体の分化中のＰＤＧＦＲαの免疫染色を示す写真図である。 キメラ凝集体でのＰＤＧＦＲα発現のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 ＰＤＧＦＲαを発現する分化中のキメラ凝集体のパーセンテージを示すグラフ図である。 馴化培地中のＥＶ粒子の濃度を示すグラフ図である。 ＥＶに含まれるタンパク質の濃度を示すグラフ図である。 分化３．５日目およびＰＫＡ－ＥＳＣの培地（Ｄｏｘ＋またはＤｏｘ－）からのＥＶで処理されたＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣでのＰＤＧＦＲα発現のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 ＰＤＧＦＲα＋細胞のパーセンテージを示すグラフ図である。 分化２．５日目のコントロール－ＥＳＣでのＰＤＧＦＲα発現のＦＡＣＳ分析を示すグラフ図である。 ３．５日目のコントロール－ＥＳＣにおけるＦｌｋ１およびＰＤＧＦＲαのＲＮＡ発現レベルを示すグラフ図である。 ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡの有無にかかわらず処理された３．５日目のコントロール－ＥＳＣにおけるＦｌｋ１のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフ図である。 ｍｉＲＮＡ－ＰＬＧＡ－ＮＰの作成の操作の概略図である。 各サンプルごとのｍｉＲ－１３２－３ｐ量の比較を示すグラフ図である。 心筋虚血再灌流マウスモデルに対するｍｉＲ－１３２－３ｐ－ＬＮＰ投与の顕微鏡写真図である。 染色領域の定量化の結果を示すグラフ図である。 染色領域の定量化についてＮ＝６とした場合の結果を示すグラフ図である。 ＲＴ－ＰＣＲによるｍｉＲ－１３２発現量の比較を示すグラフ図である。 リポソームを経静脈的に投与したときのＲＴ－ＰＣＲによるｍｉＲ－１３２発現量の比較を示すグラフ図である。
　以下、本発明に係る組成物および医薬組成物について、実施形態を示して説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　（心筋分化を促進するための組成物）
　本実施形態の組成物は、心筋分化を促進するための組成物で、ｍｉＲ－１３２を有効成分として含有する。
　ｍｉＲ－１３２は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、タンパク質をコードしない短鎖ＲＮＡ分子の一種である。マウス等のげっ歯類やヒトをはじめ複数の哺乳類のゲノム上にｍｉＲ－１３２のファミリーがみられる。本実施形態では、各種のｍｉＲ－１３２ファミリーの分子から選択することができる。また、ｍｉＲ－１３２分子は市販されているものを用いることができる。マイクロＲＮＡとしての機能を有するものであれば、ｍｉＲ－１３２分子の各種の変異体を使用することもできる。
　例えば、心筋分化を促進する対象がヒトであれば、ヒトｍｉＲ－１３２（ＲＮＡ配列は配列番号：１）（ゲノム配列はＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＣ＿００００１７．１１）、マウスであればマウスｍｉＲ－１３２（ＲＮＡ配列は配列番号：２）（ゲノム配列はＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＣ＿００００７７．７）などから選ぶことができる。
　本発明者らは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の分化機構の研究から、分化途上のＰＳＣ由来の細胞外小胞（ＥＶ）がＰＳＣや胎仔における心筋細胞分化を促進することを見出した。さらに、同ＥＶの内容物において同心筋分化に寄与する分子を探索し、ｍｉＲ－１３２を含むマイクロＲＮＡを同定した。
　すなわち、多能性状態から３種の胚葉すべてに分化できる胚性幹細胞（ＥＳＣ）について、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）が活性化したＥＳＣ（ＰＫＡ－ＥＳＣ）は、３種の胚葉のうち、中胚葉細胞の出現が加速されている。分化の遅い細胞と分化の速い細胞の表現型を同期させて、同じ分化段階に到達する細胞の表現型のシンクロニーを研究した。細胞の表現型のシンクロニーを調節している分子機構の存在を調査し、細胞外小胞（ＥＶ）とそのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の含有量が原因であると特定した。ＰＫＡ－ＥＳＣに由来するＥＶは、中胚葉分化や、さらに心筋細胞の分化を促進していることを見出した。
　さらに、ＰＫＡ－ＥＳＣからＥＶで特異的に増加した分子の中で、ＰＫＡ活性化を再構成し、中胚葉系統の分化を促進できる機能性分子を探索したところ、ｍｉＲ－１３２が同定された。さらに、本発明者らは、ｍｉＲ－１３２を含む人工ナノ粒子をｅｘｖｉｖｏマウス胚培養に添加することによって、同様の心筋細胞誘導が再現されることも見出した。
　本発明者らは、これらの結果から、ｍｉＲ－１３２が心筋細胞誘導を直接促進する効果を有することができる分子であることを見出した。ｍｉＲ－１３２は、心筋細胞誘導を有効に促進するので、ｍｉＲ－１３２を含む組成物は、心筋細胞の増殖、心疾患の治療などの対処、または心疾患の予防等の分野に広く応用することができる。
　また、ｍｉＲ－１３２は、マイクロＲＮＡすなわち十数～数十核酸残基の小分子の一種である。そのため、他の分子に封入する、または混入するなどの手段を介した各種のデリバリーシステムを介して輸送することが容易である。ＥＶなどを模したデリバリーシステム、例えばナノ粒子を介して輸送することで、患者への侵襲性が低い治療に用いることができる。また、ｍｉＲ－１３２は小分子であるため調整も容易である。
　本実施形態の組成物は、粒子状であることも好ましい。ここで粒子状とは、一般に形状や大きさによる影響が少ない充分に径の小さい物体を指すが、本実施形態では、例えば核酸鎖のような長鎖状ではなく、小型で、かつ最も大きい短径と最も大きい長径の差が比較的小さい塊状の物体を指すものとする。具体的には、最も大きい径がナノサイズであること、１～１０００ｎｍであることが好ましい。また、前記粒子状は、径が５０～５００ｎｍであることも好ましい。このサイズであることで、マイクロＲＮＡを粒子の中に含有することが容易であり、また大きすぎないことで投与が容易である。
　組成物が粒子状であるときは、前記粒子を構成する成分が、ｍｉＲ－１３２の他の成分（以下、粒子成分）を含むことが好ましい。この粒子成分は、粒子の形状および／または大きさをある程度規定する。この粒子成分は、生体適合性が高い化合物であることが好ましい。粒子成分としては、従来知られたドラッグデリバリーに用いられる化合物等を用いることができる。
　本実施形態の組成物は、前記粒子の粒子成分が、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子またはリポソームであることも好ましい。ＰＬＧＡナノ粒子およびリポソームは、調整および大きさ等のデザインが容易であり、生体適合性が高く、治療材料として用いる組成物に好適に応用できる。
　ＰＬＧＡ化合物は、共重合の割合、製造方法および使用する分子の大きさなどは特に限定されないが、例えば乳酸とグリコールの共重合割合が１：５～５：１、重合度は２０００～２００００Ｄａなどから選択できる。
　リポソームは、製造方法および使用する分子の大きさなどは特に限定されず、従来知られた方法から適宜選択できる。例えば、リン脂質やコレステロールなどの脂肪酸を用いてＬＮＰ（脂質ナノ粒子）を調整してもよい。
　本実施形態の組成物は、粒子であるときは、前述の粒子にｍｉＲ－１３２を含む。
　粒子がｍｉＲ－１３２を含む形態としては、前記粒子成分にｍｉＲ－１３２が混合または複合されていてもよい。例えば、混合または複合の形態としては、粒子成分の分子間にｍｉＲ－１３２が配置され、分子間力で固着していてもよい。また、粒子成分に対してｍｉＲ－１３２が固定化されていてもよい。なお、粒子成分とｍｉＲ－１３２との固着または固定化が強固なものである場合、粒子成分は一定条件で分解するものを選択すると、分子の輸送において高度な選択制を持たせることができる。
　具体的には、前記粒子にｍｉＲ－１３２が導入されている。導入の手段は、従来知られたものを用いてもよい。例えば、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子にマイクロＲＮＡを導入（インプット）する手段としては、水相（Ｗ相）にマイクロＲＮＡ、有機相（Ｏ相）にビオチン－ＰＬＧＡを加え、混合してＷ／Ｏ相を作り、さらにこのＷ／Ｏ相を別の水系のＷ相に対して滴下し、溶媒を留去することでマイクロＲＮＡを導入されたＰＬＧＡナノ粒子が得られる。
　ＬＮＰにｍｉＲ－１３２を導入する手段としては、リポソームの調整と共に行ってもよい。例えば、上述の脂質を含む脂質溶液を攪拌しながら、ｍｉＲ－１３２を含む水系の核酸溶液を滴下して脂質／核酸溶液を調整し、この脂質／核酸溶液を緩衝液内にさらに滴下することによって得られる。
　本実施形態の組成物は、心筋分化を促進するためにはin vitroの細胞に対しても用いることもでき、また生物の体内の心筋組織に対して用いることもできる。上述したように、本実施形態の組成物は、輸送や投与が容易なので、生物の体内に用いることが好適である。
　（心疾患を治療または予防するための医薬組成物）
　本実施形態の医薬組成物は、心疾患を治療または予防するための医薬組成物で、ｍｉＲ－１３２を有効成分として含有する。医薬組成物は、粒子状であってもよい。粒子状の医薬組成物は、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子またはリポソームであってもよい。
　上記構成は、上述の心筋分化を促進するための組成物について記載したものと同様の構成から選択することができる。
　本実施形態の医薬組成物は、ヒトの心臓の疾患（心疾患）の治療に用いることができる。ここで心臓の疾患とは、心臓における疾患、または心臓の処置の必要がある疾患を広く含む。本実施形態の心筋細胞を治療に用いるには、得られた心筋細胞を患者に投与する、または得られた心筋細胞を心臓の疾患の治療剤として用いてもよい。前記心筋細胞の投与の方法としては、細胞を液状に懸濁して心筋層に投与する、または細胞をシートやバンデージ等を介して添付するといった手段を用いることができる。前記心臓の疾患としては、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症、拡張型心筋症などの疾患、または障害による欠損等を広く含み、心臓に影響のある疾患であれば限定されない。
　本実施形態の医薬組成物は、前記心疾患が心筋梗塞であることも好ましい。心筋梗塞は現在症例が多数認められ、深刻な問題となっている。上述のように、本実施形態の医薬組成物は心筋分化を促進するための成分を含むので、傷害の生じた心臓組織を補うことができる。また、上述したように手術等によらずとも医薬組成物の投与により治療を行うことができるので、患者への負担が少なく、深刻な症状の生じた患者への処置に特に有効である。
