JPH02503228A

JPH02503228A - イムノグロブリンのアッセイ方法

Info

Publication number: JPH02503228A
Application number: JP63502841A
Authority: JP
Inventors: モーテイマー，フイリツプ・ポール; パリー，ジヨン・ビクター
Original assignee: ザ・パブリツク・ヘルス・ラボラタリイ・サーヴイス・ボード
Priority date: 1987-04-02
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1990-10-04
Also published as: WO1988007680A1; EP0355099A1; EP0355099B2; DE3882705T3; DE3882705T2; EP0355099B1; GB8707839D0; DE3882705D1; ATE92189T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】イムノグロブリンのアッセイ　゛本発明は体液中のイムノグロブリンをアッセイする方法に係わる０本発明はより特定的には、体液中の特異的１ｇＭ、ｔｉｃ又はＩｇ＾の存在又は量を定性的又は定量的に測定する方法を提供する。

多くの微生物感染、特にウィルスによる感染の診断と、検査に基づいて行われる。血清は血液を凝固させた時に残る液体であり、イムノグロブリンと称するタンパク質を豊富に含む、このタンパク質は特定の微生物による感染に反応して産生され、その微生物に対して著しい特異性を示す。

この場合のイムノグロブリンは抗体である。微生物感染に暴露すると最初の２〜３週間で特異的抗体の濃度が急速に高まる。感染に対する最初の反応は通常、特定種類のイムノグロブリン（ＩｇＭ＞に見られるが、この種類の抗体は産生が短期間であるため、感染が発生して間もない頃にしか存在しない、従って、この抗体は診断上のサインとして使用することができ、ある範囲のウィルス性その他の５染でこのようなサインとして使用されている。

感染してから少したつと、別の種類のイムノグロブリン（ＩｇＧ）が形成される。このｔｇｃ抗体は、特異性はＩＢＭ抗体と同程度であるが持続性がより長く、多くのウィルス感染において一生存続する。従ってＩｇＧ抗体は、この抗体が特異的に反応するウィルスによる感染又は該ウィルスに対する免疫性を示すサインであり、この抗体が存在しなければ前記ウィルスに対する感受性があることになる。特異的ＩＢＭ抗体及びｔｇｃ抗体の測定によって通常診断される感染には、風疹、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヒトパルボウイルスＢ１９、はしか、おたふくかぜ、サイトメガロウィルス及び水痘があル、エイス（ＡＩＤＳ）ヲ起コスウイルス（例えばＩＩＩＶ、　ＩＩＴＬＶ　ＩＩＩ又はＬＡＹ）及び他のレトロウィルス、例えばＩＩＴＬＶ　Ｉに関しても、ＩＢＭ及びＩｇＧ抗体の検査が益々望ましいものになってきている。

場合によっては、別の種類の特異的イムノグロブリンＩｇ＾の検査を行うことも望ましいが、これは通常、診断又はアッセイ法としての適性に劣る。特異的１ｇＧ及びＩｇＭの存在を調べる検査は現在のところ、血清、即ちＩｇＣ及びＩｇＭを極めて高い濃度で含む体液を用いて行われている。適当な血清検査は例えばＪ、　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１９（１９８６）、ｐ、３８７−３９７に記載されている。残念なことに、血清は静脈穿刺を行わないと採取できない、これは簡便な方法ではなく、特に子供及び神経質な成人には適用できないこともある。エイズウィルスの検査の場合は、静脈穿刺に対する偏見が広まっているだけに不都合である。静脈穿刺はまた、殺菌した針、注射器、スキンクレンザ− 及び包帯を必要とするためコストがかなり高く、場合によっては危険及び困難を伴う。

特異的イムノグロブリンは他の体液中にも存在することが知られている。これらの体液には血清より遥かに採取し易いもの、例えば唾液、涙、精液、尿及び脳を髄液がある。

これらの体液中のＩｇＣ及びＩｇＭ濃度は血清中の濃度より遥かに低く、例えば血清中濃度の約０．０１及び０．００１である。

唾液は通常、これらの体液の中で最も採取し易いものの１つである。

唾液中のイムノグロブリンの特定、及び該イムノグロブリンのアッセイ方法に関しては、これまでにも成る程度の研究が行われてきた。この研究の多くは一般的性質のものであった０例えば、０ｒａ１．Ｓｕｒｇ、０ｒａｌ　Ｍｅｃ！１ｃｉｎｅ　０ｒａｌ　Ｐａｔｈｏｌ（ＵＳ）　、　＜１９８５）　、６０（４）　、ｐ、３７２−３７６、Ｊ−１ｍｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｂ、（１９８３）。

ラー７（１−３）ｐ、５１−７及びＩｎｖｅｓｔ、Ｏｐｔｈｉｍｏｌ　Ｖｉｓｕａｌ’　Ｓｃｉ、（１９８６）２ニ２−（４）　、ｐ、６２２−５は、唾液中に全種想（Ｉｇ＾、１ｇｃ及びＩｇＭ）が存在することを明らかにしている。

Ｊ−１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１９８４）、７１，２０３−１０には、特異的大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｂｉａ　ｃｏｌｉ）抗原を基質上に付着させ、これを血清に暴露することによって、血清中の抗大腸菌１ｇＧ及びＩｇＮ抗体の存在を検出する方法が記載されている。この参考文献は、この方法が唾液中の前記抗体の検査にも使用できるのではないかと推測しているが、それを実験的に証明することはしていない。

Ｊ−１ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＵＳ）　（１９８７年４月）、１５５（４）　、ｐ、７９３−７９６及び（１９８５）　、独２（６）ｊｐ、１２３８− ４４には、唾液中のＩｇ＾をアッセイする試みが記述されている。この１９８７年の参考文献では、形成された免疫沈降物のゲルクロマトグラフィーを行うという、研究用には適しているが臨床的ルーチンワークには不向きな方法が使用されている。　１９８５年の文献では、特異的ポリオウィルス抗原を基質上に固定して、特異的１ｇ八を捕捉する試みがなされている。これらの文献のどちらにも、最初に試料の遠心分離を行う必要があるという記述が見られる。

イムノグロブリンのアッセイで使用される主なイムノグロブリン、即ちｔｇｃ及びＩＢＭは、唾液中には、唾液中！８八濃度の約０．３％しか存在せず、従って前記方法はいずれも唾液中のｔｇｃもしくはＩｇＭのアッセイ、又はＩｇＧもしく！８Ｍ濃度の低い他の体液中のこれらイムノグロブリンのアッセイには有効ではないと考えられる。実際、特異的１ｇＧ及びＩＢＭに関して現在使用されている検査又はアッセイはいずれも、信顆性に欠ける。これまでのところ、前述のごとき体液中のＩｇＧ又はＩｇＭのアッセイを遠心分離又は濃縮等の厄介な前処理を行わずに実施するのに適した方法はまだ開発されていない。

本発明の目的は、採取の容易な体液、特に唾液中の特異的イムノグロブリンを定性的及び定量的に検査（アッセイ）する方法を提供することにある。

そこで本発明では、唾液、涙、精液、尿及び脳を髄液から選択したヒト又は動物の体液中に存在する任意の又は総ての種類の特異的イムノグロブリンをアッセイする方法であって、（１）１種類又はそれ以上のイムノグロブリンに対する抗体を固体基質上に固定し、（ｉｉ＞固定した抗体を体液試料に暴露して、その体液中に存在する任意のイムノグロブリンの一部分を前記固定抗体に結合させ、次いで、（ａ）結合したイムノグロブリンを選択標識抗原に暴露して、この標識抗原を前記結合イムノグロブリンの少なくとも一部分に結合させるか、又はて、この抗原を前記結合イムノグロブリンの少なくとも一部分に結合させ、次いで前記選択抗原に対する特異性をもつ標識抗体を前記結合抗原の少なくとも一部分に直接的又は間接的に結合させ、（１ｉｉ）その後、前記標識抗原又は抗体の特性を検出し及び／又は測定するステップを含む方法を提供する。

