CN112698030B - 一种基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒。所述试剂盒包括：包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板、辣根过氧化物酶标记的二抗、样本稀释液、底物溶液、终止反应液和质控品。相比于原始蛋白序列，所述重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白具有抗原优势表位，亲水指数、抗原指数、表面可能性均较高，采用重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白作为新型冠状病毒的抗原，能够显著提高检测的灵敏度；同时，通过选择合适的样品稀释液、样品封闭液，并对重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白进行合理的配比，得到了准确度高、灵敏度好的新型冠状病毒酶联免疫试剂盒。

Description

一种基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒
技术领域
本发明属于病毒抗体检测技术领域，涉及一种检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其制备方法，尤其涉及一种基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其制备方法。
背景技术
冠状病毒是一类具外套膜(envelope)的单股正链RNA病毒，直径约60～220nm，广泛存在与人和其它哺乳动物之间。大多数冠状病毒感染为轻症感染，但仍有两种冠状病毒曾爆发肆虐，引起严重后果：重症急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)。新型冠状病毒(2019-nCoV)属于冠状病毒，可经呼吸道飞沫、接触等传播，具有较强的人与人传染能力，其基本再生数R0约为2.2(90％高密度区间1.4-3.8)。该病毒感染最常见的症状为发烧、咳嗽、肌痛或疲劳，所有患者均并发肺炎，胸部CT检查发现异常。部分患者在一周后出现呼吸困难，严重者病情进站迅速，数日内即可出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。新型冠状病毒肺炎诊断方法主要包括影像学、实时荧光(RT-PCR)、免疫学检测法和基因测序法。
目前，新冠肺炎的临床检测方法主要是实时荧光RT-PCR方法，其检测准确性较高，特异性较强，快速，但操作步骤复杂、周期较长、成本高，不利于基层医院开展；但该方法仍囿于阳性率低、检测环境要求高等问题，无法实现大规模筛查。因此，将呼吸道样本核酸检测和血清抗体检测同时用于新冠疑似患者筛查与诊断能够快速大规模筛查新冠肺炎。同时，血清抗体检测对实验室要求较低，方便快速，适合基层医院的大规模筛查。
血清抗体检测主要利用免疫标记检测技术，利用抗原抗体之间能够特异性结合的性质，通过检测标记在反应物上的标记物，对抗原或抗体进行定性或定量检测的方法。根据标记物的不同，可分为酶联免疫分析技术、免疫荧光技术、放射免疫测定和免疫胶体金标记技术等。
目前，国内外临床上用来检测新型冠状病毒的方法主要包括：(1)荧光PRC(RT-PCR)法，该法检测准确性较高，特异性较强，快速，但操作步骤复杂、周期较长、成本高，不利于基层医院开展；(2)免疫学检测法：通过特异性检测血清中新型冠状病毒IgG、IgM和IgA抗体，免疫学检测法是利用抗原抗体之间能够特异性结合的性质，通过检测标记在反应物上的标记物，对抗原或抗体进行定性或定量检测的方法。
根据标记物的不同，免疫学检测法可分为酶联免疫分析技术、免疫荧光技术、放射免疫测定和免疫胶体金标记技术等。其中酶联免疫方法以其操作简单快速、技术和设备要求简单，通量大，利于新型冠状病毒感染的及时防控而受到越来越多的医疗机构的青睐；化学发光法虽然灵敏度和敏感度相对其他方法有优势，但其操作仪器大，费用昂贵，仅适用与三甲等大型医院；胶体金检测方法操作简单快捷，结果清晰易辨，但灵敏度和敏感度与酶联免疫检测相比较差，适合突发事件的大批量现场检测。
因此，提供一种准确度高、灵敏度好的新型冠状病毒酶联免疫试剂盒对控制新型冠状病毒疫情具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其制备方法。所述试剂盒检测准确度高，灵敏度好且制备方法检测，适合大规模推广使用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：
包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板、辣根过氧化物酶标记的二抗、样本稀释液、底物溶液、终止反应液和质控品。
所述重组核衣壳蛋白中利用寡聚脯氨酸残基-(P)n-连接原始核衣壳蛋白的优势表位，并利用寡聚赖氨酸残基-(K)n-形成C端；
所述重组棘突蛋白中利用寡聚脯氨酸残基-(P)n-连接原始棘突蛋白S1的优势表位，并利用寡聚赖氨酸残基-(K)n-形成C端。
本发明中，使用样本稀释液对待测的血清样本进行处理后，加到包被有新型冠状病毒核衣壳蛋白和棘突蛋白的酶标板中，血清中的新型冠状病毒抗体便与抗原结合；再加入抗人IgG、IgM和IgA的酶标抗体和底物产生显色反应，用酶标仪在450nm波长下测定其吸光度。通过标准曲线计算样本中新型冠状病毒IgM抗体浓度，实现对新型冠状病毒IgG、IgM和IgA抗体的检测。
本发明使用寡聚脯氨酸残基连接这些优势表位，形成一条串联预测优势表位且易伸展弯曲的重组抗原，利于抗体对优势表位的结合，提高检测灵敏度。
以寡聚赖氨酸残基-(K)n-形成C端，由于赖氨酸残基有1个多余的氨基，便于与生物素、吖啶酯、羧基磁微粒等标记物的藕联，一方面能增大重组抗原与标记物的结合概率，同时当重组抗原通过C端寡聚赖氨酸残基与固相载体结合时，N端的抗原表位更容易与抗体接触；另一方面能够降低重组抗原中优势表位与标记物的结合概率，防止表位被标记物遮挡，导致抗体识别困难。
优选地，所述重组核衣壳蛋白包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.1为：
GGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTPPPALNTPKDHIGTRNPANNPPPGFYAEGSRGGSQA SSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDPPPLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKPPPAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPPPKLDDKDPNFKDQPPPTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQ QTVPPPLDDFSKQLQQSMSSADSTQAKKK；
其中下划线所示均为原始核衣壳蛋白的优势表位。
原始核衣壳蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。
用DNAStar Protean软件分析原始序列，其氨基酸序列18～49、138～154、170～216、230～266、273～301、338～349、362～392、400～419多位于β转角(多位于蛋白表面，易与抗体结合)，亲水指数、抗原指数、表面可能性均较高，预测为优势表位。
优选地，所述重组核衣壳蛋白的两端还连接含苯环的氨基酸残基，如苯丙氨酸F/色氨酸W/酪氨酸Y，有利于提高重组抗原的稳定性。
本发明中，还可将不同的优势表位随机排列组合，形成新的重组抗原。由于同样还有优势表位，其效果与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相近。
优选地，所述重组核衣壳蛋白中使用寡聚赖氨酸残基形成C端。
以寡聚赖氨酸残基形成C端，由于赖氨酸残基有1个多余的氨基，便于与生物素、吖啶酯、羧基磁微粒等标记物的藕联，一方面能增大重组抗原与标记物的结合概率，同时当重组抗原通过C端寡聚赖氨酸残基与固相载体结合时，N端的抗原表位更容易与抗体接触；另一方面能够降低重组抗原中优势表位与标记物的结合概率，防止表位被标记物遮挡，导致抗体识别困难。
优选地，所述重组核衣壳蛋白的两端连接含苯环的氨基酸残基(如苯丙氨酸F/色氨酸W/酪氨酸Y)，有利于提高重组抗原的稳定性。
优选地，所述重组棘突蛋白S1中使用寡聚脯氨酸残基连接原始棘突蛋白S1的优势表位。
优选地，所述重组棘突蛋白S1包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.3为：
VSGTNGTKRFDNPVLPPPASTEKSNIIPPPGTTLDSKTQPPPYHKNNKSWMEPPPLKYNENGTITPPPAWNRKRISNCPPPAPGQTGKIADYNYKLPDDFTPPPLFRKSNLKPFERDISTPPPVCGPKKSTNLVKNKCVNPPPT ESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLPPPQTQTNSPRRARSVAPPPIAVEQDKNTQEPPPILPDPSKPSKRSF IPPPLGQSKRVDFCGKPPPVPAQEKNFTTAPPPVTQRNFYEPPPYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPBVDLGDPPPAKNLNESLIDLQELGKYEQYIPPPKFDEDDSEPVLKGVKLHYTKKK；其中下划线所示均为优势表位；
原始棘突蛋白S1的序列如SEQ ID NO.4所示：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT。
用DNAStar Protean软件分析原始序列结果，其氨基酸序列70～84、93～101、107～115、145～154、277～286、352～361、410～430、455～470、524～540、553～582、675～688、770～780、805～818、1034～1045、1068～1078、1104～1111、1138～1168、1180～1210、1255～1273多位于β转角(多位于蛋白表面，易与抗体结合)，亲水指数、抗原指数、表面可能性均较高，预测为优势表位。
本发明中，还可将不同的优势表位随机排列组合，形成新的重组抗原。由于同样还有优势表位，其效果与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列相近。
优选地，所述重组棘突蛋白S1的两端连接含苯环的氨基酸残基(如苯丙氨酸F/色氨酸W/酪氨酸Y)，有利于提高重组抗原的稳定性。
作为本发明优选的技术方案，所述酶标板上重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白上的质量比为(0.25～4):1，例如可以是0.25:1、0.3:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1或4:1等，优选为(0.75～1):1，进一步优选为1:1。
本发明中，将核衣壳蛋白和棘突蛋白S1的质量比设置为(0.25～4):1，其中最优选为1:1，相比于单独使用核衣壳蛋白或棘突蛋白S1，或使用其他比例，例如分别按照按1:1、1:2、2:3、1:4、4:1、3:2和2:1配制，核衣壳蛋白和棘突蛋白S1比例为1:1时样本之间的区分度较大。
作为本发明优选的技术方案，所述辣根过氧化物酶标记的二抗包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgM抗体、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体或辣根过氧化物酶标记的抗人IgA抗体中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述辣根过氧化物酶标记的二抗为辣根过氧化物酶标记的抗人IgM抗体、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的抗人IgA抗体的组合。
本发明所述的检测试剂盒，能够单独或者同时检测三种抗体。新型冠状病毒IgG、IgM和IgA抗体联合检测虽然无法在检测结果中直接区分待测溶液中具体为哪种抗体，但是联合检测的意义在于：在感染后3～5天内的急性期，IgM抗体产生并迅速升高，是早期感染的检测指标；IgA抗体感染6天左右开始出现，14天达到峰值，随后开始下降，IgG抗体感染7天左右开始升高，可持续较长时间阳性，IgA、IgM和IgG抗体联合检测，可有效诊断，不至于出现漏检现象，防止病毒的大规模扩散。