　本実施形態の医薬組成物の有効量の目安は、心疾患の患者に対して、ｍｉＲＮＡ－１３２の量として０．４－４０μｇ／ｋｇが好ましい。また、前述の粒子成分としてリポソームを用いた場合の粒子を含む医薬組成物の場合は、０．０４－４．０ｍｇ／ｋｇが好ましい。前述の粒子成分としてＰＬＧＡ－ＮＰを用いた場合の粒子を含む医薬組成物の場合は、０．００４－０．４ｍｇ／ｋｇが好ましい。
　このとき、心筋細胞増殖剤は、適宜他の成分を含んでいてもよい。例えば、心臓その他の循環器の疾患の処置に用いられる成分として従来知られているものを含んでいてもよい。
　（本実施形態の他の側面）
　（心疾患の治療または予防方法）
　本実施形態の他の側面は、前記医薬組成物の前記有効量を、対象に投与する工程を含む心疾患の治療または予防方法である。
　ここで、前記医薬組成物の構成および有効量としては、上述のものから選択できる。
　本実施形態の心疾患の治療または予防方法は、対象となる心疾患については、上述したものから選択でき、例えば心疾患が心筋梗塞であってもよい。
　（心臓再生治療方法）
　本実施形態の他の側面は、前記医薬組成物の前記有効量を、対象に投与する工程を含む本実施形態の心臓再生治療方法である。
　医薬組成物の構成および有効量としては、上述のものから選択できる。
　（本実施形態のさらに他の側面）
　本実施形態のさらに他の側面は、心筋分化の促進における使用のための、ｍｉＲ－１３２を含む組成物である。
　本実施形態のさらに他の側面は、心疾患の治療または予防における使用のための、ｍｉＲ－１３２を含む組成物である。
　本実施形態のさらに他の側面は、心臓再生治療における使用のための、ｍｉＲ－１３２を含む組成物である。
　本実施形態のさらに他の側面は、心筋分化を促進する組成物を製造するための、ｍｉＲ－１３２の使用である。
　本実施形態のさらに他の側面は、心疾患を治療または予防する医薬組成物を製造するための、ｍｉＲ－１３２の使用である。
　本実施形態のさらに他の側面は、心臓再生治療に用いる組成物を製造するための、ｍｉＲ－１３２の使用である。
　本実施形態のさらに他の側面は、ｍｉＲ－１３２を用いた、心筋分化を促進する組成物の製造方法である。
　本実施形態のさらに他の側面は、ｍｉＲ－１３２を用いた、心疾患を治療または予防する医薬組成物の製造方法である。
　本実施形態のさらに他の側面は、ｍｉＲ－１３２を用いた、心臓再生治療に用いる組成物の製造方法である。
（本実施形態の効果）
　本実施形態の組成物および医薬組成物は、ｍｉＲ－１３２を有効成分として含有し、心筋分化を促進し、心疾患を治療または予防する効果を有する。
　本発明者らは、ＥＶを介した細胞間コミュニケーションによる分化の過程で、細胞の表現型が同期するという新しい生物学的現象「細胞の表現型同期（ＰＳｙＣ）」について研究を進める過程で、ＥＶの１つの潜在的な候補分子である、ｍｉＲ－１３２を特定した。本発明者らは、この分子が、ＰＳｙＣのレシピエント細胞の分子リンクを再構成し、ＥＶのｉｎ　ｖｉｖｏ効果を再現して中胚葉誘導体を誘導することができることを見出した。
　本発明者らの知見により、これまで中胚葉を誘導することが報告されていなかったｍｉＲ－１３２が、ＰＫＡ活性化の再構成を通じてＥＶレシピエント細胞に中胚葉誘導を引き起こすことが見出された。ＥＶは、ホルモンに類似した遠隔効果を介して作用する新しい細胞間コミュニケーションモダリティとして注目されている。ＥＶは、細胞由来の膜構造の不均一なグループであり、それぞれエンドソーム系に由来する、または原形質膜から脱落する、エクソソームおよびマイクロベシクルを含むと考えられている。例えば、ＴＳＧ１０１のサイレンシングは、エクソソーム分泌を減少させることが報告されており、一貫して、ＴＳＧ１０１のノックアウトは細胞の増殖と分化を阻害し、ＴＳＧ１０１ＫＯマウスは着床段階の前後で胚の致死性を示すことが報告されている。一方で、エクソソーム産生に関与する他の因子ｎＳＭａｓｅ２をノックアウトしたマウスは、すべての組織で形成不全と成長遅延を示すが、胎児の致死性は示さない。発明者らの研究では、ＰＳｙＣはｎＳＭａｓｅ２阻害剤によって有意にブロックされたが、完全にはブロックせず、他のＥＶ生成メカニズム、エクソソームおよび／またはマイクロベシクルの関与も示唆していると考えられた。
　本発明者らは、近接した細胞間の新しい細胞間コミュニケーションメカニズムを見出した。すなわち、ＰＳｙＣは、細胞の運命決定と分化の段階を厳密に調整する同期メカニズムを通じて、正常組織を構築するための細胞サブセットを確立することから、さらに、ＰＳｙＣは組織の発達と恒常性を調節するための重要なメカニズムであると推測された。組織および器官は、隣接する細胞間のＥＶ交換を介して、より活発で大量の分子輸送によって確立および維持される可能性が考えられた。
　本発明者らは、ｍｉＲ－１３２含有ナノ粒子の投与により、心筋梗塞後の心機能低下が抑制される傾向が認められることを見出した。心筋梗塞モデルは、虚血－再灌流傷害（Ｉ／Ｒ）モデルであり、心筋梗塞後にカテーテル治療により再開通した臨床状況に即している。またナノ粒子の投与は経静脈的であり、臨床における通常の静脈注射や点滴治療に相当し、侵襲性が少なく臨床的有用性が高いと思われる。カテーテルを用いて経冠動脈的に投与する形でも十分な治療応用が期待できる。
　本実施形態の組成物および医薬組成物は、心筋細胞分化促進、さらには心筋梗塞後の心機能改善にｍｉＲ－１３２が効果を有すること、及び、その生体へのデリバリーシステムとして、ナノ粒子が有効であることを示し、ｍｉＲ－１３２含有ナノ粒子が、心臓再生治療薬として応用できることが期待される。また、静脈注射や点滴などの形で臨床応用が可能であれば、心臓カテーテルが施行できない小規模医療施設でも心臓再生治療が可能となり、その応用範囲は非常に大きい。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によって限定されない。
　［使用した材料、方法］
　（ＥＳＣ系統）
　マウスＥＳＣ系統はＹａｍａｍｉｚｕ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，（２００９），Ｂｌｏｏｄ　１１４、３７０７―１６の手法により調整した。ピューロマイシン耐性遺伝子を含むマウスＥＳＣ系統であるＥＳｔＴＡ５－４　は、江良択実博士（熊本大学）より提供を受けた。
　（コントロールＥＳＣ（ＧＦＰ－ＥＳＣ）、ユビキタスプロモーター駆動ＥＧＦＰ遺伝子を運ぶマウスＥＳＣ系統）
　Ａｍａｘａマウスを使用して、ＥＳ細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（ＶＰＨ－１００１、Ｌｏｎｚａ）によりＥＳｔＴＡ５－４細胞にＣＡＧプロモーターの制御下でＥＧＦＰ遺伝子を運ぶプラスミドを導入することによって調整した。
　（テトラサイクリン調節可能なｍｉＲＮＡとＧＦＰを運ぶマウスＥＳＣ系統）
　テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーターの下に一次ｍｉＲＮＡ遺伝子を運ぶｐｉｇｇｙＢａｃベクターとトランスポゾンベクターをリポフェクタミンＬＴＸ試薬（１５３３８５００、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して導入し、７つのマウスＥＳＣ系統を得た。
　（ＭｉＲ－１３２ノックアウト（ＫＯ）ＰＫＡ－ＥＳＣ系統）
　ｍｉＲ－１３２のゲノム領域を最小プロモーターとＨｉＢｉｔを含む一本鎖オリゴデオキシヌクレアーゼ（ｓｓＯＤＮ）で置き換えることによって調整した。ｓｓＯＤＮ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＵＳＡに注文）およびＣａｓ９を発現するｐＸ３３０プラスミドとｍｉＲ－１３２遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡを、リポフェクタミンＬＴＸ試薬を使用してＰＫＡ－ＥＳＣに導入した。Ｎａｎｏ　Ｇｌｏ　ＨｉＢｉＴ　Ｌｙｔｉｃ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎ３０３０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＨｉＢｉｔタンパク質を検出することにより、細胞を選択した。ｐＸ３３０は、Ｆｅｎｇ　Ｚｈａｎｇ博士（マサチューセッツ工科大学）から提供を受けた。
　（プラスミドの構築）
　一次ｍｉＲ遺伝子は、マウスＥＳＣのゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ついで、マルチｍｉＲ配列はＧＥＮＥＷＩＺを使用して合成した。これらの配列をｐＥＮＴＲプラスミドベクターにクローニングした後、Ｇａｔｅｗａｙ　ＬＲ　Ｃｌｏｎａｓｅ　ＩＩ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（１１７９１－０２０、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｐｉｇｇｙＢａｃベクター（Ｗｏｌｔｊｅｎ，Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，（２００９），Ｎａｔｕｒｅ　４５８，７６６－７０）と組換えを行った。ｐｉｇｇｙＢａｃベクターとトランスポゾンベクターは、Ｋｎｕｔ　Ｗｏｌｔｊｅｎ博士（ＣｉＲＡ、京都大学）より提供を受けた。
　（細胞培養）
　ＥＳＣ系統は、１０％ノックアウト血清代替品（ＫＳＲ；１０８２８－０２８、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を含むグラスゴー最小必須培地（ＧＭＥＭ；１１７１０－０３５、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２，０００ユニット／　ｍＬ白血病抑制因子（ＬＩＦ；Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；１１１４０－０５０、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｍｅｉｊｉ　Ｓｅｉｋａ　Ｐｈａｒｍａ）、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｍｅｉｊｉ　Ｓｅｉｋａ　Ｐｈａｒｍａ）および０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ；２１９８５－０２３、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内にて培養した。また、ＰＫＡ－ＥＳＣの維持のために、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を追加した。
　（細胞分化操作）
　細胞の分化は、１０％ＦＢＳ（１０４３７－０２８、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２．２μｇ／ｍＬ　ＮａＨＣＯ３（０９６５５－２５、ナカライテスク）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび０．１ｍＭ２－ＭＥを含むＭＥＭａｌｐｈａ（１１９００－０２４、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより誘導した。
　また、ＥＶの分泌を阻害するために、凝集体をマヌマイシンＡ（ＢＶＴ－００９１、ＢｉｏＶｉｏｔｉｃａ）またはＧＷ４８６９（１３１２７、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で処理した。