「標ＩＩ　（Ｉａｂｅ　Ｉ　１ｅｄ）Ｊという用語は、検出可能な及び／又は測定し得る特性を有する抗原又は抗体を意味する。この特性は公知の抗原又は抗体に存在し得、あるいは抗原又は抗体に化学的又は物理的に付与し得るものである。標識の方法及び適当な標識は良く知られており、任意の適当な標識を使用し得る。適当な標識としては、放射性、酵素性、蛍光性又は発光性の標識、表面プラスモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ＝ＳＰＲ）、又は何等かの検出可能な特性を有するラテックスもしくはゼラチンのような小粒子への付着が挙げられる。

［選択抗原（ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、それに対して体液中の特異的イムノグロブリンの存在が示されることが望まれる抗原のことである。

本発明の方法では、標識抗原又は抗体の検出可能な及び／又は測定可能な特性が体液中の特異的イムノグロブリン仝の存在及び／又は量に、定性的又は定量的に関連し得る。

本発明の方法の重要な因子の１つは、アッセイの可能性が体液中の特異的イムノグロブリンの絶対濃度には余り依存せず、結合した抗体に特異的なイムノグロブリン全体の割合に依存することにある。

本発明の方法を使用すれば、体液中の特異的イムノグロブリンの存在及び／又は量を、その特異的イムノグロブリンが比較的少量しか存在しない場合でも検出及び／又は測定することができる０体液としては、採取し易いという理由から唾液が好ましい。

本発明の方法を用いれば、多くのｂト及び／又は動物イムノグロブリン、例えば肝炎（Ａ型及びＢ型）、風疹、はしか、ヒトパルボウイルスＢ１９、おたふくかぜ、水痘（ｖＺウィルス）及びエイズ（ＢＪν、ＬＡＹ又はＨＴＬＶ　ＩＩＩ）を起こすウィルスに反応して産生されるイムノグロブリンをアッセイすることができる０本発明の方法はあらゆる種類のイムノグロブリン、例えばＩｇ＾、ＩｇＭ及びＩｇｃに適しているが、好まし及びＩｇＣが感染又は免疫性の検出に最も有用なイムノグロブリンだからである。

本発明の方法のステップ（ｉ）で使用し得る、イムノグロブリンに対してクラス特異的な抗体及び非クラス特異的抗体は公知であり、市販のものを使用するか又は例えばモノクローナル法のような公知の方法を用いて製造し得る。適当な具体例としては、公知のＩｇｃ抗体、抗１１Ｍ抗体及び抗１ｇ＾抗体、例えばＩｇＣ，ＩｇＭ及びＩｇＭ中に夫々存在するイムノグロブリンγ鎖、μ鎖又はα鎖に対して特異的な抗体が挙げられる。

この抗体は、例えば該抗体の適当な希釈度及びｐＨの溶液中に基質を浸漬するといった公知の方法を用いて基質に結合させ得る。　ｐＨは例えば、ＮａｚＣＯｓ／Ｎａ［１ＣＯ３のような公知のバッファを用いて、７〜１１、特に９〜１ｏにし得る。抗体溶液は市販されており、適当な希釈度は市販抗体溶液の場合１　：２００〜１：４０００である。適当な基質としては、例えばビーズ形態又は微量滴定圧もしくは他の小皿形態のポリスチレンが挙げられる。

アッセイ用の体液試料は当業者に公知の一般的方法によって採取し得る。好ましい体液たる唾液の場合には、被験者にスポンジ又は主線のロールを噛ませ、その後そのロールを圧縮するか又は遠心分離にかけて清澄な唾液を回収するのが好ましい、従って通常は、アッセイ方法を使用する前にイムノグロブリンを濃縮するか又は唾液を更に遠心分離する必要がない。

結合した抗体を支持する基質は、次いで、唾液のような体液試料に＆露し得る。

この試料は必要であればバッファで適当な濃度に希釈し得、又は希釈しないで使用してもよい、非限定的具体例として、この体液は通常バッファ中１＝２〜１：２０で希釈し得る。一般的な被検出イムノグロブリン、例えば風疹、はしか、おたふくかぜ、Ａ型もしくはＢ型肝炎、エイズ（即ち旧Ｖ）の感染に反応して産生されるＩｇＣ又はＩｇＭを検出する場合には、唾液試料をバッファにより１：２〜１：１０の範囲で希釈するのが通常適当である。適当なバッファとしては、０．０６〜０．１０重量％のアジ化ナトリウムと０．０５〜０．１５重量％のＴｗｅｅｎ　２０（商標）と５〜１５重量％のウシ胎児血清（Ｆｅ２）とを含むリン＊ＵＷ溶液（ＰＢＳ）が挙げられる。暴露条件、例えば時間、温度等は、体液、アッセイすべきイムノグロブリン、結合抗体、基質等に応じて決定するが、アッセイ方法を臨床検査及びスクリーニングで使用し易くするために、所要時間は十分に短くすることができる０例えば、前述のごとき一般的イムノグロプリンを検出する場合には、希釈した又希釈しない唾液のような体液試料を通常３７℃で約１〜３時間インキュベートするのが適当である０次いで、過剰な体液溶液を例えばＴｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液で洗い流す。

本発明の方法の択一的ステップ（ａ）を使用する場合には、次いで結合物質を標識抗原、例えば前記した１種票以上のウィルスの放射性標識又は酵素標識した抗原の溶液に暴露し得る。これらの標識抗原は公知の方法（例えばＳｅｈｍｉｔｚ等によりＪ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ　５０（１９８０）に記載されている方法）で製造するか、又は市販のものを使用し得る。

ステップ（ａ）では通常、できるだけ純粋な形態の抗原を使用するのが好ましい、これは、抗原以外の物質、例えば該抗原の製造に使用した培地に残る残渣が結合イムノグロブリンに結合する可能性を回避するためである。

本発明の方法の択一的ステップ（ａ）で使用する標識抗原の好ましい形態の１つは、抗原でコーティングした小粒子粒子が放射能又は特に色彩のような検出可能な特性を有していれば、結合したイムノグロブリンへの粒子の結合を容易に観察し及び／又は測定することができる。

前記粒子を例えば赤又は青のような認識しやすい色に着色すれば、基質がプレートのウェルの表面からなる場合には、これらの粒子の結合によって生じる色彩の強さを観察することによって粒子の相対的結合度を測定することができる。あるいは、表面への粒子の結合が重力によって阻止されるように表面を形成するか又は配置すれば、例えば裸眼で又は票微鏡を用いて、粒子がプレートの下方部分にどの程度沈澱するかを観察することができる。

このような着色粒子の使用は放射能検出器のような高度の検出装置を必要としないため、当該分野での使用又は比較的未熟な医療スタッフによる使用に特に適している。

択一的ステップ（ｂ）は、必ずしもステップ（ａ）はど純粋な抗原を使用する必要がないため、特に好ましい、このステップを使用する場合は、結合した物質を非標識抗原、例えば前記した１種類以上のウィルスの抗原に暴露する。暴露条件は使用する抗原等に応じて異なるが、前述のごとく、臨床的使用を容易にするような条件にし得る０通常は、市販の抗原溶液を前述のごとく必要に応じてバッファで希釈して使用し得る。このバッファは正常な（即ち、検出すべき特異的抗体が存在しない）ヒト血清も例えば０〜５％含み得る。

非標識抗原に暴露した後は、過剰抗原溶液を例えば前述のごときバッファ溶液で洗い流す。

結合抗原への標識抗体の結合は直接的であってよく、例えば結合抗原を溶液状の標識抗体に直接暴露させることによって実施し得る。結合抗原への標識抗体の結合は間接的であってもよく、例えば結合抗原に対する更に別の抗体、例えば抗風疹モノクローナル抗体をその暴露によって結合抗原に結合し、この別の抗体に標識抗体を暴露することによって実施し得る。