优选地，所述底物溶液包括TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)。
作为本发明优选的技术方案，所述样本稀释液包括牛血清白蛋白、抑菌剂、蔗糖、海藻糖或阻断剂中的任意一种或至少两种的组合。
在含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中添加适量的吐温、尿素、蔗糖、海藻糖等来消除类风湿因子和结合较弱的非特异干扰；添加阻断剂来消除异嗜性抗体干扰。
本发明中，所述样本稀释液可以按质量分数计包括牛血清白蛋白0.4～0.6％(例如可以是0.42％、0.44％、0.45％、0.48％、0.5％、0.55％、0.58％或0.6％等)、抑菌剂0.01～0.05％(例如可以是0.012％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％或0.05％等)、蔗糖0.1～0.5％(例如可以是0.12％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％或0.5％等)和海藻糖0.1～0.5％(例如可以是0.12％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％或0.5％等)。
作为本发明优选的技术方案，所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品。
优选地，所述阳性质控品为含新型冠状病毒抗体的缓冲液。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
制备包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板；
将所述酶标板、辣根过氧化物酶标记的二抗、样本稀释液、底物溶液、终止反应液和质控品分别进行包装，得到所述试剂盒。
作为本发明优选的技术方案，所述包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板的制备方法具体包括：
采用包被液分别稀释新型冠状病毒的重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白，再按(0.25～4):1的质量比将重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白转移至酶标板上，而后使用封闭液封闭，得到所述包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板。
其中，封闭液的配制方法为：将2～5％(例如可以是2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％等)的脱脂奶粉或者1～5％(例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％等)牛血清白蛋白BSA加入PBS缓冲溶液中，配制成封闭液。
第三方面，本发明还提供一种如第一方面所述的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：
(1)使用样本稀释液对待测样本进行稀释；
(2)将所述稀释后的待测样本转移至包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板上，孵育；
(3)在所述孵育结束后，洗涤所述酶标板，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育，洗涤；
(4)加入底物溶液，避光孵育后加入终止反应液，测量吸光度，得到检测结果。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述孵育的时间为20～30min，例如可以是20min、22min、24min、25min、26min、28min或30min等，温度为35～37℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃或37℃等。
优选地，步骤(3)所述孵育的时间为20～30min，例如可以是20min、22min、24min、25min、26min、28min或30min等，温度为35～37℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃或37℃等。
优选地，步骤(4)所述孵育的时间为8～12min，例如可以是8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min或12min等，温度为35～37℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃或37℃等。
优选地，所述检测结果中指数I≥1.0，则待测样本为阳性；所述检测结果中指数I<1.0，则待测样本为阴性。
其中，指数I用于判定待测样本中是否含有新型冠状病毒抗体；指数(I)的计算步骤：
1)计算两次阳性质控品OD的平均值及两次阴性质控品OD的平均值。
2)计算待测样本的指数(I)：
待测样本的指数I＝待测样本OD/(阳性质控品OD的平均值×0.5+阴性质控品OD的平均值)。
此外，为保证检测结果的可靠性，需对检测过程进行质量控制，具体为：
每次实验均需同时检测阳性质控品和阴性质控品；阳性质控品的I值应在1.2～2.5，阴性质控品的I值应小于等于0.4；如果该质控项目的测量结果超出了质控范围，必须重复检测。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒，采用重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白作为新型冠状病毒的抗原，所述重组蛋白具有原始蛋白序列的优势表位，亲水指数、抗原指数、表面可能性均较高，能够显著提高检测的灵敏度；
(2)本发明所述的试剂盒基于酶联免疫法设计得到，因此其制备方法简单，操作便捷，技术和设备要求简单，通量大；同时，通过选择合适的样品稀释液、样品封闭液，并对重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白进行合理的配比，得到了准确度高、灵敏度好的新型冠状病毒酶联免疫试剂盒。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，若无特殊说明，采用的技术手段和实验方法均为本领域常规的实验方法和技术手段，所用的试剂和耗材均购自常规生产厂商或采用常规方法制备得到。
