CN118112252A - 一种伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒及检测方法，包括包被液、重组人IFN‑γ工作液、标准品工作液、洗涤液、封闭液、样本稀释液和山羊抗人IgG二抗。本发明的方法简单，易操作，时间短，敏感性、特异性高，可用于血清学诊断AIGA相关免疫缺陷综合征，并且有助于推算诊断相关阈值，促进临床精准诊疗和预后管理。
Description
技术领域
本发明属于抗体检测领域，具体涉及一种伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei,TM），旧称马尔尼菲青霉（Penicilliummarneffei, PM），是一种机会致病的温度依赖性的双相真菌，在25℃时为菌丝相，37℃时则转化为致病性酵母相，可引起人体播散性马尔尼菲篮状菌病（talaromycosis, TSM），该病如果不及时治疗，患者死亡率可高达85%。TM的传统流行区为中国南部，及泰国北部、越南等东南亚地区。然而随着经济全球化的发展，人口流动不断加速，马尔尼菲篮状菌病在全世界非流行区的报道日益增多。此外，由于马尔尼菲篮状菌病在非流行区的发病率较低，医生和公众对其认识度不高，加剧了其传播的风险。近年来，有学者呼吁，将马尔尼菲篮状菌病定义为“被忽视的热带病”。2022年，世界卫生组织（World Health Organization, WHO）发布了首份病原真菌预警名单，其中包括了TM，这突显了其对人类的危害性。
马尔尼菲篮状菌病好发于免疫功能低下者，HIV感染者尤甚，它是流行区常见的艾滋病并发症；也见于因恶性肿瘤和免疫抑制治疗导致的继发性免疫缺陷人群。然而，TM感染也可能发生在没有明显免疫抑制的HIV阴性的个体中，他们对TM易感的因素尚不明确，但可能与潜在免疫缺陷相关。抗IFN-γ自身抗体（anti-interferon-gamma autoantibodies,AIGA）于2004年首次被发现，文献报道的AIGA相关病例至今有超过600例，患者大部分为东南亚裔。本课题组前期研究证实AIGA相关免疫缺陷综合征（AIGA-associatedimmunodeficiency syndrome, AAID）与HIV阴性成人马尔尼菲篮状菌病密切相关。研究发现AIGA可中和患者体内的IFN-γ，进而阻断IFN-γ所介导的下游生物学功能，进而导致参与胞内感染免疫的Th1反应严重受损。TM进入机体主要侵犯患者的单核-巨噬细胞系统，因此患者常出现多器官累及的播散性感染。这类病人病情迁延反复，治疗难度大、死亡率高；此外，他们还易合并非结核分枝杆菌、带状疱疹病毒、沙门氏菌等病原体的感染，往往需要多种抗生素强化治疗以及辅助免疫疗法。
因此，早期识别和鉴定AIGA阳性的马尔尼菲篮状菌病患者，对指导临床诊治和改善患者预后至关重要。2004年首例AAID病例发现至今，国内外不同学者在抗原-抗体特异性反应的原理基础上，开发了一系列相关的免疫学检测方法，以检测血清中的AIGA。日本学者通过免疫印迹法检测AIGA，此为定性检测。此外有几种基于酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）的方法被用于检测血清中的AIGA。学者在相关研究中使用半定量的血清稀释滴定法，其结果数值以AIGA滴度为单位；泰国则有学者通过竞争性ELISA来间接检测AIGA。然而，上述定性或者半定量检测方法均具有一定局限性，因结果不够精确，无法很好地用于动态评估患者病程中的AIGA水平变化，限制了其进一步应用。此外亦有基于使用抗鼠IFN-γ单克隆抗体作为参考标准品的ELISA定量检测法，其结果数值以AIGA浓度为单位。但因为作为标准品的是鼠源的一抗，则相应的二抗也是抗鼠IgG的二抗，这会因为不同种属间抗体亲和力差异、酶标二抗敏感度差异等问题，对检测体系的准确性造成影响，导致实验结果可靠性欠佳。有美国学者基于Bio-Plex液流平台定量检测AIGA，但此方法对相关试剂、实验仪器和操作步骤要求相对比较高，不适于推广普及。因此，临床上亟需一种简便、快速、定量检测AIGA的检测方法，以对这一医学上新兴疾病进行深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒及检测方法。
为解决上述问题，本发明的技术方案是：