放射性標識抗体を結合抗原又は別の抗体に結合させる操作は、結合抗原又は別の抗体を放射性標識抗体の溶液に暴露することによって冥施し得る。

前記溶液としては、市販の放射性標識抗体溶液を必要に応じてバッファで希釈したもの、例えばＰＢＳと、０．１５〜０．２５％のＴｗｅｅｎ　２０と、５〜１５％のＦＣＳと、０〜１５％の正常ウサギ血清（ＮＲＳ）と、０〜１０％の正常ヤギ血清（ＮにＳ）と、０〜５０％の正常ヒト血清（ＮＨＳ）とを含むバッファで希釈したものを使用し得る。未結合の放射性標識を含む過剰溶液は洗い流す。

適当な放射性標識としては、＋２ｓ１．３２ｐ、　３Ｈ及び２％５が挙げられる。これらの標識は公知の方法、例えば５ａｌｉｅｉｎｓｋｉ等によりＪ、Ｅｎｄｏｒｉｎｏｌｏｇｙ　８Ｈ１９７９）に記載されている方法によって抗体分子中に導入し得る。

放射性標識を使用する場合には、標識物質の放射能を通常の方法で測定する。

酵素標識抗体を結合抗原又は別の抗体に結合する操作も、結合抗原又は別の抗体を酵素標識抗体の溶液に暴露することによって実施し得る０通常は、市販の抗体 −酵素結合体を必要に応じバッファで希釈して使用し得る。バッファとしては例えば、ＰＢＳと、０〜５０％のＦＣＳと、０．５〜１５％のＮＨＳと、０〜１０％の正常ウサギ血清（ＮＨＳ）と、０−０．３％のＴｗｅｅｎ２０とを含むものを使用する。

次いで、未結合の酵素標識抗体を含む過剰溶液を例えばＰＢＳとＴｗｅｅｎ　２０とからなるバッファで洗い流す。

適当な酵素標識としては、ペルオキシダーゼ酵素、例えばホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＩＩＲＰＯ）及びホスファターゼ酵素が挙げられる。市販のものがない場合には、公知の方法で抗体−酵素結合体を製造し得る。

体液を含む試料に結合抗体を暴露するステップ以降（このステップを含む）のステップの一部は同時に実施し得る。

択一的ステップ（ａ）又は（ｂ）で酵素標識を使用した場合には、例えば結合した酵素標識に反応を触媒させることによって、標識物質の酵素活性を測定し得る。前記反応は、過程が定量的に測定され得且つ存在する結合標識の量に関係し得るような反応である。好ましい反応は、その後で例えば吸光化合物の形成又は消失が測光的に（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃａｌ　ｌｙ）生じるような反応である。

この種の方法は当業者には公知である。

ステップ（ａ）及び（ｂ）のいずれを使用しても、標識の形態に係わりなく、アッセイ又は例えば結合着色粒子の色彩の観察によって得られる放射能、酵素活性等の結果は、通常のデータ処理法で処理し得る０例えば、ある特定の体液試料のアッセイの結果を、特異的イムノグロブリンを全く含まないことがわかっている標準的陰性試料と比較するか、又は特異的イムノグロブリンを何単位か含むことがわかっている一組の陽性試料と比較し得る。適当な処理方法は当業者には良く知られている。

本発明を実際に使用する時は、例えばステップ（ｉ）の抗体、ステップ（ｉ　ｉ）ａの選択標識抗体、ステップ（ｉｉ）ｂの選択抗原、ステップ（ｉ　ｉ）ｂの標識抗体のような必要試薬の試料を含むキットを使用し得る。このキットは更に、ステップ（ｉｉｉ）の結果、例えばステップ（ｊｉ）ａで着色粒子を使用した場合の基質の様相を解説するためのチャートも含み得る。

試薬等は前述のごとく適当に希釈してキットに組込み得、このキットはステップ（ｉ）の抗体固定が既に行われた状態の基質を含み得る。

尚、本明細書中の１：ｎという希釈度（例えば１：１Ｇ００等）は、１倍容の液体を希釈剤によってｎ倍容にすることを意味する。

以下、添付図面に基づき、非限定的実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。

第１図〜第４図は本発明の方法を使用して行ったＩｇＧアッセイと、血清を用いる公知の方法に従って行った同アッセイとの比較を示すグラフである。

第５図は２人の被験者のＡ型肝炎に反応して産生された唾液中１１Ｍのアッセイを示すグラフである。

第６図及び第７図は２人の被験者Ｃ及びＫのＡ型肝炎に反応して産生された唾液中１１Ｍアッセイに対する種々の希釈度の効果を示すグラフである。

第８図ははしかに反応して産生された唾液中１ｇＭの検査：陰性の比率を感染発生後の日数に対してプロットしたグラフである。

第９図はおたふくかぜに反応して産生された唾液中１１Ｍのアッセイを示すグラフである。

以下の実施例中、アッセイ実施例１．２．３．４及び５は唾液試料中のＩｇＧのアッセイに係わり、アッセイ実施例６及び７は唾液中１１Ｍのアッセイに係わる。実施例５及び７では選択的ステップ（ａ）の方法を使用し、残りの実施河では選択的ステップ（ｂ）の方法を使用する。また、本発明の医学的実施を説明するために臨床実施例も４つ示した。

尚、以下の説明文中で使用されている下記の用語は商標である：Ｄａｋｏ＋　Ｐｅｎｔａｗａｓｂ＋　５ｔｅｒｉｌｉｎ＋　Ｔｗｅｅｎ＋　Ｅｌａｖｉａ。

ッセ　　　　　１１　の　Ｐ５ＩＣ−ジ　　ムノア・・セイｌｌ：ＡｃＲＩ＾エン　イムイムノ　ッセイ　ＣＡＣＥＬＩＳ＾１、コーティングバッファ（０，０ＩＭ炭酸ナトリウム、０．０ＩＭ重炭酸ナトリウムバッファ、ｐＨ９，６）で希釈した１／１０００Ｄａｋ。

抗ｒｇｃ（γ鎖）中への浸漬によってポリスチレンビーズをコーティングする。

２．０．０８％のアジ化ナトリウムと０．１％のＴｗｅｅｎ　２０と１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）とを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いて各唾液試料の１７２希釈物を調製する。

３、前記試料を、抗１１Ｇでコーティングしたビーズと共に３７℃で３時間インキュベートする。

４　、　Ｐｅｎｔａｗａｓｂシステム（＾ｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、０．１％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で前記ビーズを４回洗浄する。風疹Ｈ＾抗Ｊｉ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ−ａｇｅｎｔｓ　＆　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＣＰＨＬによって製造されたもの。

尚、このＨ＾抗原の濃度はバッチ毎に変化させ得る）の１７１２希釈物を加える。この抗原は０．１％のＴｗｅｅｎ　２０と１０％のＦＣＳとを含むＰＢＳで希釈する。室温で一晩インキユベートする。

Ａ、−ジ　　ムノ　・・セ５、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄し、０．１％のＴｗｅｅｎ　２０（Ｔ２Ｏ）と１０％のＦＣＳと５％の正常ウサギ血清（ＮＲＳ）と２％の正常ヒト血清（ＮＨＳ）とを含むＰＢＳで希釈した抗風疹モノクローナル抗体腹水（１１５０，０００）と共に３７℃で２時間インキュベートする。

６、ＰＢＳＴ中で４回洗浄し、０．２％のＴ２゜と１０％のＦＣＳと５％のＮＲＳと５％の正常ヤギ血清（Ｎ（：Ｓ）と２％のＮｌ’ｌＳとを含むＰＢＳ中の１２％１＠識抗ネズミＩｇＧ（１９０ｐｌの希釈剤中で毎分１０’カウント）を加える。３７℃で２時間インキュベートする。

７、これらのピース−をＰＢＳＴ中で４回洗浄し、へｂｏｔｔ管に移し、結合放射能をγ計数器で５分間測定する。

Ｂ、エン　イムイムノアッセイ１〜４は前述の通り。

５、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄する。５％のＦＣＳと１％のＮＨＳと１％のＮＲＳと０．１％のＴｗｅｅｎ　２０とを含むＰＢＳ（アジ化物は含まない）中に１：５０又は１：１００で希釈したＨＲＰＯ結合モノクローナル抗風疹を加える。室温で３時間インキュベートする。