　（凝集体の形成）
　ＥＳＣ系統は、低接着ディッシュ、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　Ｄｉｓｈ　３５　ｍｍ（ＭＳ－９０３５Ｘ、住友ベークライト）、またはＵ底円錐ウェル（ウェルあたり９，０００細胞、１００ｍＬ；ＭＳ）を備えた低細胞接着９６ウェルプレートに播種した。培養は９０９６Ｕ、Ｓｕｍｉｌｏｎ　ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅプレート、住友ベークライト）分化培地を使用した。２４時間後、浮遊凝集体を収集し、マルチウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）にプレーティングした。キメラ細胞凝集体を作製するために、ＥＳＣ株を示された比率で混合した。
　（ＦＡＣＳ分析）
　培養細胞は、分化中のＤ１．５、Ｄ２．５、Ｄ３．５、およびＤ４．５（Ｄ＝日）に採取され、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗Ｆｌｋ１　ｍＡｂ（ＡＶＡＳ１２）とフィコエリトリン（ＰＥ）の組み合わせで染色した。結合した抗血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲα　ｍＡｂ（１２－１４０１－８１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはＣｙｔｏＦＬＥＸ　Ｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。
　（免疫組織化学）
　組織染色は以下で行った。培養細胞を氷冷した４％パラホルムアルデヒド溶液で１時間固定し、２％スキムミルク（２３２１００、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で４℃で２４時間ブロックし、一次抗体と４℃で２４時間インキュベートした。ここで一次抗体としては、Ｆｌｋ１（ＡＶＡＳ１２、自社製、１：５００，０００）、ＰＤＧＦＲα（３１７４Ｓ、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：５００）、Ｏｃｔ４（ｓｃ－５２７９、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：２００）およびＮａｎｏｇ（ＲＣＡＢ００２Ｐ、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ、１：３００）を使用した。
　一次抗体のインキュベーション後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：５００）に結合した二次抗体と４℃で２４時間インキュベートした。
　核はＤＡＰＩ（４，６ジアミジノ－２－フェニルインドール；Ｄ３５７１、Ｔｈｅｒｍｏ　ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。
　（ｍｉＲＮＡのＲＮＡシーケンス）
　バルクＲＮＡシーケンスでは、ｍｉＲＣＵＲＹ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（３００１１０、ＥＸＩＱＯＮ）を使用してｓｍａｌｌＲＮＡを抽出した。　ＴｒｕＳｅｑ　Ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（イルミナ）を使用してシーケンスライブラリーを調製した。ライブラリは、ＨｉＳｅｑ２５００の５０サイクルシングルリードモードでシーケンスされました。すべてのシーケンス読み取りは、ＣＡＳＡＶＡ１．８．２パイプラインのＢＣＬ２ＦＡＳＴＱ変換ソフトウェア１．８．４を使用してＦＡＳＴＱ形式で抽出した。シーケンスリードは、ＭｉｒＤｅｅｐを使用してｍｍ１０参照遺伝子にマッピングされ、ＲＰＫＭｆｏｒＧｅｎｅｓ（２０１２年１２月１０日ダウンロード版）を使用して正規化および定量化した。遺伝子発現レベルはｌｏｇ２（ＲＰＫＭ＋１）で表した。
　（ウエスタンブロッティング）
　分離したＥＶを、２－ＭＥを含まない２×サンプルバッファー溶液（ナカライテスク、日本）で溶解し、７０℃で５分間インキュベートした。サンプルは、勾配ゲル（Ｅ－Ｔ１０２０Ｌ、Ａｔｔｏ）を使用してドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で泳動し、続いてニトロセルロース膜に電気泳動で転写した。ブロット後、メンブレンをブロッキング剤Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（０３９５３－９５、Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）で１時間インキュベートし、次に一次抗体とともに４℃で２４時間インキュベートした。二次抗体としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗マウスまたはラットＩｇＧ抗体を使用した（１：５０，０００）。シグナルエンハンサーとして、Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＮＫＢ－１０１、東洋紡）を使用した。免疫反応性は、強化された化学発光キット、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｗｅｓｔｅｒｎ（ＷＢＫＬＳ０５００、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して検出した。信号強度は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＴＬソフトウェア（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して計算した。
　（キャピラリーウエスタンブロット）
　細胞溶解物をＮＥ－ＰＥＲ核および細胞質抽出キット（７８８３５、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理して、細胞質画分と核画分を分離した。リン酸化サイクリックＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ｐＣＲＥＢ）、Ｓｐｒｙ１およびＲａｓａ１の発現レベルは、ＷＥＳデバイス（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｉｍｐｌｅ）を使用して測定した。
　（ＥＬＩＳＡ）
　総ＣＲＥＢおよびｐＣＲＥＢは、ＥＬＩＳＡ（８５－８６１５３－１１、Ｉｎｓｔａｎｔ　Ｏｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ＣＲＥＢ１、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キットを使用し、製造元マニュアルに従って定量化の操作を行った。
　（ＲＮＡ分離、ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ））
　ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用し、培養細胞からトータルＲＮＡを単離した。製造元マニュアルに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ（１１７５２－０５０、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡを合成した。
　定量ＲＴ－ＰＣＲは、Ｐｏｗｅｒ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（４３６７６５９、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。各遺伝子の値は、各サンプルのＧＡＰＤＨｍＲＮＡの相対量に対して正規化した。
　（ＥＶの分離）
　１．０×１０５　ＰＫＡ－ＥＳＣを、分化培地を含む１０ｃｍディッシュに播種した。２日後、培地を新しいものに交換した。さらに１．５～２．５日間培養した後、分化培地を回収し、２，０００ｇで２０分間室温で遠心分離した。
　ついで、上清を回収し、１２，０００ｇで３０分間室温で遠心分離した。細胞の破片と細胞外マトリックスの塊を取り除くために、上清を０．２μｍポアフィルター（ザルトリウス）でろ過し、次に上清を１００，０００ｇで６０分間、４℃で超遠心分離した。この操作のペレットとして、ＥＶを分離した。
　インビトロのＥＶ処理実験では、ｑＮａｎｏ（ＩＺＯＮ）分析に基づいて、約１．０×１０１０ＥＶがセルに追加されていた。ｅｘ　ｖｉｖｏ　ＥＶ治療実験では、約１．０×１０１０ＥＶを４つに分割して添加した。
　（ＥＶトラッキング分析）
　ＥＶをＰＢＳに再懸濁し、ｑＮａｎｏを使用してＥＶのサイズと数を分析した。
　（透過型電子顕微鏡分析）
　ＥＶをＰＢＳ（３０μｇ／ｍＬ）に懸濁し、炭素安定化コロジオンコーティンググリッド（４００メッシュ；Ｎｉｓｓｈｉｎ－ＥＭ）の膜側に滴下（２０μＬ／液滴）し、室温で１０分間放置した。溶液を濾紙で除去し、蒸留水ですすいだ。蒸留水に溶解した酢酸ウラニルの１％溶液をグリッドに適用し、次に室温で１分間放置した。ついで、試薬を濾紙で除去し、乾燥させた。ＥＶは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；Ｈ－７６５０、日立ハイテクノロジーズ、日本）で画像化した。
　（マウス）
　３．５日目、または６．５日目の妊娠中のＩＣＲマウスは、Ｊａｐａｎ　ＳＬＣ、Ｉｎｃから購入したものを用いた。
　（胚のｅｘ　ｖｉｖｏ培養）
　Ｅ６．５の胚は、５％ＦＢＳ（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（１：１）（１１０３９－０１２、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で子宮と脱落膜を解剖することによって分離した。単離された胚は、５０％ラット血清、０．１ｍＭ　ＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．５ｍＭの２－ＭＥを含む５００μＬ　ＤＭＥＭ（２１０６３－０２９、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、０．４　μｍポア（３４６０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）（低接着用）の１２ｍｍトランスウェルで培養した。
　ＥＶの有無にかかわらず２日間培養した後、胚を０．２５％トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で３７℃で１５～２５分間解離させた。細胞をＰＥ結合抗ＰＤＧＦＲαｍＡｂ（１２－１４０１－８１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。