实施例1
本实施例提供一种基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒。所述试剂盒包括：
包被新型冠状病毒(2019-nCoV)重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋的酶标板；
辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，辣根过氧化物酶标记的抗人IgM抗体，以及辣根过氧化物酶标记的抗人IgA抗体；
浓缩洗液(20×)、含BSA的磷酸盐缓冲液、底物溶液、终止液、阴性质控、阳性质控、酶标板黏胶膜。
其中，重组核衣壳蛋白的序列为SEQ ID NO.1：
重组棘突蛋白S1的序列为SEQ ID NO.3；
样本稀释液的配方为：
0.01M的PBS、质量分数为0.5％的牛血清白蛋白、质量分数为0.05％的抑菌剂proclin 300、质量分数为0.1％蔗糖、质量分数为0.1％海藻糖。
所述酶标板的制备包括如下步骤：
(1)包被液的配制：采用pH为8.0的0.1M PBS缓冲溶液将新型冠状病毒的核衣壳蛋白和棘突蛋白分别稀释10ng/100μL：
(2)包被液的优化：采用磷酸盐缓冲溶液将新型冠状病毒的核衣壳蛋白和棘突蛋白分别按1:1、1:2、2:3、1:4、4:1、3:2、2:1配制，最终确定的比例为1:1；
(3)将配制的核衣壳蛋白和棘突蛋白S1分别按质量浓度1:1的比例配置包被液包被酶标板，封闭后得到包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板。
实施例2
本实施例提供一种利用实施例1所述的试剂盒的使用方法。具体包括如下步骤：
(1)在实验开始前，先将试剂盒取出，置于25℃下30分钟；
(2)打开装有酶标板的密封袋，将暂不用的板条放回密封袋内封好，保存在4℃的条件下；
(3)配制工作洗涤液：浓缩洗液稀释20倍(即1份浓缩洗液加19份的无菌去离子水)，此时，若浓缩洗液出现结晶，需使用30℃水浴溶解后使用；
(4)样本稀释：待测样本用样本稀释液稀释200倍(1份样本加199份样本稀释液)；
(5)向酶标板孔依次加入阴性质控品(重复2个孔)、阳性质控品(重复2个孔)和稀释后的样本各100μL。
(6)贴上封板膜，样品于37℃条件下孵育25min。
(7)洗涤：揭开封板膜，洗涤酶标板。每孔每次加入不少于300μL的洗涤液，静置40s后将酶标板孔内液体除去，在吸水纸上反复拍打去除残留液体，重复上述洗涤操作，共洗涤3次；
(8)每孔加入100μL酶标抗体；
(9)贴上封板膜，在37℃条件下孵育25min。
(10)洗涤，在每孔中加入底物溶液100μL，在37℃条件下避光孵育10min；
(11)于每孔内加入50μL反应终止液，加样顺序与加入底物溶液顺序相同；
混匀后，在5分钟内于450nm波长处读吸光度值(参考波长为620/630nm)。
使用本实施例中提供的方法能够对待测样本进行更准确的检测，避免由于实验手段的不同导致结果的重复性较差。
试验例1
本试验例提供基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒。
与实施例1的区别在于，重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白S1的质量比分别设置为1:2、2:3、1:4、4:1、3:2、2:1；
检测区分度，结果如表1所示：
表1
Figure BDA0002828529370000141
由上表可知，重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白S1比例为1:1时样本区分度较大，故选择核衣壳蛋白和棘突蛋白S1比例为1:1。
对比例1
与实施例1的区别在于，其中将重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的替换为原始的核衣壳蛋白和棘突蛋白，其余组分及制备方法保持不变。
对比例2
与实施例1的区别在于，其中样本稀释液为0.01M的PBS，其余组分及制备方法保持不变。
试验例2：检测限评估
取1份效价为1:1100阳性血浆，将上述阳性血浆用阴性血浆分别稀释成覆盖临界值附近的样品(临界值为I＝0.5)，每个梯度的稀释液重复3份，每份稀释液用3批试剂盒各重复检测20次。
计算每份稀释液的阳性检出率，筛选阳性检出率在90～95％范围内的待测抗体效价水平作为最低检测限。试验结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002828529370000151
Figure BDA0002828529370000161
Figure BDA0002828529370000171
从上表试验结果可知，当梯度稀释样品的效价为1:220时，阳性检出率大于98％，而效价为1:183和1:157时，检测结果均较差，此外，通过合理设置效价可得，当效价为1:205时，在90～95％范围内，故将检测效价为1:205作为最低检测限。
试验例3：精密度评估
取3批试剂分别检测参考品，重复10次，严格按照实施例2中所述的检测方法进行操作，分别计算其批内和批间精密度。同时对比原始蛋白序列制备的试剂盒与本试剂盒结果，检测结果如表3所示：
表3
Figure BDA0002828529370000181
从上表结果可以看出，本发明提供的检测试剂盒精密度的批内精度为3.0％～4.6％，批间精密度可达3.9％，符合检测试剂盒的要求。与原始蛋白制备的试剂盒相比，重组蛋白制备的试剂盒性能更优异。
综上所述，本发明提供的基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒，制备方法简单，操作便捷，技术和设备要求简单，通量大；同时，采用重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白作为新型冠状病毒的抗原，显著提高了检测的灵敏度和准确性。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 丹娜（天津）生物科技股份有限公司
<120> 一种基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒
<130> 20201202
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 1
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Pro Pro Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 2
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His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
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165 170 175
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Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
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<210> 3
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 4
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Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
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210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
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Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
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385 390 395 400
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Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270

Claims (9)

1.一种基于酶联免疫法检测新型冠状病毒抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板、辣根过氧化物酶标记的二抗、样本稀释液、底物溶液、终止反应液和质控品；
所述重组核衣壳蛋白中利用寡聚脯氨酸残基连接原始核衣壳蛋白的优势表位，并利用寡聚赖氨酸残基形成C端；
所述重组棘突蛋白中利用寡聚脯氨酸残基连接原始棘突蛋白S1的优势表位，并利用寡聚赖氨酸残基形成C端；
所述重组核衣壳蛋白为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
所述重组棘突蛋白为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标板上重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的质量比为(0.25~4):1。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物溶液包括TMB；
所述辣根过氧化物酶标记的二抗包括辣根过氧化物酶标记的抗人IgM抗体、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体或辣根过氧化物酶标记的抗人IgA抗体中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液包括牛血清白蛋白、抑菌剂、蔗糖、海藻糖或阻断剂中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品；
其中，所述阳性质控品为含新型冠状病毒抗体的缓冲液。
6.一种如权利要求1~5任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
制备包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板；
将所述酶标板、辣根过氧化物酶标记的二抗、样本稀释液、底物溶液、终止反应液和质控品分别进行包装，得到所述试剂盒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板的制备方法具体包括：
采用包被液分别稀释新型冠状病毒的重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白，再按(1~3):1的质量比将重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白转移至酶标板上，而后使用封闭液封闭，得到所述包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板。
8.一种如权利要求1~5任一项所述的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：
（1）使用样本稀释液对待测样本进行稀释；
（2）将所述稀释后的待测样本转移至包被新型冠状病毒重组核衣壳蛋白和重组棘突蛋白的酶标板上，孵育；
（3）在所述孵育结束后，洗涤所述酶标板，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育，洗涤；
（4）加入底物溶液，避光孵育后加入终止反应液，测量吸光度，得到检测结果。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于，步骤（2）所述孵育的时间为20~30min，温度为35~37℃；
步骤（3）所述孵育的时间为20~30 min，温度为35~37℃；
步骤（4）所述孵育的时间为8~12 min，温度为35~37℃；
所述检测结果中指数I≥1.0，则待测样本为阳性；所述检测结果中指数I<1.0，则待测样本为阴性。
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