６、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄し、プラスチック管に移す、２４ｈｌの基質、即ちオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）を前記１：１００希釈物に加え、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を前記１：５０希釈物に加える。室温で４５分間インキュベートする。　１ｏｏｕｌの４Ｎ　１１．ｓＯ，で反応を停止させる。

７、各試料１５ｈｌ及びブランクを移す、　４９２ｎｍ（ＯＰＤ）及び４５０ｎｍ（ＴＭＢ）での光学密度（０，Ｄ）を読取る。

・・セイ　　　　２・　のＡ　　二ＩＧ　　−ジ　イムノ　・・セイにＡＣＲＩ＾エン　イムイムノアッセイ　［：ＡＣＥＬＩＳ＾１、コーティングバッファ（０，０ＩＭ炭酸ナトリウム、０．０ＩＭ重炭酸ナトリウムバッファ、ｐＨ９，６）で希釈した１／１０００抗ＩｇＣ（ＤＡＫＯ１γ鎖）中への浸漬によってポリスチレンビーズをコーティングする。

２、ｏ、ｏｓ％のアジ化ナトリウムと０．１％のＴｗｅｅｎ　２０と１０％のウシ胎児血清とを含むリンＦａＭＷｉ溶液（ＰＢＳ）を用いて各唾液試料の１７１０希釈物を調製する。

３、前記試料を、抗！８Ｇでコーティングしたビーズと共に３７℃で３時間インキュベートする。

Ａ、−ジ　イムノア・・セイ４　、　Ｐｅｎｔａｗａｓｂシステム（＾ｂｏｌｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳＴ）中で前記ビーズを４回洗浄する。０．１％のＴｗｅｅｎ　２０（７２０）と１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）と１％の正常ヒト血清（ＮＨＳ）とを含むＰＢＳで１＝２５に希釈したＡ型肝炎抗原（ＨＡＶ　Ａｇ）希釈物を加える。室温で一晩インキユベートする。

５、前記ビｉズをＰＢＳＴ中で４回洗浄し、０．２％のＴ２゜と５０％ノＦＣ８と１０％＜７）　ＮＨＳと５％ノＮＲ，Ｓとを含ｔｒ　ＰＢＳ中ノ１２　％　ｌ標識ヒト抗ＢＡＶ（１９０ｕｌの希釈剤中で毎分１０’カウント）と共に３７℃ で３時間インキュベートする。

６、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄し、計数管に移し、結合放射能をγ計数器で５分間測定する。

Ｂ、エン　　　ム　　ム　　　　・・　セ１〜３は前述の通り。

４　、　ＰｅｎＬａｗａｓｈシステム（＾ｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ＰＢＳＴ中で前記ビーズを４回洗浄する。０．１％のＴ２゜と１０％のＦＣＳと１％ノＮＨＳトを含ｔｊＰＢＳテｌ：１５４，１ｍ希釈ＬりＨＡＶ　Ａｇ希釈物を加える。室温で一晩インキユベートする。

５、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄する。０．２％のＴ２゜と５０した抗ＨＡＶ　ＩＩＲＰＯ結合体希釈物を加える（この結合体はＤｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　ＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌ、Ｐｕｂｌｉｃ　ｔｌｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅで製造されたものである）、３７℃で１時間インキュベートする。

６、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄し、Ａｂｏｔｔ管に移し、各、ビーズに２４０１１ＩのＯＰＤ基質を加える。室温、暗所で４５分間インキュベートし、１００．１の４Ｎ硫酸で反応を停止させる。

７、各試料１５０．１及びブランクを微量滴定皿に移し、４９２ｎｅｉでの光学密度（０，０，）を読取る。

ッセ　　　　　３・・　のＢ刑　ゴコ　ＨＢｃＩＧ　　−ジ　　ム　　・・セイ　にＡＣＲＩ＾　　エン　イムイムノ　・・セイ　ＧＡＣＥＬＩＳ＾１、コーティングバッファ（０，０ＩＭ炭酸ナトリウム、０．０ＩＭ重炭酸ナトリウムバッファ、ｐ１１９．６）で希釈した１／１０ＧＯＤＡＫＯ抗ｔｇｃ（γ鎖）中への浸漬によってポリスチレンビーズをコーティングする。

２．０．０８％のアジ化ナトリウムと０．１％のＴｗｅｅｎ　２０と１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）とを含むリンｒａｇ衝溶液（ＰＢＳ）を用いて各唾液試料の１７１０希釈物を１ｌｌｌ！！する。

３、前記試料を、抗１．Ｇでコーティングしたビーズと共に４５℃で２時間インキュベートする。

４　、　Ｐｅｎｔａｗａｓｂシステム（＾ｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、０．１％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で前記ビーズを４回洗浄する。０．１％のＴｗｅｅｎ　２０（Ｔｗｏ）と１０％のＦＣＳと０．５％の正常ヒト血清（ＮＢＳ）とを含むＰＢＳで１　：２００に希釈したＨＢｃｖＬＭ希釈物を加える。４５℃で６０分間インキュベートする。

５、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄し、０．２％の７２０と１０％の正常ウサギ血清（ＮＲＳ）と１０％のＦＣＳと４０％のＮＨＳとを含むＰＢＳ中の１２１７標識ヒト抗ＨＢｃ（１９ｈｌの希釈剤中で毎分ｉｏ’カウント）と共に４５ ℃で２時間インキュベートする。

Ｂ、エン　　　ム　　ム　　　　・・　セ１〜４は前述の通り。

５、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄する。０．２％のＴ２゜と１０％のＦＣＳと５％のＮＲＳと１０％のＮＢＳとを含むＰＢＳ（アジ化物は含まない）で１：１０Ｇで希釈した抗ＨＢｅ　ＨＲＰＯ結合体（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆＮｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＣＰＢＬ製造）希釈物を加える。

６、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄し、Ａｂｏｔｔ管に移し、各ピースに２４０．１のＯＰＤ基質を加える。室温、暗所で４５分間インキュベートし、１００．１の４Ｎ［酸で反応を停止させる。

７、各試料ｔｓｏｕ　Ｉ及びブランクを微量滴定皿に移し、４９２ｎｍでの光学密度（０，０）を読取る。

ッセイ　　　４゛・　のヒト　　１　　イルスＬＬ！ｉＧ　　　−ジ　イムノ　・・セイにＡＣＲＩ＾　　エン　　ム　ムノ　・・セ　（：ＡＣ−１じ旺１、コーティングバッファ（０，０ＩＭ炭酸ナトリウム、０．０ＩＭ重炭酸ナトリウムバッファ、ｐＨ９，６＞で希釈した１／１００００ＡＫＯ抗１ｇＧ（γ鎖）中への浸漬によってポリスチレンビーズをコーティングする。

２、ｏ、ｏｓ％のアジ化ナトリウムと０．１％のＴｗｅｅｎ　２０（Ｔｗｏ）と１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）とを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いて各唾液試料の１７１０希釈物を調製する。

３、前記試料を、抗■ｇｃでコーティングしたビーズと共に３７℃で３時間インキュベートする。

４　、　Ｐｅｎｔｉｗａｓｈシステム（＾ｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、０．０５％の丁、。を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で前記ビーズを４回洗浄する、０．１％の丁、。と１０％のＦＣＳと１％の正常ヒト血清（ＮＨＳ）とを含むＰＢＳで１＝８０に希釈したＩＩＩＶ抗原本（ＩＩＩＶ　Ａｇ）希釈物を加える。室温で一晩インキユベートする。

本抗原の最適希釈度はバッチ毎に異なり得る。

Ａ、−ジ　　ム　　・・セイ５、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄し、０．２％のＴ２゜と１０％のＦＣＳと２０％のＮＨＳと１０％の正常ウサギ血清（ＮＲＳ）とを含むＰＢＳ中７７） ”’１１１ｍＪｈト抗ＨＩＶ（１９０ｕｌ）希釈剤中で毎分１０’カウント）と共に３７℃で２時間半インキュベートする。