　Ｅ３．５の胚は、子宮をＫＳＯＭ培地（社内で調製）で洗浄して回収した。胚をＭ２培地（Ｍ７１６７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の液滴に収集した。透明帯は、酸性タイロードの溶液滴（Ｔ１７８８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に短時間さらすことで除去した。
　Ｍ２ミディアムドロップとタイロードの溶液ドロップを鉱油（ＨｉＧＲＯＷ　ＯＩＬ、扶桑薬品工業）で覆い、３７℃、５％ＣＯ２で事前に平衡化した。
　透明帯を含まない胚盤胞を、２０％ＦＢＳを含み２　ｍＭ　Ｌ－グルタミン（２５０３０－０８１、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したｉｎ　ｖｉｔｒｏ培地（ＩＶＣ１）（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１２６３４－０１０、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄した。ペニシリン（２５ユニット／ｍＬ）／ストレプトマイシン（２５μｇ／ｍＬ）、１×インスリン－トランスフェリン－セレニウム－エタノールアミン（ＩＴＳ－Ｘ）（５１５００－０５６、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、８ｎＭ－エストラジオール（Ｅ８８７５、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２００ｎｇ／ｍＬプロゲステロン（１６０－２４５１１、和光、日本）および２５μＭ　Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ａ７２５０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））を使用して、ミネラルオイルとＭ２培地を除去し、μ－スライド８ウェル（８０８２６、イビディ）のプレートに播種した。前記プレートのウェルは、前述のように事前に平衡化されたＩＶＣ１培地で満たされていた。
　胚がプレートの底に付着してから２、３日後、培地を化学合成されたＩＶＣ２培地（３０％ＫＳＲを含み、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、ペニシリン（２５ユニット／ｍＬ）を添加したＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に交換した。ストレプトマイシン（２５μｇ／ｍＬ）、１×ＩＴＳ－Ｘ、８ｎＭ－エストラジオール、２００ｎｇ／ｍＬプロゲステロンおよび２５μＭ　Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン）、５％ＣＯ２中３７℃で胚培養を行った。胚は、０日目から８日目まで２日ごとにＥＶまたはポリマーポリ（ＤＬ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子で処理した。
　すべての動物実験は、日本の実験動物の管理と使用に関するガイドに準拠し、京都大学の動物実験のガイドラインに従って実施した。
　（ＰＬＧＡナノ粒子の調製）
　平均分子量が２０，０００Ｄａで、ラクチドとグリコリドの共重合体比が７５：２５のビオチン化ＰＬＧＡ（Ｎａｎｏｓｏｆｔ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、ＮＣ）をナノ粒子のマトリックスとして使用した。ポリビニルアルコール（ＰＶＡ－４０３、Ｋｕｒａｒａｙ）は分散剤として使用した。
　ｍｉｒＶａｎａ　ｍｉＲＮＡ　ｍｉｍｉｃ　ｈｓａ－ｍｉｒ－１３２－３ｐ（４４６４０６６、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を組み込んだＰＬＧＡナノ粒子は、前述のように、ＲＮＡａｓｅを含まない水中でエマルジョン溶媒拡散法を使用して調製した（Ｋａｗａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９８），Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４５，４１－４８）。ヒトｍｉＲ－１３２－３ｐとマウスｍｉＲ－１３２－３ｐの配列は同一であった。
　ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡには１１．６％（ｗ／ｗ）のｍｉＲ－１３２が含まれていた。蒸留水中のナノ粒子懸濁液のサンプルを使用して、粒子サイズを決定した。動的光散乱に基づくｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡの直径の中央値は２６２ｎｍであった。
　（統計分析）
　差異の有意性は、２つのグループ間の比較のためのマンホイットニーＵ検定、または複数の比較のためのクラスカルウォリス検定とそれに続くスティール－ドワス検定を使用して評価した。Ｐ＞０．０５は有意ではないとした。
　［試験例１］
　（心筋細胞分化促進に関与する因子の探索）
　（胚性幹細胞の分化段階の検討）
　本発明者らは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）を用いて多能性幹細胞（ＰＳＣ）の分化機構の研究を行った。ＥＳＣは、初期胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、多能性状態からｉｎ　ｖｉｔｒｏで３つの胚葉すべてに分化できるため、細胞分化プロセスを研究するためのツールとして用いることができる。
　本発明者らは以前に、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）がドキシサイクリンの枯渇（Ｄｏｘ－ＯＦＦ）によって構成的に活性化されるマウスＥＳＣラインＰＫＡ－ＥＳＣを生成している。図１はＰＫＡ活性化の実験システムを示す。ＰＫＡ－ＥＳＣは、ドキシサイクリン調節発現システム（Ｄｏｘ－Ｏｆｆ）を介して、構成的に活性な形態のＰＫＡ（ＣＡ－ＰＫＡ）を発現する。未分化状態を維持するために、ＰＫＡ－ＥＳＣをＬＩＦおよびＤｏｘの存在下で培養した。ＬＩＦは分化誘導のために除外されている。ＰＫＡ－ＥＳＣは、Ｄｏｘ＋よりもＤｏｘ－の方が速く分化する。図３８に骨材培養の概略図を示す。マウスＥＳＣを低接着ディッシュに播種して骨材を作成し、ＬＩＦの枯渇によって分化誘導を開始し、２４時間後、骨材を通常のプレートに再プレートし、約１２時間後に細胞接着している。Ｆｌｋ１＋細胞において、ＰＫＡ－ＥＳＣ（Ｄｏｘ－）においてＤｏｘ＋より早く分化が起こることを示している。
　図２はＰＫＡ－ＥＳＣの分化中のＦｌｋ１の免疫染色を示す。図３はＰＫＡ－ＥＳＣでのＦｌｋ１の出現に関するＦＡＣＳ分析を示す。図４はＦＡＣＳ分析によるＦｌｋ１を発現するＰＫＡ－ＥＳＣのパーセンテージで、マンホイットニーＵ検定を使用してデータを分析したものを示す。Ｄｏｘ－条件下では、ＰＫＡ－ＥＳＣはより早くそして有意に多くのＦｌｋ１＋細胞を示している（＊ＰＫＡ－ＥＳＣ（Ｄｏｘ＋）に対してＰ＜０．０５）。これ非活性化したＰＫＡ－ＥＳＣでは活性化は１％未満で、活性化したＰＫＡ－ＥＳＣでは４０％以上であった。
　また、図３９はＰＤＧＦＲαの純粋なＰＫＡ－ＥＳＣ凝集体のＦＡＣＳ分析、図４０はＰＤＧＦＲα＋ＰＫＡ－ＥＳＣのパーセンテージを、マンホイットニーＵ検定を使用して分析したデータ（＊ＰＫＡ－ＥＳＣ（Ｄｏｘ＋）に対してＰ＜０．０５）、図４１は純粋なＰＫＡ－ＥＳＣ凝集体の分化中のＰＤＧＦＲαの免疫染色を示す。他の中胚葉マーカーであるＰＤＧＦＲαもＰＫＡ活性化により向上が見られた。
　図４２～４５はＦｌｋ１、およびＰＤＧＦＲαの純粋なＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣ凝集体のＦＡＣＳ分析でＦｌｋ１＋コントロール－ＥＳＣおよびＰＤＧＦＲα＋コントロール－ＥＳＣのパーセンテージを示す。図４６と４７は純粋なＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣ凝集体の分化中のＦｌｋ１（図４６）およびＰＤＧＦＲα（図４７）の免疫染色である。これらの結果から、分化の速度はＤｏｘ曝露によっては変化はなかった。Ｄｏｘ＋、Ｄｏｘ－の両方でコントロールＥＳＣ内でのＦｌｋ１＋細胞量は１０％以下であった（図４２）。
　ついで、ＰＫＡ－ＥＳＣの細胞凝集体とコントロールＥＳＣを作成した。図５は、キメラ骨材共培養分化システムの概略図を示す。ＰＫＡ－ＥＳＣとＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣを低接着ディッシュに３：１の比率で播種してキメラ凝集体を作成し、ＬＩＦの枯渇によって分化誘導を開始し、２４時間後、骨材を通常のプレートに再プレートし、約１２時間後に細胞接着した。この共培養システムでは、ＰＫＡの活性化により２つの細胞株間では異なる分化速度が見られた。すなわち、分化は、Ｄｏｘ枯渇を伴うＰＫＡ活性化後のＰＫＡ－ＥＳＣでのみ加速されると予想された。
　図６は、ＰＫＡ－ＥＳＣおよびＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣキメラ凝集体の分化中のＦｌｋ１の免疫染色を示す。キメラ骨材（白）中のＦｌｋ１＋Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣの数は、Ｄｏｘ－条件で増加した。図７は、キメラ凝集体上のＦｌｋ１外観のＦＡＣＳ分析を示す。Ｄｏｘ－条件下では、ＰＫＡ－ＥＳＣ集団（青）のＦｌｋ１＋細胞が早く現れたが、Ｄ３．５までに、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣ集団（緑）のＦｌｋ１＋細胞の割合はＰＫＡ－ＥＳＣ集団と同じになった。図８は分化中にＦｌｋ１を発現するキメラ凝集体のパーセンテージで、データは平均±Ｓ．Ｄを表し、マンホイットニーＵ検定を使用してデータを分析した（＊Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣと比較してＰ＜０．０５）。これらの結果より、キメラ凝集体では、ＰＫＡ－ＥＳＣでのＰＫＡ活性化により、ＰＫＡ－ＥＳＣだけでなく、Ｄ３．５のＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣでも同等のレベルで中胚葉細胞の早期出現が誘導されるという結果が得られた。
　図６に示すＦｌｋ１の免疫染色によると、Ｄｏｘ－条件下で、ＧＦＰ－細胞（ＰＫＡ－ＥＳＣ）だけでなくＧＦＰ＋細胞（コントロールＥＳＣ）でもＦｌｋ１＋細胞の早期出現が観察されたことを示しましている。ＧＦＰ＋Ｆｌｋ１＋細胞の数は、図６に示すように、Ｄｏｘ－，Ｆｌｋ１／ＧＦＰで明色でみられる。この細胞数はＤ２．５から現れ、この条件でのＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣのより速い分化を示唆している。
　フローサイトメトリー分析（図７および図８）は、Ｄｏｘ枯渇後のＦｌｋ１＋細胞の早期の同期した出現をより明確に示した。コントロール条件（Ｄｏｘ＋）では、ＰＫＡ－ＥＳＣとコントロールＥＳＣの両方が、Ｄ４．５まで同等のレベルでＦｌｋ１＋細胞に同様に分化していた（図８）。また、ＰＫＡ－ＥＳＣでのみＰＫＡを活性化するＤｏｘ－条件では、Ｆｌｋ１＋細胞の出現はＤ２．５からのＰＫＡ－ＥＳＣで誘発され、Ｄ３．５－４．５で対照条件よりもはるかに高いレベルに達していた。