1.一种伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，包括包被液、重组人IFN-γ工作液、标准品工作液、洗涤液、封闭液、样本稀释液和山羊抗人IgG 二抗。
2.如权利要求1所述的伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述包被液的制作方法如下：称取碳酸钠,碳酸氢钠,溶于超纯水中，充分混匀至完全溶解即制备得到包被液；其中碳酸钠、碳酸氢钠与超纯水的质量体积比为0.8：1.465：500 g/ml。
3.如权利要求1所述的伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，重组人IFN-γ工作液的制作方法如下：采用1×磷酸缓冲盐溶液将重组人IFN-γ稀释至50 ug/mL的浓度即得到重组人IFN-γ工作液。
4.如权利要求1所述的伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为1×PBS溶液。
5.如权利要求1所述的伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液的制作方法如下：将人血白蛋白溶于1×磷酸缓冲盐溶液形成终浓度为5%人血白蛋白原溶液即得到封闭液。
6.如权利要求1所述的伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为5%人血白蛋白原溶液，用于实验时稀释样本血清和酶标抗人IgG二抗。
7.一种伽马干扰素自身抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、包被抗原：
取96孔平底透明酶标板，在每个微孔中加入100ul浓度为2ug/ml的重组人IFN-γ工作液，然后将酶标板放置于4℃的冰箱中孵育过夜，以使IFN-γ充分地吸附到孔底上。
步骤二、第一次洗涤：
使用移液枪吸取300ul的洗涤液，缓慢加入96孔板中，静置20秒，然后倒置96孔酶标板并甩掉洗涤液，随后将96孔酶标板在纸面上拍干，重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液；
步骤三、封闭：
在每个微孔中加入100ul封闭液，并将96孔酶标板放置在孵育机上，在37℃的条件下孵育45分钟；
步骤四、第二次洗涤：
使用移液枪吸取300ul的洗涤液，加入96孔酶标板中，静置20秒，然后甩掉洗涤液，最后将96孔酶标板在纸面上拍干，重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液，随后每个微孔加入150ul的liquid plate sealer液，在37℃的条件下孵育90分钟后，用枪头吸出液体，随后放置于37℃下90分钟使96孔酶标板干燥，然后进行步骤五或放于避光条件下保存；
步骤五、配制标准品：
标准品工作液在室温下解冻并使用样品稀释液按需依次稀释，制备200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125 ng/ml、1.5625 ng/m的mono-Ab标准品，样品稀释液作为空白对照；
步骤六、加样：
将患者血清采用样本稀释液稀释2500倍，稀释后的血清样品和标准品均取100ul，并加入到96孔酶标板中，于37°C孵育1小时；
步骤七、第三次洗涤：
使用移液枪吸取300ul的洗涤液，加入96孔酶标板中，静置1分钟，然后甩掉洗涤液，最后将96孔酶标板在吸水纸面上拍干，重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液；
步骤八、二抗加入：
此步骤的目的是使得以使抗IgG二抗与96孔酶标板微孔表面所捕获的AIGA相互结合。二抗偶联辣根过氧化酶（horse radish peroxidase， HRP），利用HRP催化底物的反应，产生可测量的信号。每孔加入100ul的HRP偶联山羊抗人IgG抗体，于37°C 下孵育40分钟。
步骤九、第四次洗涤：
使用移液枪吸取300ul的洗涤液，加入96孔酶标板中，静置1分钟，然后甩掉洗涤液，最后将96孔酶标板在吸水纸面上拍干，重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液；