Ｂ、エン　　ム　ムノ　・・セ１〜４は前述の通り。

５、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄する。１０％のＮＨＳを含むＰＢＳで１＝４に希釈したＩｌｅｌｌｃｏｍｅヒト抗１１１Ｖペルオキシド結合体希釈物を加える。３７℃で２時間半インキュベートする。

６、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄し、Ａｂｏｔｔ管に移し、各ビーズに２４０．　ｌのＯＰＤ基質を加える。室温、暗所で３０分間インキュベートし、１ｏｏｕ　ｌの４Ｎ硫酸で反応を停止させる。

７、各試料ｔｓｏｕ　＋及びブランクを微量滴定圧に移し、４９２ｎｍでの光学密度（０，Ｄ）を読取る。

ッセイ　　　　５ ′　　　　・・　のヒト　　　為　　イルスＨＩＶＩに　　　１子１−Ｌ立ゴー１、ｒＵＪ形又は平底形微量滴定圧のウェルを、コーティングバッファ（０，０１Ｍ炭酸ナトリウム、０．０ＩＭ重炭酸ナトリウムバッファ、ｐＨ９，６）で１／１５００に希釈したＤＡＫＯ抗ＩｇＧ（γ鎖）希釈物でコーティングする。

２、前記ウェル内で、０．０８％のアジ化ナトリウムと０．１％のＴｗｅｅｎ　２０（Ｔ２Ｏ）と１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）とを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いて、血清試料の希釈物（１／１０〜１／２０００）又は各唾液試料の１７５希釈物を調製する。

３、前記試料を、抗！ｇＧでコーティングした滴定皿中で３７℃で１〜３時間インキュベートする。

４、適当な微量滴定皿洗浄システムを用いて、０．０５％のＴ２゜を含むＰＢＳ　（ＰＢＳＴ）中で前記ウェルを４回洗浄する。

５、抗原でコーティングした粒子の作用懸濁液（例えば、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ／５ｅｒｏｃｌｉａ製のｔｌｌＶでコーティングしたゼラチン粒子を、２％のＦＣＳを含むＰＢＳで１＝２０に希釈したもの）を調製する。各ウェルにこの懸濁液をｓｏｕ　！導入する。

６、滴定器を被覆し、室温で一晩おいて粒子を沈澱させる。

７、（Ｕ底滴定圧の場合）完全な結合を表す４＋から完全な粒子沈降を表す０までの目盛りをもつスケールで粒子の結合を測定する。測定評価値２〜４は、別の方法で確認すべき暫定的陽性反応と見なされる。

８、（平底滴定圧の場合）皿を４５°傾斜させ、ウェルの底部エツジにおける粒子の沈降度によって、前記第７項に記載の評価段階に従い粒子の結合度を測定する。

９、必要であれば、コーティングしてない対照粒子を用いて平行検査を同様に実施し得る。

・・セイ　　　　６＝　　のヒ　　　　１　　イルス　　：Ａ　　イルスニＢ　コ　　　　　　、　　ルス　　　かウ　ルス　　　またふ　）　　イルスに　　　Ｉ　Ｍ　　　　　　　　７’−めのＩＭ−ジ　イムノア・・セイ　エン　イムイムノアッセイび１ｊΣ乙工±コー実施例１〜５と類似のアッセイを、ヒト！８Ｇに対する抗体ではなくヒトＩｇＭ（μ鎖特異的）に対する抗体でコーティングした面を用いて、同様の方法で実施した。その他の使用しか又はおたふくかぜウィルスの抗原である。最適作用希釈度は各アッセイ毎に個々に決定した１例えば、血清及び唾液中の抗はしかＩｇＭの捕捉ラジオイムノアッセイ（はしかウィルスによる急性の又は発生したばかりの感染を確認するのに使用される）では、１、コーティングバッファ（０，０ＩＭ炭酸ナトリウム、０．０ＩＭ重炭酸ナトリウムバッファ、ｐ１１９．６）で１７３０００に希釈したＴＡＧＯ抗１ｇＭ（ μ鎖）希釈物中への浸漬によってポリスチレンビーズをコーティングする。

２．０．０８％のアジ化ナトリウムと０．１％のＴｗｅｅｎ　２０（Ｔｗｏ）と１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）とを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用いて、各血清の１７５０希釈物又は各唾液試料の１７１０希釈物を調製する。

３、前記試料を、抗１１Ｍでコーティングしたビーズと共に３７℃で１〜３時間インキュベートする。

４　、　Ｐｅｎｔａｗａｓｈシステム（＾ｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、０．０５％のＴ２゜を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で前記ビーズを４回洗浄する。０．１％のＴ２゜と１０％のＦＣＳと１％の正常ヒト血清（ＮＩＩＳ）とを含むＰＢＳで１／１０００に希釈したはしか抗原１（ｆｉ染したＶｅｒ。

細胞培養物の組織培養物液からベレット化したもの）希釈物を加える。室温で一晩インキユベートする。

本抗原の最適希釈度はバッチ毎に異なり得る。

５、前記ビーズをＰＢＳＴ中で４回洗浄し、はしかウィルスに対するモノクローナル抗体と共に３７℃で１時間インキュベートシ、更に洗浄した後、０．２％のＴ、。と１０％のＦＣＳと５％のＮｉ１Ｓと１０％の正常ウサギ血清（ＮＲ５）と５％の正常ヤギ血清とを含むＰＢＳ中の１１１１標識抗ネズミＩｇＧ（１９０，１の希釈剤中で毎分９ｘｌＧ’カウント）と共にインキュベートする。

・・セ゛　　ヒ　　　　〜　　イルス［ＶｒＮ　　　、　　　。

Ｌ抗原でコーティングした粒子を選択標識抗原として使用して、ｆｌｌＶ（エイズ）感染に反応して産生されたＩｇｔ４のアッセイを行った。

アッセイ実施例５と同様に、Ｄａｋｏ抗１ｇＭ（μ鎖）のコーティングバッファ中１７１０００希釈物で微量滴定圧をコーティングした。あとは実施例５と同じ条件で操作を行った。

ＬＫ１唾液を用いる本発明の方法と血清を用いる公知の方法とを比較すべく、直径６論簡のビーズを用いて前記アッセイ実施例１〜４及び６の方法で実験を行った。

ｌ」しく鳳」− 血清及び唾液試料を２９人の実験室スタッフから同時に採取し、下記の抗原に対する抗体の検査を平行して行った：風疹、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎コア、患者及び同意したスタッフから採取した少量の血清／唾液対をＢＩＶ（エイズウィルス）抗原に対する抗体の検査にかけた。

唾液試料のＩｇＧアッセイは前記実施例１〜５の方法を用いて行った。比較アッセイは血清を用いて、ＧＡＣＲＩ＾（例えばＰａｒｒｙ　、Ｊ、Ｎｅｄ、Ｖｉｒｏｌ、１９（１９８６）３８７−３９７）、Ｃ０ＮＰＲＩＡ（ＣＯＮＰｅｔｉ− ｔｉｖｅ　Ｒａｄｉｏ　ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ）（例えばＰａｒｒｙ、Ｍｅｄ、Ｌａｂ、Ｓｃｉ、３８（１９８１）３０３−３１１）、Ｍｏｒｔｉｍｅｒ等、ＢＭＪ　２９０１１７６−７８、Ｃｏｈｅｎ等。

Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、Ｎｅｔｈ、（１９８１）２，１８１−１９２）及びラジアル溶血（ｒａｄｉａｌｈａｅｍｏｌｙｓｉｓ）　（Ｋｕｒｔｚ等、Ｊ、Ｂｙｇｉｅｎｅ（１９８０）８４，２１３−２２２）に従い実施した。

結果は下記の通りであった。

（ｉ）特異的１１ＭはＡ型肝炎に感染した被験者の唾液及び血清中に容易に検出できる。

（ｉｉ）特異的１１Ｇは成る範囲の感染に関して被験者の血清及び唾液の両方に検出できる。

（ｉｉｉ）血清及び唾液のイムノグロブリンアッセイの結果は、定性的には完全な且つ定量的にはかなり良い相互関係を示した１本発明の方法による唾液のアッセイと、ＣＡＣＲＩ＾、Ｃ０ＮＰＲＩＡ及び非捕捉（例えばラジアル溶血）アッセイによる血清のアッセイとの間の相関関係は、風疹、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎及びＢＩＶ（エイズウィルス）に見られた。