　Ｄｏｘの枯渇がＰＫＡを活性化しなかったとしても、ＰＫＡ－ＥＳＣの初期の分化に続いているかのように、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣ集団のＦｌｋ１＋細胞が現れ始め、最終的にはＤＫＡ－ＥＳＣ集団の細胞とパーセンテージで追いつくという結果が見られた（コントロール－ＥＳＣ、図７）。Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣ集団のＦｌｋ１＋細胞の割合は、ＤＫＡ－ＥＳＣ集団のそれよりもＤ３．５まで遅れていたが、その後、それらの分化レベルは同様となっていた（図８）。
　図４８は、キメラ凝集体の分化中のＰＤＧＦＲαの免疫染色を示す。キメラ凝集体中のＰＤＧＦＲα＋　Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣの数（明色）は、Ｄｏｘ－条件で増加した。図４９は、キメラ凝集体でのＰＤＧＦＲα発現のＦＡＣＳ分析を示す。それぞれのグラフにおいて左側がＰＫＡ－ＥＳＣ、右側がコントロール－ＥＳＣである。図５０は、ＰＤＧＦＲαを発現する分化中のキメラ凝集体のパーセンテージを示し、データは平均±Ｓ．Ｄを表す。
　これらの結果から、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣ集団におけるＰＤＧＦＲα＋細胞の同様の初期の同期した出現は、ＰＫＡ活性化後のキメラ細胞凝集体で見られた。これらの結果は、異なる細胞集団（すなわち、ＰＳｙＣ）の細胞表現型を同期させる新しい細胞メカニズムが存在することを示している。
　（ＰＳｙＣのメカニズムの検討）
　ついで、本発明者らは、ＰＳｙＣのメカニズムを検討した。体液性因子、ギャップ結合、ＥＶなどのＰＳｙＣを行うことができる細胞間通信システムを検索し、ＥＶを有力な候補として発見した。ここでＥＶには、エクソソームとマイクロベシクル（微小胞、エクトソームとも呼ばれる）が含まれる。エクソソームは、エンドソームの内向きの出芽によって生成される５０～１５０ｎｍサイズのＥＶである。マイクロベシクルは、原形質膜の直接出芽によって生成される１００～１０００ｎｍサイズのＥＶである。細胞は、ＥＶを介して、ｍＲＮＡ、ｍｉＲ、およびタンパク質など、いくつかの種類の生体分子を伝達する。
　まず、ＥＶ分泌を阻害することによってＥＶの機能喪失について検討した。
　図９は、ＥＶ分泌が阻害されたキメラ凝集体共培養分化システムの概略図を示すものである。ＰＫＡ－ＥＳＣとＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣを低接着ディッシュに３：１の比率で播種してキメラ凝集体を作成し、ＬＩＦの枯渇によって分化誘導を開始した。２４時間後、骨材を通常のプレートに再播種し、ＥＶ分泌阻害剤とともに培養した。
　図１０は、マヌマイシンＡ、ＧＷ４８６９の処理によるＦｌｋ１細胞の数を示し、Ｄｏｘ条件下でのＤ３．５上のＰＫＡ－ＥＳＣおよびＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣキメラ凝集体をＦＡＣＳによって分析した。ここで、マヌマイシンＡとＧＷ４８６９は、エクソソーム分泌を調節する酵素中性スフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ２）の２つの阻害剤である。Ｆｌｋ１＋細胞の数は、ＥＶ分泌阻害剤であるマヌマイシンＡ（１０μＭ）またはＧＷ４８６９（５μＭ）の処理により減少した。図１１は、Ｄｏｘ－条件下でＦｌｋ１を発現するキメラ凝集体におけるＰＫＡ－ＥＳＣおよびＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣのパーセンテージを示す。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とそれに続くＳｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定を使用してデータを分析した。これらの結果によると、マヌマイシンＡまたはＧＷ４８６９処理のいずれかは、Ｄ３．５でのＰＫＡ活性化下のキメラ凝集体のＰＫＡ－ＥＳＣに影響を与えることなく、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣ集団でのみＦｌｋ１＋細胞の発現を特異的かつ有意に減少させた。
　図１２は、マヌマイシンＡ（１０μＭ）、ＧＷ４８６９（５μＭ）、またはＤＭＳＯ（コントロール）を使用したキメラ凝集体におけるＦｌｋ１＋コントロール－ＥＳＣ（明色）の免疫染色を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣによるＦｌｋ１の発現が阻害剤処理によって減少したことが明らかになった。これらの結果は、ＰＳｙＣにＥＶが関与していることを示唆している。
　ついで、ＰＫＡ－ＥＳＣから分泌されたＥＶの影響を分析するために、ＥＶの収集を行った。図１３に、ＥＶの収集と処理の概略図を示す。コントロール－ＥＳＣ凝集体はＬＩＦなしでプレーティングし、ＥＶはＰＫＡ－ＥＳＣの馴化培地からペレットとして収集し、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣの骨材に添加した。ＰＫＡ－ＥＳＣから分泌されたＥＶの影響を分析するために、非アクティブ（ＥＶ（Ｄｏｘ＋））およびアクティブ（ＥＶ（Ｄｏｘ－））ＰＫＡ条件下でＰＫＡ－ＥＳＣの馴化培地でＥＶを分離した。
　図１４に、１０ｍＬの馴化培地からのエクソソームタンパク質溶解物中のＣＤ９、ＣＤ６３、およびＣＤ８１のイムノブロットを示す。ＥＶマーカーであるこれらは、主にエクソソームで、場合によってはマイクロベシクルで発現している。図の結果より、ＥＶの分離が確認された。
　図１５に、馴化培地内のＥＶの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。図１６に、Ｄｏｘ＋（左）およびＤｏｘ－（右）培地におけるＥＶサイズ分布の分析結果を示す。これらの電子顕微鏡およびＥＶ追跡分析によって、ＥＶは直径１００～１５０ｎｍの小胞として観察された。
　ここで、図５１には馴化培地中のＥＶ粒子、図５２にはＥＶに含まれるタンパク質の濃度を示す。これらの結果からは、ＥＶ（Ｄｏｘ＋）とＥＶ（Ｄｏｘ－）の粒子数とタンパク質濃度に有意差は認められなかった。
　図１７にはＤ３．５上のＥＶ処理されたＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣにおけるＦｌｋ１　＋細胞のＦＡＣＳ分析を示す。図１８にはＦｌｋ１を発現するコントロールＥＳＣのパーセンテージを示し、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とそれに続くＳｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定を使用してデータを分析した。また、図５３には分化３．５日目およびＰＫＡ－ＥＳＣの培地（Ｄｏｘ＋またはＤｏｘ－）からのＥＶで処理されたＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣでのＰＤＧＦＲα発現のＦＡＣＳ分析を示した。図５４にはＰＤＧＦＲα＋細胞のパーセンテージを示し、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とそれに続くＳｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定を使用してデータを分析した。データは平均±Ｓ．Ｄを表す。
　純粋なＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣ凝集体へのＥＶ（Ｄｏｘ－）の添加は、ＥＶまたはＥＶ（Ｄｏｘ＋）がない場合よりもはるかに高い割合のＦｌｋ１＋およびＰＤＧＦＲα＋細胞を誘導することが示された。
　図１９には、Ｄ３．５のＥＶ処理コントロール－ＥＳＣにおける中胚葉マーカー（Ｆｌｋ１、ＰＤＧＦＲα）の免疫染色を示す。データは平均±Ｓ．Ｄを表す。一貫して、免疫染色は、ＥＶ（Ｄｏｘ－）処理後にＦｌｋ１およびＰＤＧＦＲαの発現の劇的な増加を示した。これらの結果は、活性化されたＰＫＡ－ＥＳＣからのＥＶが、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣから中胚葉への分化を促進して分化レベルを同期させることを示している。
　（ＥＶ由来のｍｉＲによるＰＳｙＣの制御の検討）
　発明者らはついで、次に、ＰＳｙＣを誘発するＥＶ内の分子を特定しようと試みた。
　まず、ＥＶ（Ｄｏｘ＋）とＥＶ（Ｄｏｘ－）に含まれるグローバルｍｉＲ発現プロファイルをｍｉＲ－ｓｅｑで比較した。
　図２０は、活性化ＰＫＡ－ＥＳＣ（Ｄｏｘ－）からのＥＶと不活性化ＰＫＡ－ＥＳＣ（Ｄｏｘ＋）からのＥＶで差次的に発現するｍｉＲＮＡをまとめたＭＡプロットを示す。これらの結果からは、活性化したＤｏｘ－においては、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１９３ａ、ｍｉＲ－２１２、およびｍｉＲ－４８３に富んでいることが判明した。
　ついで、Ｄｏｘ－ＯＦＦシステムで６ｍｉＲすべて（マルチｍｉＲ）または各ｍｉＲをＧＦＰと一緒に過剰発現するＥＳＣ系統を生成し、細胞キメラ実験を行った。
　図２１は、実験の概略およびＤ３．５上のｍｉＲＮＡ発現細胞株を含むキメラ凝集体のレシピエント細胞を示すＦＡＣＳプロットを示す。ｍｉＲ発現細胞（ＧＦＰ＋）からレシピエント細胞（ＧＦＰ－）に移されたｍｉＲの効果を具体的に評価するために、レシピエント細胞のみの中胚葉誘導を分析した。ｍｉＲ過剰発現細胞の親マウスＥＳＣラインは、ｍｉＲまたはＧＦＰ遺伝子を持たず、レシピエント細胞として使用した。レシピエント細胞と各ｍｉＲ発現細胞株を１：３の比率で含むキメラ細胞凝集体を生成した。
　図２２は、１：３の比率での凝集体におけるＦｌｋ１＋レシピエント細胞のパーセンテージを示し、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とそれに続くＳｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定を使用してデータを分析したものを示す。
　これらの結果によると、レシピエント細胞（ＧＦＰ－）におけるＦｌｋ１＋中胚葉分化は、ｍｉＲ－１３２またはマルチｍｉＲ細胞株と混合した場合にのみ有意に促進された。
　さらに、ｍｉＲ－１３２　ＫＯ　ＰＫＡ－ＥＳＣを生成することにより、レシピエント細胞の中胚葉誘導におけるＥＶ転送ｍｉＲ－１３２の役割を確認した。
　図５５は、分化２．５日目のコントロール－ＥＳＣでのＰＤＧＦＲα発現のＦＡＣＳ分析を示した。ＰＫＡ－ＥＳＣ、ｍｉＲ－１３２－ＫＯＰＫＡ－ＥＳＣまたはコントロール（ＥＶなし）の培地（Ｄｏｘ－）からのＥＶで処理したものである。
　図５６は、ＰＫＡ－ＥＳＣ、ｍｉＲ－１３２－ＫＯ　ＰＫＡ－ＥＳＣまたはコントロール（ＥＶなし）の培地（Ｄｏｘ－）からのＥＶで処理された３．５日目のコントロール－ＥＳＣにおけるＦｌｋ１およびＰＤＧＦＲαのＲＮＡ発現レベルを示した。値はコントロールに対して正規化されている。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とそれに続くＳｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定を使用してデータを分析した。
　図５７は、ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡの有無にかかわらず処理された３．５日目のコントロール－ＥＳＣにおけるＦｌｋ１のｍＲＮＡ発現レベルを示した。値はコントロールに対して正規化されている。マンホイットニーＵ検定を使用してデータを分析した。
　ＥＶは、ＰＫＡ活性化（Ｄｏｘ－）後のＰＫＡ－ＥＳＣまたはｍｉＲ－１３２　ＫＯ　ＰＫＡ－ＥＳＣの上清から調製し、分化中のレシピエント細胞に添加した。
　これらの結果によると、Ｄｏｘ－（ＥＶ（Ｄｏｘ－））を含むＰＫＡ－ＥＳＣからのＥＶは、レシピエント細胞の中胚葉分化を促進したが（図１７で示した結果と同様である）、ｍｉＲ－１３２　ＫＯ　ＰＫＡ－ＥＳＣ（Ｄｏｘ－）に由来するＥＶは中胚葉分化を促進することはなかった。これらの結果は、ＥＶ（Ｄｏｘ－）のｍｉＲ－１３２が、レシピエント細胞の中胚葉分化の増強における主要なメッセンジャー分子であり、ＰＳｙＣに寄与することを示している。
　さらに、ｍｉＲ－１３２を搭載したＥＶを受け取った後のレシピエント細胞におけるＰＳｙＣ誘導の細胞内分子機構を調査した。
　図２３は、キャピラリーウエスタンブロットにおけるＳｐｒｙ１、Ｒａｓａ１およびｐＣＲＥＢの検出結果を示す。核画分のタンパク質を分析してＳｐｒｙ１とｐＣＲＥＢの発現レベルを測定し、Ｌａｍｉｎ　Ａ／Ｃで正規化した。細胞質画分のタンパク質を分析してＲａｓａ１の発現レベルを測定し、β－アクチンで正規化し、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とそれに続くＳｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定を使用してデータを分析した。
　線維芽細胞成長因子経路のアンタゴニストであるＳｐｒｙ１、およびＲａｓＧＡＰアクチベーターであるＲａｓａ１は、ｍｉＲ－１３２の標的であることが知られる。図の結果からは、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣをＥＶ（Ｄｏｘ－）で処理すると、Ｓｐｒｙ１およびＲａｓａ１タンパク質レベルが大幅に低下し、ｍｉＲ－１３２がＥＶを介した伝達を通じてＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣで作用することを示している。
　図２４は、ｐＣＲＥＢおよびＣＲＥＢレベルをＥＬＩＳＡで測定したものを示す。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とそれに続くＳｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定を使用してデータを分析した。図２５は、ＰＫＡ－ＥＳＣ（Ｄｏｘ＋またはＤｏｘ－）からのＥＶで処理された、またはＥＶなしで処理されたＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣにおけるＥＴＶ２のｑＰＣＲ分析を示す。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とそれに続くＳｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定を使用してデータを分析した。
　ｍｉＲ－１３２は、Ｓｐｒｙ１およびＲａｓａ１を阻害することによりＲａｓ／Ｒａｆ１シグナル伝達を活性化することが報告されている。また、Ｒａｆ１はアデニル酸シクラーゼ／サイクリックＡＭＰ／ＰＫＡおよびＥＲＫ／ＲＳＫ経路を介してＣＲＥＢをリン酸化することが報告されている。さらに、ｐＣＲＥＢは、ＥＴＳ変異体転写因子２（ＥＴＶ２）およびＦｌｋ１遺伝子の発現を促進させ、これらは両方とも中胚葉誘導物質であり、ｍｉＲ－１３２である。したがって、Ｓｐｒｙ１およびＲａｓａ１タンパク質の発現の低下は、ｐＣＲＥＢを介したＰＫＡシグナル伝達を活性化し、中胚葉の分化をもたらすと仮定されている。
　図２３～２５の結果によると、実際、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣのＣＲＥＢリン酸化およびＥＴＶ２　ｍＲＮＡのレベルは、ＥＶ（Ｄｏｘ－）の追加によって増加している。
　総括すると、これらの結果は、ＰＫＡ活性化後のＰｓｙＣにおける分子的関連を次のように示唆している。まず、ＰＫＡ－ＥＳＣで開始されたＰＫＡの活性化は、ＣＲＥＢリン酸化を介してＦｌｋ１＋中胚葉細胞の分化とｍｉＲ－１３２の発現を促進する。ついで、活性化されたＰＫＡ－ＥＳＣは、ｍｉＲ－１３２の含有量が高いＥＶを分泌します。ｍｉＲ－１３２は、ＥＶを介した転送を介してレシピエント細胞に送達され、Ｓｐｒｙ１とＲａｓａ１を抑制する。これにより、Ｃｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣのＣＲＥＢリン酸化を介してＰＫＡ経路が活性化される。したがって、元のＰＫＡ－ＥＳＣで開始されたＰＫＡの活性化は、ＰＫＡ－ＥＳＣから派生したＥＶを介してＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣで再構成し、ＰＳｙＣを呼び起こすことができる。これらの発見に続いて、ＰＳｙＣは、ドナー由来のＥＶを介して近接したドナー細胞とレシピエント細胞の同様の細胞内環境を再構成する新しい生物学的メカニズムであると結論付けることができる。
　図２６に、発明者らが見出したＥＶ分泌およびｍｉＲ－１３２送達を含むＰＳｙＣメカニズムの概略図を示す。
　（ｍｉＲによる心筋細胞分化促進の検討）
　ついで発明者らは、分化中のＥＳＣからのＥＶが胚発生中の細胞運命に影響を与えるかどうかを調べた。まず、ＥＶ（Ｄｏｘ－）が中胚葉期胚に及ぼす影響を確認した。
　図２７は、マウス胚培養の概略図を示す。Ｅ６．５マウス胚を収集し、ＥＶ（Ｄｏｘ－）処理を行ってｅｘ　ｖｉｖｏで２日間培養した。胚を分離し、ＦＡＣＳによるｅｘ　ｖｉｖｏ培養の２日後に胚のＰＤＧＦＲα＋細胞を調た。
　図２８に、未分化（ＵＤ）コントロール－ＥＳＣまたは分化ＰＫＡ－ＥＳＣからＤｏｘ－条件下で単離されたＥＶで２日間培養されたＥ６．５胚でのＰＤＧＦＲα発現のＦＡＣＳ分析を示す。図２９に、Ｆｌｋ１を発現するコントロールＥＳＣのパーセンテージを示す。マンホイットニーＵ検定を使用してデータを分析した。
　図の結果からは、ＥＶ（Ｄｏｘ－）で処理した場合、未処理のグループと比較して、胚で有意に多くのＰＤＧＦＲα＋細胞が観察され、ＥＶ（Ｄｏｘ－）が胚発生における中胚葉分化を促進できることを示した。
　さらに、初期段階からの細胞運命決定に対するＥＶ（Ｄｏｘ－）の影響を調べた。着床前から着床後まで連続的に胚を観察するために、Ｂｅｄｚｈｏｖ，Ｉ．ｅｔ　ａｌ．，（２０１４）　Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，９，２７３２－９で開示されたｅｘ　ｖｉｖｏ培養システムを使用した。
　図３０に、マウス胚培養の概略図を示す。Ｅ３．５マウス胚を収集し、ＥＶを使用してｅｘ　ｖｉｖｏで培養した。子宮から分離されたＥ３．５マウス胚は、ＩＶＣ１培地のマイクロスライド上で培養した。　２～３日目にマウス胚をスライドに付着させた後、培地をＩＶＣ２培地に交換し、胚を８日目または１０日目まで培養した。ＥＶは２日に１回添加した。
　図３１に、Ｄｏｘ－条件下でＵＤＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣまたは分化ＰＫＡ－ＥＳＣから単離されたＥＶで８日間培養されたＥ３．５マウス胚でのｃＴｎＴの免疫染色を示した。図３２に、Ｅ３．５マウス胚を未分化ＥＳＣ由来ＥＶ（ＥＶ（ＵＤ））または早期分化ＰＫＡ－ＥＳＣ由来ＥＶ（ＥＶ（Ｄｏｘ－））とともに１０日間培養した際の、ｃＴｎＴ＋胚のパーセンテージを示した。図３３に、同様の培養での拍動胚のパーセンテージを示した。
　これらの結果からは、予想困難なことであるが、初期の胚をＥＶ（Ｄｏｘ－）で培養すると、胚の発生が劇的に変化した。心臓トロポニン－Ｔ陽性細胞を伴う心筋細胞の出現は、ＥＶ（Ｄｏｘ－）で処理された胚（１７個の胚のうち５個）で増強されたが、未分化のＣｏｎｔｒｏｌ－ＥＳＣから収集されたＥＶ（ＥＶ（ＵＤ））で処理された胚では増強されず（１９個中０個の胚）、未処理の胚でも僅かしか増強されなかった（２１個中１個の胚）。
　さらに、わずかなＥＶ（ＵＤ）処理および未処理の胚（それぞれ４０個中２個の胚と２１個中０個の胚）でわずかな拍動またはけいれんが検出されたのに対し、明白かつ典型的な自発的拍動を伴う別個の細胞クラスターが、時には全胚で、ＥＶ（Ｄｏｘ－）処理胚で観察された（８５個の胚のうち１１個）。したがって、ＥＶ（Ｄｏｘ－）は、発生中の胚において、細胞を心筋細胞を含む中胚葉誘導体に変える可能性があることが示された。
　さらに、ｍｉＲ－１３２が同様に細胞運命決定に作用するかどうかを確認しました。この目的のために、生分解性ポリマーポリ（ＤＬ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）から処方され、核酸を含むさまざまな分子を捕捉し、細胞膜に浸透し、カプセル化された内容物を細胞内、細胞質に送達できる人工高分子ナノ粒子を採用した。ｍｉＲ－１３２（ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡ）を含むＰＬＧＡナノ粒子を配合した。前述の図５７の結果より、分化中のマウスＥＳＣに追加されたｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡは、中胚葉マーカーＦｌｋ１　ｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションに成功し、ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡがＥＶ（Ｄｏｘ－）の機能を模倣できることを示している。
　図３４は、ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡを用いてＥ３．５から１０日間培養した鼓動するマウス胚を示し、図３５は、８日目と１０日目の胚の拍動のパーセンテージを示した。図３６は、ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡの有無それぞれにおいて１０日間培養されたＥ３．５マウス胚でのｃＴｎＴの免疫染色を示した。図３７は、１０日目のｃＴｎＴ＋胚のパーセンテージを示し、データは平均±Ｓ．Ｄを表す。
　ＥＶ（Ｄｏｘ－）を添加した場合と同様に、ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡをＥ３．５マウス胚に添加した場合、８日目から心筋細胞の拍動が観察され、１０日目まで数が増加した。コントロール（Ｎ＝２８）では３％である一方、ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡグループ（Ｎ＝２０）では２５％に達していた。心筋細胞が拍動しているすべての胚は、心臓トロポニン－Ｔに対して陽性であった。したがって、ｍｉＲ－１３２は、ｉｎ　ｖｉｖｏで中胚葉および心筋細胞への細胞運命を変化させることに関して、ＥＶ（Ｄｏｘ－）と同じ可能性を示すことが示された。