第１図〜第４図は、唾液を用いる本発明の方法で得られたＴ：Ｎ比、即ち被検試料（Ｔ）の放射能と特異的ｔｇｃを全く含まないことがわかっている陰性標準（Ｎ）との比を、対応する血清を用いる従来の方法で得られたＴＡＮ比に対してプロットしている。

第１図は、実施例２（＾）の方法によるＡ型肝炎アッセイと血清ＣＡＣＲＩ＾アッセイによるＡ型肝炎アッセイとの間の相関関係を示している。

第２図は実施例１（＾）の方法による風疹アッセイと血清にＡＣＲＩ＾による風疹アッセイとの間の相関関係を示している。

第３図は実施例２（Ａ）の方法によるＡ型肝炎アッセイと血清Ｃ０ＮＰＲＩＡアツセイによるＡ型肝炎アッセイとの間の相関関係を示している。

第４図は実施例１（＾）の方法による風疹ウィルスアッセイと血清のラジアル溶血検査による風疹ウィルスアッセイとの間の相関関係を示している。

ｍ致」１血清／唾液試料対を従来の検査法（Ｃ０ＮＰＲＩＡ、ラジアル溶血、酵素結合イムノソーベントアッセイＥＬＩＳ＾（Ｅｌａｖｉａ））（例えばＰａ５ｔｅｕｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｕｂｅｎｚ　Ｇ、　Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｉａ　Ｂｉｏｌｏ−ｇｉｃａｌｓ）及び！ｇＧ捕捉アッセイ（ＣＡＣＲＩ＾、ＧＡＣＥＬＩＳ＾））によって、Ａ型肝炎ウィルス（検査数１００対）、ＢＩＶ（５３対）、Ｂ型肝炎ウィルスコア（６２対）及び風疹ウィルス（３０対）に対する抗体の検査にかけた。従来のアッセイでは、前記４種類のウィルスに対する抗体が、血清中にこれらの抗体を含んでいた多くの被験者（９３／１１９）の唾液中には検出されなかった０本発明の方法では、抗ＨＢｃに関して誤って陰性を示した２つの唾液試料と抗風疹ウィルスに関して誤って陰性を示した１つの唾液試料とを除いて、従来の検査で血清陽性（ｓｅｒｏ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であった総ての被験者の唾液中に前記抗体が検出された。血清及び唾液でのにＡＣＲＩ＾の抗Ｂｌｖ及び抗ＨＢｃ反応性の間には有意な差は見られなかったが、ＧＡＣＲＩ＾の抗１１ＡＶ及び抗風疹反応性は血清の方が唾液より強かった。前記４穫頚のウィルス抗体に関する唾液のにＡＣＲＩ＾及びＣＡＣＥＬＴＳＡの結果は緊密な相関関係を有し、抗■＾Ｖ及び抗）１１Ｖに関する唾液（：ＡＣＥＬＩＳ＾の結果はＣＡＣＲＩ＾の結果と同じくらい正確であった。抗ＢＡＶ及び抗日Ｖの検出では、唾液及び血清の両方でにＡＣＲＩ＾がＩｇ＾捕捉アッセイより優れていた。

杯五五ユしｉＬ（ｉ　＞　ＬＬｔＸ　ＨＡ　Ｖ　（Ａ型肝炎ウィルス）及び抗風疹ウィルスの検査では＋　ＨＡＹの予防注射を要求した旅行者及び実験室スタッフから血清／唾液試料対を採取した。各被験者から静脈穿刺によって血液を採取し、唾液を直径３．５ｃ−のねじ蓋付きポット（ｓｔｅｒｉｌｉｎ）中に出してもらった。抗ＦＩＩＶ検査の場合は、感染の可能性の高い被験者及び低い被験者から血液／唾液試料対を同様にして採取した。これらの試料及び実験室スタッフから採取した試料は抗ＨＢｃ（Ｂ型肝炎コア）検査にもかけた。血清は各凝固血液から分離して検査し、唾液試料は未処理のまま検査した。血液及び唾液は一３０℃で貯蔵した。

（ｉｉ）７−　抗１１ＡＶ、抗Ｈ１ｖ及び抗ＨＢｃをＣＯＭＰＲ＋へテ測定した。結果は１２５１標＝の結合阻止率によって示した。カットオフ値は抗１１ＡＶ及び抗［１１Ｖの場合が阻止率５０％、抗ＨＢｅの場合が７０％であった。抗風疹はラジアル溶血で測定した。

抗１１１Ｖ及び抗風疹はＥＬＩＳＡ及びＥｌａｖｉａでも測定した。

（ｉｉｉ）ｆ！ＪＬ二二に４　６ｍｓのポリスチレンビーズを、ヒトγ鎖又はα 鎖（ＤＡＫＯイムノグロブリン）に対するウサギ抗血清の１：１０００希釈物中に浸漬してコーティングした。これらのビーズは使用前及びアッセイの各ステップの間に、０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳで洗浄した。０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳで希釈した血清又は唾液試料を前記ビーズと共にインキュベートした０次いで、ＨＩＶ抗原、）ＩＡＶ抗原、ＨＢｃ抗原又は風疹ウィルス赤血球凝集素を適用し、その後検出試薬を適用した。この試薬は抗）ＩＡＶ、抗ＨＩＶ又は抗ＨＢｃの力価が高い精製したヒトＩｇＧであるか、又は１２５■もしくはペルオキシダーゼに結合した風疹に対する精製ネズミモノクローナル抗体であった。ヒト血清（特異的抗体陽性）を加えても検出試薬の非特異的結合は低下しなかった。検出試薬の結合はγ放射として、又はオルトフェニレンジアミンもしくは（風疹の場合は）テトラメチルベンジジンに対する酵素の作用によって生じる色の光学密度として測定した１反応が陰性対照の２倍を超えた（Ｔ：Ｎ＞２）場合を陽性とみなした。

（ｉｖ）ｉυＬ血清及び唾液のｒｇｃ抗体捕捉アッセイによって得られた各ウィルス抗体の結果を従来の検査の結果と比較した（表１）、血清を用いた従来の検査の結果は下記の通りであった：抗ＨＡＶに関しては６６人の被験者が陰性、３４人が陽性であり（ＣＯＭＰＲ１＾阻止率８４％〜９８％、メジアン９２％）、抗ＨＩＶに関しては１０人の被験者が陰性、４３人が陽性であり（ＣＯＭＰＲ１＾８４％〜９８％、Ｅｌａｖｉａ全部２．００以上）、抗ＨＢｃに関しては３７人の被験者が陰性、２５人が陽性であり（ＣＯＭＰＲＩ＾７６％〜９５％、メジアン９１％）、抗風疹に関しては３人が陰性、２７人が陽性であった（ラジアル溶血７〜１２ｍｍ、メジアン１０ｍ５＋、Ｒｕｂｅｎｚ　Ｇ　Ｏ，７５〜２．００、メジアン２．００）、血清陽性被験者の唾液を用いた従来の検査の結果は大部分が陰性であった。

風疹ウィルスラジアル溶血及びＥＬＩＳＡでは唾液中に抗体が全く検出されず、抗［ＩＡＶ及び抗ＨＢｃに関するＣＯＭＰＲＩ＾では２〜３の試料（３／３２．２／１８）に検出されただけであった。

極めて僅かの例外を除いて、血清及び唾液試料の１ｇＧ抗体捕捉ラジオイムノアッセイ（（：ＡＣＲＩ＾）の結果は、従来の血清検査の結果と定性的に同じであり且つ合致していた０例外は、血清中に弱い抗ＨＢｃが見られた２人の被験者と弱い抗風疹反応が見られた１人の被験者である。これらの３人の被験者は唾液のＧＡＣＲＩ＾検査では陰性であった。