　［試験例２］
　（ｍｉＲＮＡナノ粒子の作成）
　ｍｉＲＮＡを含むナノ粒子として、脂質ナノ粒子、ビオチン化ＰＬＧＡナノ粒子を作成し、ｍｉＲＮＡのトランスフェクションを試みた。
　（ｍｉＲＮＡ脂質ナノ粒子の作成）
　必要資材として以下のものを用いた。
・１．５ｍＬチューブ×１本
・５．０ｍＬチューブ×２本
・１５ｍＬ遠心管
・Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４（ＭＷＣＯ１００，０００）　Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　カタログ＃ＵＦＣ８１００９６
・２０ｍＭリンゴ酸＋３０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ３．０に調整済みのもの）：リンゴ酸緩衝液
・ＰＢＳ（－）
・ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｃａ，Ｍｇ不含）ナカライテスク、カタログ＃１４２４９－２４
・１０ｍＭ　ＳＳ－ＯＰ　エタノール溶液
・１０ｍＭ　コレステロールエタノール溶液（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ；ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ　カタログ番号　Ｃ８６６７－５００ＭＧ）
・３ｍＭ　ＰＥＧ－ＤＭＧエタノール溶液
・エタノール（特級グレード）
・１μｇ／μＬ　（２５０　ｎｍｏｌ　ｍｉＲＮＡ／３５００μＬ　ＲＮＡａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ）に調整済みｍｉＲＮＡ溶液（ｍｉｒ－ＮＣ，　ｍｉｒ－１３２－３ｐ）．Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ，　ｍｉｒＶａｎａ　ｍｉＲＮＡ・２０ｍＭ　ＨＥＲＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４に調整済みのもの）
　５ｍＬチューブに１．０ｍＬリンゴ酸緩衝液、１５ｍＬ遠沈管に３．０ｍＬ　ＰＢＳ（－）を添加した。１ｍｇ／ｍＬｍｉＲＮＡ溶液を１０μＬとリンゴ酸緩衝液１１４μＬを１．５ｍＬチューブに溶解した。
　下記の脂質溶液を新しい５ｍＬチューブに添加（ピペッティング）した。１０ｍＭ　ＳＳ－ＯＰ　７５μＬ、１０ｍＭ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　７５μＬ（パラフィルムで密閉）１ｍＭ　ＰＥＧ－ＤＭＧ　４５μＬ（３ｍＭの場合は１５μＬに調整可能）、ＥｔＯＨ　２０５μＬ（ｔｏｔａｌ　４００μＬになるように調整した）。
　この脂質溶液をｖｏｒｔｅｘミキサーで攪拌しながら（チューブの上を持つ）、核酸溶液を徐々に添加（滴下に１０秒ほどかける）、終わっても３秒ほど攪拌し続けた。ついで、前記リンゴ酸緩衝液を攪拌しながら滴下した。
　ＰＢＳ（－）の入った１の１５ｍｌチューブをｖｏｒｔｅｘミキサーで攪拌しながら、５の脂質／核酸溶液を徐々に滴下した（滴下に１０秒ほどかけた）。全量をＡｍｉｃｏｎに移し、５００μＬのＰＢＳで容器を洗い、洗浄液もロスが少ないようＡｍｉｃｏｎに移した。
　ついで、１０００ｇ、室温、５ｍｉｎで延伸分離した。様子を見ながら何度か遠心、懸濁し、今回は×４回＝２０分を行った。
　ついで、Ａｍｉｃｏｎを取り出して下層を捨てた。４ｍＬ　ＰＢＳを上層に足して、再度遠心する（２０分ほど遠心し、最終溶液を１００μＬ以下とした）。Ａｍｉｃｏｎ内のフィルターをＰＢＳで何回か洗浄しながら、天秤を用いて質量（＝容積）を測定し、１．０ｇにした（新しい１．５ｍｌチューブを使用）。調整した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は４℃で保存した。
　インプットする核酸としてｈａｓ－ｍｉＲ－１３２－３ｐ（ｍｉｒＶａｎａ（Ｒ）　ｍｉＲＮＡ　ｍｉｍｉｃ）１０μｇを用いた場合の品質確認の結果を表１に示した。
　なお、回収率は核酸定量（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）による回収率であり、ｍｉＲＮＡの分子量１４０００としてＭ（ｍｏｌ／Ｌ）に換算した。他サンプルも同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　インプットする核酸としてｈａｓ－ｍｉＲ－１３２－３ｐ（ｍｉｒＶａｎａ（Ｒ）ｍｉＲＮＡ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）１０μｇを用いた場合の品質確認の結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　インプットする核酸としてｍｉｒＶａｎａ（ＴＭ）　ｍｉＲＮＡ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　＃１　１０μｇを用いた場合の品質確認の結果を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（ｍｉＲＮＡ－ＰＬＧＡ－ＮＰの作成）
　ＰＬＧＡのＮＰ（ナノ粒子）の作成、ｍｉＲＮＡの導入を行った。なお、操作の概要を図５８に示した。
　必要資材として以下のものを用いた。
（Ｗ／Ｏ相内のＷ）
・ｍｉＲＮＡ１３２－３Ｐ　（１μｇ／μＬ）　　６００μｇ　
・ＲＮＡａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　６００μＬ　
（Ｗ／Ｏ相内のＯ）
・Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＬＧＡ　６０ｍｇ　
・アセトン　２．４　ｍＬ
・エタノール（Ｅｔｏｈ）　１．２ｍＬ
（Ｗ相）
・４％ＰＶＡ溶液　１５ｇ
・ｍｉｌｌｉ－Ｑ　４５ｇ＋α
　（１：晶折）
　使用機器として、
　ぺリスタポンプ：ＭＡＳＴＥＲＦＬＥＸ　Ｌ／Ｓ，　Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ
　ウォーターバス：ＴＢＳ２４１ＲＡ，　ＡＤＶＡＮＴＥＣ、
　スターラー（小）：ＳＲＳ０１６ＡＡ，　ＡＤＶＡＮＴＥＣ
　スターラー（大）：ＳＲＳ７１０ＡＡ，　ＡＤＶＡＮＴＥＣ
　を準備した。
　Ｗ相は撹拌速度：５００ｒｐｍ，ウォーターバス温度：４０℃三角フラスコで攪拌を続けた。まず、Ｗ相にＷ／Ｏ相を滴下した。Ｗ／Ｏ相の流入速度：０．３ｍＬ／ｍｉｎ　でビーカーを用いた。流入を確認し、Ｗ／Ｏ相がすべて滴下するのを確認した。ついで、分量外のアセトン＋エタノールでチューブを洗浄、この液体もＷ相に滴下した。
　（２：留去）
　使用機器として
　エバポレーター：Ｎ－１２００Ｂ，　ＮＶＣ－２２００，　ＣＣＡ－１１１１，　ＯＳＢ－２１００（回転数：１５０ｒｐｍ，　減圧：１２０ｈＰａ　６０ｍｉｎ　、ついで　６０ｈＰａ　２０ｍｉｎ）
　を準備した。
　溶液を５００ｍｌナス型試料フラスコへ入れ、ＰＶＡが泡立つので分量外のＭｉｌｌｉ－Ｑを三角フラスコに入れ、泡がなくなるまでナスフラスコに入れていった。フラスコ＋溶液の重量は２４３．６４ｇであった。エバポレーターによる留去の操作を行い、終了後重量を測定（フラスコ＋溶液）はすると２４０．８８ｇであった。
　（３：粗濾過）
　減圧濾過用フィルターホルダー：ＫＧ－４７、ＡＤＶＡＮＴＥＣ、吸引濾過ビン：アズワンを用いて、５．０μｍフィルター：１枚を介して減圧濾過した。
　（４：洗浄）
　濾過物を５０ｍＬチューブに分注し、１２０００Ｇ、時間：６０ｍｉｎ、温度：４℃で遠心分離した。上清をデカントで捨て、チューブにＭｉｌｌｉＱ水を１０ｍＬ加えた。５ｍｉｎ超音波にかけ、沈殿をＭｉｌｌｉＱに懸濁させた。遠心分離から懸濁までの操作をもう一度繰り返した。ついで、上清を捨て、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を５ｍＬ加えた。
　（５：凍結乾燥）
　凍結乾燥機：ＦＤＵ－１２００，　ＥＹＥＬＡを用い、試料フラスコとしてナス型　＄２９：３００ｍＬ，　５００ｍＬ，　１０００ｍＬ　ＥＹＥＬＡを用いて、減圧：～１０Ｐａ，温度：－４８℃，時間：ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔの条件で凍結乾燥を行った。
　具体的な操作としては、５０ｍｌチューブを液体窒素につけ、回転させながら、予備凍結試料の凍結を確認し、凍結乾燥機に装着させたあと、Ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔで凍結乾燥した。
　得られたｍｉＲＮＡ－ＰＬＧＡ－ＮＰの品質確認は、ｍｉＲＮＡ分子量を１４，０００として、
　インプット：ｍｉＲ－１３２　１８００μｇ／ＰＬＧＡ　１８０ｍｇ
　収量：ｍｉＲ－１３２－ＰＬＧＡ－ＮＰとして１１．１９ｍｇ
　理論値：１６０．９μｇ　ｍｉＲ１３２－３ｐ／１ｍｇ　ＰＬＧＡ－ＮＰ
　核酸定量（ＮａｎｏＤｒｏｐ）：１１６μｇ　ＲＮＡ／１　ｍｇ　ＰＬＧＡ－ＮＰ
　核酸回収率７２．１％、封入率１１．６％
　であった。
　（Ｎａｎｏ－ＤＤＳによるｍｉＲ１３２－３ｐトランスフェクション）
　試薬として、以下のものを用いた。
・ＳＳ－ＯＰ，　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，　ＰＥＧ－ＤＭＧ・・・（前述の脂質ナノ粒子の作成方法にて作成）
・Ｂｉｏｔｉｎ化ＰＬＧＡ・・・（前述のＰＬＧＡ－ＮＰの作成方法にて作成）
・Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ，　ｍｉｒＶａｎａ　ｍｉＲＮＡ　Ｍｉｍｉｃ，　ｈａｓ－ｍｉｒ　１３２－３ｐ（ＡｓｓａｙＩＤ：ＭＣ１０１６６）、製品番号：４４６４０６６
・Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ，　ｍｉｒＶａｎａ　ｍｉＲＮＡ　Ｍｉｍｉｃ，　Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　＃１、製品番号：４４６４０５８
・Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ，　ｍｉｒＶａｎａ　ｍｉＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　ｗｉｔｈ　ｐｈｅｎｏｌ，　製品番号：ＡＭ１５６０
・Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ，　ＴａｑＭａｎ　Ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡ　ＲＴ　Ｋｉｔ、製品番号：４３６６５９６
・Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ，　ＴａｑＭａｎ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｓｓａｙ，　製品番号：４４２７９７５、Ａｓｓａｙ　ＩＤ：０００４５７　（ｈａｓ－ｍｉｒ１３２－３ｐ）
・Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ，　ＴａｑＭａｎ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ　Ａｓｓａｙ，　製品番号：４４２７９７５、Ａｓｓａｙ　ＩＤ：００１９７３（Ｕ６：内部標準遺伝子）
　まず、前述のｍｉＲＮＡ封入脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）およびＰＬＧＡナノ粒子を作成した。
　また、培養細胞を準備した。細胞はＲＡＷ２６４．７（Ｐ３），１．３５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２４ｗｅｌｌプレート）、培地；ＤＭＥＭ（ＦＢＳ１０％，Ｐ／Ｓ１％）で培養した。
　前述の作成したナノ粒子を、ｍｉＲＮＡの濃度を揃えるため調整した。ＰＬＧＡナノ粒子：１ｍｇ（粉末）をＰＢＳ６０ｍｌに希釈し、脂質ナノ粒子は原液そのままを使用した。
　下記濃度に応じてｍｉＲＮＡ封入ナノ粒子またはｍｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ）を培地にアプライした。例えば、７０ｎＭ（ｍｉＲＮＡ濃度として）としたい場合、ｍｉＲＮＡの分子量を１４０００、回収率を１００％と仮定し、調整したＬＮＰ（またはＰＬＧＡナノ粒子）を培地５００μＬあたり５０μＬ添加した。Ｎａｋｅｄ　ｍｉＲＮＡの場合は１ｍｇ／ｍｌに調整したものを培地５００μＬあたり０．５μＬ添加した。
　２４時間後にＰＢＳで２回ｗａｓｈし、細胞を回収した。
　この細胞を、ｍｉＲＮＡ抽出、逆転写、リアルタイムＰＣＲにて細胞内に導入されたｍｉＲ－１３２－３ｐを、ｎａｋｅｄ　ｍｉＲＮＡ，　ｍｉｒ－ＬＮＰ，　ｍｉｒ－ＰＬＧＡ間で比較検討した（内部標準遺伝子：Ｕ６）。
　図５９に、各サンプルごとのｍｉＲ－１３２－３ｐ量の比較を示した。ｍｉＲＮＡ単独（ｎａｋｅｄ）での投与ではトランスフェクションは成立しないが、ナノＤＤＳによって用量依存的にｍｉＲＮＡのトランスフェクションが可能であった。
　［試験例３］
　（心筋虚血再灌流マウスモデルに対するｍｉＲ－１３２－３ｐ－ＬＮＰ（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）の投与）
　マウスの心筋梗塞モデルを用い、ｍｉＲ－１３２－３ｐ－ＬＮＰを投与する試験を行った。心筋梗塞モデルとしては、虚血－再灌流モデルを用いた。すなわち、いったん冠動脈をしばらく縛って虚血にし、その後血流を再開すると、再開後に活性酸素等様々な作用で心筋細胞死が起こるモデルである。臨床でいえば、心筋梗塞になって血管が詰まった後に病院に運ばれ、カテーテルで血流再開された、という状況に似せたモデルであり、心疾患の状況に対する投与の効果を検討することができる。再灌流時に対照のリポソームのみ、及びｍｉＲ－１３２含有リポソームを冠動脈から投与した。
　研究プロトコールは、九州大学医学部の動物実験倫理委員会によってレビューおよび承認され、米国生理学会のガイドラインおよび実験動物の管理と使用に関するＮＩＨガイド第８版に従って実施された。
　成体のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８～１２週齢）（ＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎ、Ｉｎｃ、東京、日本）を使用した。動物は、通常の餌と水を自由に摂取させて、１２時間の明暗サイクルの下で維持されていた。血圧と心拍数はテールカフ法（ＭＫ－２０００、室町機械株式会社、東京、日本）で測定した。マウスに挿管し、２Ｌ／分の酸素中の２％イソフルランで麻酔した。心臓は、左開胸術および心膜切除術によって露出された。
　心筋虚血は、左前下行枝（ＬＡＤ）を、ＬＡＤの横に配置されたシリコンチューブを備えた８－０ナイロン縫合糸を使用して結紮することによって誘発した。閉塞の３０分後、血流を回復するためにシリコンチューブを取り外した（再灌流）。再灌流時に、１００ｎｇのｍｉＲＮＡを含むｍｉＲＮＡ－ＬＮＰ（ｍｉｒ１３２－ＬＮＰまたはｍｉＲＮＡ－ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ－ＬＮＰ）をＰＢＳ（合計１００ｍｉｃｒｏＬ）で希釈して尾静脈から注入した。処置後、マウスは完全に回復するまで加熱ボード上に置かれた。
　マウスを２Ｌ／分の酸素中の２％イソフルランで麻酔し、再灌流の２４時間後に挿管した。左前下行枝を結紮し、２％エバンスブルー染料（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を下大静脈から注射した。次に、心臓を切除し、生理食塩水で灌流し、１ｍｍの厚さで連続した断面に切断した。切片を１％２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）と３７℃で１０分間インキュベートした後、ホルムアルデヒドに入れ、実体顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、ＨＣ－２５００）で観察した。
　ＴＴＣによる非染色ＬＶ領域を、梗塞領域と見なした。ＭＩ領域（ＴＴＣネガティブ、白）、ＡＡＲ内の非ＭＩ領域（ＴＴＣポジティブ／エバンスブルーネガティブ、赤）、非虚血領域（ＴＴＣポジティブ／エバンスブルーポジティブ、紫）、およびＡＡＲ（エバンスブルーネガティブ）とし、これらをＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．５１ｈ）を使用して定量化した。
　図６０に、心筋虚血再灌流マウスモデルに対するｍｉＲ－１３２－３ｐ－ＬＮＰ投与の顕微鏡写真図を示す。図中の左（ａ）がコントロールのＬＮＰ（すなわち、リポソームのみ）、右（ｂ）がｍｉＲ１３２－ＬＮＰ、すなわちｍｉＲ－１３２を１００ｎｇ／１００μＬの割合で含有するものを投与した図である。左（ａ）は非染色（図中の白色、明色）部位が広く、梗塞領域が多いのに対して、右（ｂ）は非染色領域が少ないことを示す。すなわち、マウスの心筋梗塞のモデルにおいて、ｍｉＲ－１３２を含有するリポソーム粒子を投与したものは心臓の梗塞・虚血領域が減少している結果が得られた。
　図６１に、染色領域の定量化の結果を示した。ｍｉＲ１３２－ＬＮＰでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＬＮＰに対して、Ｉｎｆａｒｃｔ　Ｓｉｚｅ（虚血の領域の大きさ）／Ａｒｅａ　ａｔ　ｒｉｓｋが大きく減少している結果が得られた。
　図６２に、染色領域の定量化についてＮ＝６とした場合の結果を示した。Ｎ＝６において、ｍｉＲ１３２－ＬＮＰではＩｎｆａｒｃｔ　Ｓｉｚｅ／Ａｒｅａ　ａｔ　ｒｉｓｋは有意に減少した。
　［試験例４］
　（心筋梗塞マウスモデルに対するｍｉＲ－１３２－３ｐ－ＬＮＰ（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）の投与）
　上述の心筋虚血再灌流マウスモデルと同様で、完全に冠動脈を縛り再灌流しないことで、心臓の異常がさらに重い状態（心筋梗塞に近い）を想定したモデルを用いて検討を行った。
　マウス１０週齢　（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）について、冠動脈結紮後ＬＮＰ静脈内投与、２４時間後に心臓組織（虚血部位、非虚血部位、各３０ｍｇ）を回収した。ＲＮＡ　ｌａｔｅｒ内で急速冷凍し、Ｔｉｓｓｕｅ　ｌｙｓｅｒでＲＮＡを回収した。その他の操作については、試験例３と同様に行った。
　心臓組織（虚血）と、心臓組織（非虚血）のそれぞれについてｍｉＲ１３２のＲＴ－ＰＣＲを行った。
　内因性（マウスの心臓で発現される）ｍｉＲ１３２がどれくらいかを検討した。Ｕ６遺伝子（マウスに恒常的に発現しているｍｉＲの一つ）の発現に比べて、ｍｉＲ１３２の発現がどれくらいか相対的な量を検討した。
　図６３にＲＴ－ＰＣＲによるｍｉＲ－１３２発現量の比較を示した。Ｕ６遺伝子を１とした場合の発現量比で、ｎ＝３である。心筋梗塞後２４時間で、非虚血部位（Ｎｏｎ－ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ａｒｅａ）がおよそ０．５前後であるのに対して、虚血部位（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ａｒｅａ）ではｍｉＲ１３２はおよそ６倍に増加しているという結果が得られた。ｍｉＲ－１３２非投与（Ｃｏｎｔｒｏｌ　ＬＮＰ投与）マウス冠動脈結紮２４時間後の虚血領域で、内因性のｍｉＲ－１３２の発現亢進している。急性心筋梗塞の病態生理において、内因性のｍｉＲ－１３２が保護的な役割を果たしている可能性が示唆された。
　ついで、リポソームを経静脈的に投与したときにリポソームが梗塞部位に送達できるか検討した。心筋梗塞モデルにｍｉＲ－１３２－Ｌｉｐｏｓｏｍｅ静脈内投与し、２４時間後の心臓組織において非虚血領域および虚血領域でｍｉＲ－１３２の発現量を調べることで、送達が行われるか確認した。
　図６４にリポソームを経静脈的に投与したときのＲＴ－ＰＣＲによるｍｉＲ－１３２発現量の比較を示した。Ｕ６遺伝子を１とした場合の発現量比で、ｎ＝３である。ｍｉＲ－１３２－Ｌｉｐｏｓｏｍｅと、コントロール（ＬＮＰのみ）を投与したもの、非虚血領域および虚血領域で合計４種のサンプルについて行っている。
　Ｃｏｎｔｒｏｌを投与した場合の発現量が、先のスライドの内因性ｍｉＲ１３２発現に相当すると考えられる。
　非虚血（健常）部位にも虚血部位にも、内因性ｍｉＲ１３２の１０－２０倍ほどの量のｍｉＲ１３２が認められ、経静脈的投与でｍｉＲ１３２を心筋梗塞部位に送達できることが示された。
　これらの結果から、心筋梗塞後、ｍｉＲ－１３２－Ｌｉｐｏｓｏｍｅを静脈内投与し、２４時間後の心臓組織において非虚血領域および虚血領域でｍｉＲ－１３２の送達を確認できた。Ｌｉｐｉｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅに封入して投与されたｍｉＲ－１３２が心臓組織に送達され、心筋梗塞の縮小に寄与したことが示された。
　本発明は、心筋細胞の分化の促進に高い機能を発揮し、心疾患後の心機能改善に効果を有する、心筋分化を促進するための組成物および心筋分化を促進するための医薬組成物を提供することができる。

Claims (7)

  1. 　ｍｉＲ－１３２を有効成分として含有する、心筋分化を促進するための組成物。
  2. 　粒子状である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子またはリポソームである、請求項２に記載の組成物。
  4. 　ｍｉＲ－１３２を有効成分として含有する、心疾患を治療または予防するための医薬組成物。
  5. 　粒子状である、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ナノ粒子またはリポソームである、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 　前記心疾患が心筋梗塞である、請求項４～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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