従来の血清検査の結果と血清及び唾液のＣＡＣＲＩ＾の結果との間の相関関係は、抗風疹以外は緊密なものではなかった（表２）、抗ＨＩＶの場合を除けば、血清及び唾液のにＡＣＲＩ＾の結果の間により緊密な相関関係が見られた。抗ＲＩＶの場合には、表２に示す残りの３つの抗体のように２種類の試料を同時に検査することをしなかった。

エンザイムイムノアッセイ（にＡＣＥＬＩＳ＾）を用いた場合の結果は、にＡＣＲＩＡ及び対応血清の従来検査の結果と定性的に同じであったが、４つの試料が抗ＨＢｅに関して誤りの陰性を示し、１０試料が抗風疹に関して誤りの陰性を示した。これら１４の試料は殆ど総ての場合にＣＡＣＥＬＩＳＡで真の陰性試料より強い反応性を示したが、この反応性は平均陰性対照値の２倍より小さかった。

唾液にＡＣＥＬＩＳへの結果はＧＡＣＲＩΔの結果に対して緊密な相関関係を示したが、抗ｔｌＡＶに関しては例外であり、２１／３２のにＡＣＥＬＩＳ＾の光字密度値がＥＬＩＳＡ読取りの上限値たる２．ＯＯを上回った。

唾液中ではＩｇＡ濃度がｔｇｃ濃度に比べて高いことから、唾液の特異的ＩＩＩ＾捕捉アッセイ及びＩｇＧ捕捉アッセイを抗ＨＡＶ及び抗［１１Ｖ陽性を示すための手段として比較した。特異的１ｇ＾は唾液中では被験者の半分にしか検出されなかったが、血清中では２人を除いて血清陽性被験者全員に検出された（表３）。

轟−上血清及び唾液試料対を従来の検査及び捕捉アッセイにかけた場合の陽性及び陰性の結果十　括弧内は、検査：陰性比又は（（：ＡＣＥＬＩＳ＾）０１１値の範囲及びメジアン。

本　採取量が不適当であるという理由から、場合によっては唾液試料を全部は検査できなかった。

宍−じし血清陽性被験者から採取した唾液のＣＡＣＲＩ＾の結果と血清及び唾液試料に関する他の結果との間の相関関係（相関係数ｒを示す）＋　抗風疹ＲＨに関するＣ０ＮＰＲＩ＾の結果。

本　有意な相関関係ｐ＜０．０５：　　ロＰ　＜０．０１　：　ａｔ處ｐ　＜０．００１゜表−二り抗！！ＡＶ陽性被験者１０人及び抗１１１Ｖ陽性被験者１９人から採取した血清及び唾液試料の特異的１ｇＧアッセイ（にＡＣＲＩ＾）及び特異的１ｇ＾アッセイの結果の比較十　陽性の数（検査：陰性比の範囲、メジアン）座」ＬＫ朋≦しアッセイ実施例５に記載の方法を使用して、血清及び唾液試料中の抗ＨＩＶ　１．にの検出を行った。

ＨＩＶ感染の危険のある被験者から採取した１７０のコード化血清試料を検査した。従来のアッセイによって２６の試料が抗ＨＩＶ陽性と確認され、その総てが粒子アッセイで４＋の（完全な）凝集を示した。抗ＨＩＶ陽性であることが分かっている１４４の試料のうち、４つが僅かな（ｔ＋＞ａ集を示し、２つが３十〜４◆の凝集を示した。検査を繰り返したところ、１つを除いて総ての血清試料が陰性であった。この１つの血清試料は４＋の凝集を示した。

血清中に抗１１１Ｖを有することがわかっている被験者から採取した６２の試料を含めて７３の唾液試料をコード化して検査した。６２人の血清陽性被験者のうち６１人の唾液が抗ＨＩＶ１ｇＣ陽性であった（５６の試料が４＋の凝集を示し、５つの試料が３÷の凝集を示した）、１１人の血清陽性被験者の唾液試料のうち２つの試料が４＋凝集を示した。これを、非コーテイング（ｆｌｌＶ陰性）粒子を用いて更に検査した。

臨Ｊξ（散Ａエポリスチレンビーズを抗ヒトＩｇＭでコーティングして捕捉アッセイの準備を整え、Ａ型肝炎、はしか及びおたふくかぜウィルスに対する特異的１６Ｍの検出を行った。アッセイ方法としては実施例６の方法を使用した。

血清及び唾液試料を２２人の黄痘患者から平行して採取し、抗ＢＩＶ　ＩｇＭを調べた。１５の血清及び唾液試料対が陽性であり、従来の血清検査と唾液アッセイとの間に完全な一致が見られた。陽性唾液検査では強いシグナルが見られた（表４参照）、２人の被験者から７ケ月にわたって採取した一連の試料を１：１０で希釈して、抗ＲＡＶ　１１Ｍ検査を行った。特異的ＩＢＭ抗体は約１ケ月存続した。別の検査では、唾液の最適検査希釈度が１：１０〜１：２０であることが判明した。血清の場合には最適希釈度がそれより遥かに高い（１：５０００〜１：４００　ｏ）。

２人の被験者Ｃ及びＫの結果を第５図、第６図及び第７図にグラフで示した。

第６図は、夫々３月１５日、４月５日、５月２１日及び１０月２０日に採取した４つの連続的試料１．２．３及び４の結果を示している。第７図は夫々３月２０日、４月１３日、５月１６日及び１０月１５日に採取した４つの連続的試料１．２．３及び４の結果を示している。

抗はしかＩｇＭの検出は、１：１０で希釈した唾液試料と、はしか抗！（感染したＶｅｒｏ細胞の組織培養液からペレット化したウィルス希釈物）と、はしかウィルスに対するモノクローナル抗体と、ネズミＩｇＧに対する１２５１標識抗体とを、洗浄ステップを挟んでビーズに順次適用することによって行った。

臨床的に診断されたはしか患者６９人の唾液を、感染した子供に主線ロールを噛んでもらい、次いでこのロールを遠心分離にかけて清澄な唾液を放出させることにより採取した。これらの臨床的に診断された患者のうち６７人がはしかＩｇＭ抗体の唾液アッセイで陽性を示しくＴ：Ｎ　２．０〜６３．４＞、２人が陰性の結果（範囲１．２〜１．９）を示した。０人の患者については、発病日時を正確に知ることができ、アッセイのＴＡＮ値を唾液試料採取間隔に対してプロットすることができた。これらの結果は第８図に示されている。

同様の方法で、抗おたふくかぜＩＢＭの検出も行った。但し、おたふくかぜウィルスを加えた後で、ウサギを用いて培養したおたふくかぜ抗血清の希釈物を加え、次いで＋２＠１標識抗ウサギＩｇＧを加えるようにした。成る６歳の女児から、おたふくかぜの急性段階とその後の９ケ月にわたって唾液試料を採取した。ＩＢＭ反応は、発病後１０日目、１６日目及び２１日目に採取した３つの試料で強く示され、２ケ月にわたって検出可能状態を維持した。これらの結果は第９図のグラフに示す。

白　　［生　　か　　１　　　た　　゛　　　　い　　、　　　Ａ　　　　″、の１−唾液中杭Ｈ＾Ｖ　ＩｇＭのＴＡＮ値　１１〜１３４２−唾液中杭ＨＡＶ　ＩｇＭのＴ：Ｎ値　０．９〜３．０ＧＡＣＲＩＡ　（曖鷹）ＴＪＪ。

ｊＬｓ　　　：ラシ゛アｙＪ！ｊａ（凰→責）Ｃｗｎｎ）ｎＧＡＣＲＩＡ　（４ＪＬ）丁Ｎ。

時間　（月）蟲収°＆−１後のｇ収補正層の写しくＲ訳文）提出Ｉｆ（特許注第１８４条の８）工、ｉ□１０７１２Ｂ国特許庁長官　古　１）文　毅　殿１、特許出願の表示　　ＰＣＴ／ＧＢ　　８８１００２５１、発明の名称　　　　イムノグロブリンのアッセイ方法３、特許出願人住　所　　イギリス国、ロンドン・エヌ・ダブリュ・９・５・エイチ・ティー、コリンディル争アベニューφ６１．−名　称　　ザ・パブリック・ヘルス・ラボラタリイ・サーヴイス・ボード４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ピル５、補正層の提出年月日　　１９８９年５月１６日。

６、添附書類の目録（１）補正層の翻訳文　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１通（１）　１９８９年５月１６日提出の第２頁　・　　　　　　　　　　　　　　　（別紙１）（２）　１９８９年５月１６日提出のクレーム６から１５．（別１ｇ２）場合によっては、別の種類の特異的イムノグロブリンＩｇＡの検査を行うことも望ましいが、これは通常、診断又はアッセイ法としての適性に劣る。特異的ｔｇｃ及びＩＢＭの存在を調べる検査は現在のところ、血清、即ちＩｇＧ及びＩｇＮを極めて高い濃度で含む体液を用いて行われている。適当な血清検査は例えばＪ、　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１９（１９８６）、ｐ、３８７− ３９７に記載されている。　にＢ　２０２６６９１＾には、基質に固定した抗γ 、μ又はαによって１．を捕捉し、次いで直接的又は間接的に標識した抗原によって前記１．を検出する血清ｔｇｃ、ＩＢＭ及びＩｇ＾アッセイ方法が開示されている。　ＥＰ＾０１３２１７０及び０１０１１６６にも、異なる方法を用いる血清１ｇのアッセイが記述されている。

残念なことに、血清は静脈穿刺を行わないと採取できない、これは簡便な方法ではなく、特に子供及び神経質な成人には適用できないこともある。エイズウィルスの検査の場合は、静脈穿刺に対する偏見が広まっているだけに不都合である。

静脈穿刺はまた、殺菌した針、注射器、スキンクレンザ−及び包帯を必要とするためコストがかなり高く、場合によっては危険及び困難を伴う。

これらの体液中のＩｇＧ及びＩｇＮ濃度は血清中の濃度より遥かに低く、例えば血清中濃度の約０．０１及び０．００１である。

唾液中のイムノグロブリンの特定、及び該イムノグロブリンのアッセイ方法に関しては、これまでにも成る程度の研究が行われてきた。この研究の多くは一般的性質のものであった１例えば、０ｒａ１．Ｓｕｒｇ、０ｒａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　０ｒａｌ　Ｐａｔｈｏｌ（ＵＳ）　、　（１９８５）　、６０（４＞　、ｐ、３７２−３７６、Ｊ−１ｍｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈ、（１９８３）。

５７（１−３）ｐ、５１−７及びＩｎｖｅｓｔ、Ｏｐｔｈａｍｏｌ　Ｖｉｓｕａｌ　Ｓｅｉ、（１９８６）２７（４）　、９．６２２−５は、唾液中に全種類（Ｉｇ＾、ｔｇｃ及びＩＢＭ）が存在することを明らかにしている。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１９８４）、７１，２０３−１０には、特異的大腸菌（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）抗原を基質上に付着させ、これを血清に暴露することによって、血清中の抗大腸菌ＩｇＧ及び１．Ｎ抗体の存在を検出する方法が記載されている。この参考文献は、この方法が唾液中の前記抗体の検査にも使用できるのではないかと推測しているが、それを実験的に証明することはしていない。

６．７ツセイすべきイムノグロブリンがＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヒト免疫不全ウィルス（即ちエイズウィルス）、風疹、はしか又はおたふくかぜの感染に反応して産生されるものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。

７．７ツセイすべきイムノグロブリンがヒトパルボウイルスＢ１９又は水痘（ＶＺウィルス）に反応して産生されるものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。

８、結合抗原に別の抗体を結合させ、この別の抗体に標識９、アッセイすべきイムノグロブリンが風疹感染に反応して産生されるものであることを特徴とする請求項８に記載の方法。

１０、択一的ステップ（ｉｉ）（ａ）を使用することを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。

１１、標識抗原が抗原でコーティングされたゼラチン又はラテックス粒子であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。

１２、粒子かに認識しやすい色に着色されたものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。

１３、イムノグロブリンがヒト免疫不全ウィルスによる怒染に反応して産生されるものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。

１４、請求項１に記載の方法を用いて、唾液、涙、精液、尿及び脳を髄液から選択したヒト又は動物の体液中に存在する任意の又は総ての種類の特異的イムノグロブリンをアッセイするためのキットであり、（ａ）１種類以上の特異的イムノグロブリンに対する抗体と、（ｂ　）　（ｉ）前記特異的イムノグロブリンに結合できる標識抗原か、又は（ｉｉ＞′＠記特異的イムノグロブリンに結合できる選択抗原及びこの選択抗原に結合できる標識抗体のいずれかと、（Ｃ）当該方法の結果を説明するチャートとを含むことを特徴とするキット。

１５、前記（ａ）で述べた抗体が固体基質上に固定された状態で存在することを特徴とする請求項１４に記載のキット。

国際調査報告り一１１崗１＾・両−ｍｌｌ−、ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００２５１　　ｊＳ＾　　　２１４９８

Claims

【特許請求の範囲】

１．唾液、涙、精液、尿及び脳脊髄液から選択したヒト又は動物の体液中に存在する任意の又は総ての種類の特異的イムノグロブリンをアッセイする方法であって、（ｉ）１種類又はそれ以上のイムノグロブリンに対する抗体を固体基質上に固定し、（ｉｉ）固定した抗体を体液試料に暴露して、その体液中に存在する任意のイムノグロブリンの一部分を前記固定抗体に持合させ、次いで、ａ．結合したイムノグロブリンを選択標識抗原に暴露して、この標識抗原を前記結合イムノグロブリンの少なくとも一部分に結合させるか、又はｂ．結合したイムノグロブリンを選択抗原に暴露して、この抗原を前記結合イムノグロブリンの少なくとも一部分に結合させ、次いで前記選択抗原に対する特異性をもつ標識抗体を前記結合抗原の少なくとも一部分に直接的又は間接的に結合させ、（ｉｉｉ）その後、前記標識抗原又は抗体の特性を検出し及び／又は測定すろステップを合むことを特徴とする方法。
２．イムノグロブリンがＩｇＧ又はＩｇＭであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
３．体液が唾液であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
４．唾液を被験者から採取し、これを希釈しないで又は希釈して使用し、但しイムノグロブリン濃度増加ステップは伴わないことを特徴とする請求項３に記載の方法。
５．択一的ステップ（ｉｉ）ｂを使用することを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
６．アッセイすべきイムノグロブリンがＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（即ちエイズウイルス）、風疹、はしか又はおたふくかぜの感染に反応して産生されろものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
７．アッセイすべきイムノグロブリンがヒトパルポウイルスＢ１９又は水痘（ＶＺウイルス）に反応して産生されるものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
８．結合抗原に別の抗体を結合させ、この別の抗体に標識抗体を結合させることを特徴とする請求項５に記載の方法。
９．アッセイすべきイムノグロブリンが風疹感染に反応して産生されるものであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
１０．択一的ステップ（ｉｉ）（ａ）を使用することを特徴とする請求項２又は３に記載の方法。
１１．標識抗原が抗原でコーティングされたゼラチン又はラテックス粒子であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
１２．粒子が認識しやすい色に着色されたものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
１３．イムノグロブリンがヒト免疫不全ウイルスによる感染に反応して産生されるものであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
１４．請求項１に記載の方法を用いて、唾液、涙、精液、尿及び脳脊髄液から選択したヒト又は動物の体液中に存在する任意の又は総ての種類の特異的イムノグロブリンをアッセイするためのキットであり、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）ａ、（ｉｉ）ｂ又は（ｉｉｉ）の１つ以上を実施するのに必要な１つ又はそれ以上の試薬を含むことを特徴とするキット。
１５．１種類以上のイムノグロブリンに特異的な抗体を固定してある基質を含むことを特徴とする請求項１４に記載のキット。