步骤十、显色：
使用移液枪吸取100ul显色剂四甲基联苯胺，加入96孔酶标板中,此过程避免产生气泡，于37°C避光孵育10分钟；
步骤十一、终止反应和检测
使用移液枪吸取100ul终止液2MH2SO4，加入96孔酶标板中,此过程避免产生气泡，立即放进酶标仪中进行检测，在450nm下读取光密度值，记录结果；
步骤十二、拟合样品OD值和AIGA浓度关系回归方程：
将标准品的浓度值做为X轴数据、标准品OD值作为Y轴数据输入到ELISACalc软件中，选择Logistic曲线拟合，得到曲线拟合方程，然后根据血清样本的OD值，通过方程计算出浓度，再乘以样品稀释度，即得到血清样品中伽马干扰素自身抗体的浓度。
相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：
(1)本发明的方法简单，易操作，时间短，敏感性、特异性高，可用于血清学诊断AIGA相关免疫缺陷综合征。
(2)本发明可助于推算诊断相关阈值，促进临床精准诊疗和预后管理。
附图说明
图1为抗IFN-γ单抗作为标准品的OD值图；
图2为四参数Logistic回归示拟合效果图；
图3为抗人IgG(Fc)为二抗，随着AIGA水平升高图；
图4为马尔尼菲篮状菌病患者进行AIGA检测时不同血清稀释倍数的检测图。
具体实施方式
一种伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，包括如下成分：
1.主要试剂配制
(1) 包被液：包被液用于将抗原分子包被在ELISA酶标板的表面。为了制备包被液，需要称取碳酸钠0.8 g和碳酸氢钠1.465 g，并将其溶于500 mL的超纯水中。搅拌或振荡混匀，直到完全溶解。根据需要分装于50 mL离心管中，保存于4°C冰箱中备用。在使用时，应该先将包被液充分混匀，再将其取出进行包被操作。
(2)重组人IFN-γ工作液：根据供应商提供的规格和说明书，加入适量的1×磷酸缓冲盐溶液（即PBS，常用的磷酸盐缓冲溶液之一,主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾组成 ,pH值约为7.4）中，将重组人IFN-γ稀释至50 ug/mL的储存浓度，得到储存液。混匀后，以每管200ul分装于1.5 mL的离心管中，并存放于-20°C冰箱中，避免在储存和使用过程中发生冻融变化。这种制备方法可以确保IFN-γ工作液的质量和稳定性，以使后续实验得到准确的结果。在酶标板上包被IFN-γ时，将其储存液充分混匀后稀释25倍，即将IFN-γ工作液用步骤（1）中配制好的包被液稀释至2ug/mL。这样可以得到适宜的工作液浓度，使其可以与ELISA酶标板的表面充分结合。本步骤严格按照实验要求制备和使用包被液，以确保实验结果的准确性和可重复性。
(3) 洗涤液：需要根据实验需要，按照1：10的比例将10×PBS-Tween液（即PBST，包含0.05% Tween-20，pH 7.5）加入超纯水中，并充分振荡混匀，最终配成1×PBST。洗涤液需要现配现用，避免长时间的储存导致其质量和稳定性下降。超纯水经高纯水处理、反渗透和去离子处理等多重净化步骤，确保其不含任何离子、有机物和微生物等杂质，以避免洗涤液中出现任何干扰物质，从而保证实验的准确性和可重复性。在实验中，PBST主要用于洗涤酶标板，去除无关物质，使目标物质更容易与酶标记结合。本步骤严格按照实验要求操作制备和使用洗涤液，确保实验结果的可靠性和准确性。
(4)封闭液：为制备封闭液，需要在生物安全柜中按照一定比例将人血白蛋白原液［20%］溶于1×PBS中，并充分震荡混匀，以使其终浓度为5%。然后，根据需要将封闭液分装到50 mL离心管中，并存放在4°C冰箱备用。这种制备方法可以确保封闭液的质量和稳定性，以便在后续的实验中得到准确的结果。
(5)样本稀释液：样本稀释液用于实验时稀释样本血清和酶标抗人IgG二抗。和封闭液一样，样本稀释液也需要按照一定比例配制。制备方法与封闭液相同，同样需要在生物安全柜中将稀释液充分混合后分装到50 mL离心管中，并存放在4°C冰箱备用。这种稀释液可以有效地稀释样本血清，它有助于保持抗体或抗原的结构和功能，防止由于稀释引起的蛋白质变性或失活，从而使得后续的实验可以得到准确的结果。
（6） 山羊抗人IgG （Fc）二抗：该试剂原液为1000ul液体，保存液成分为含0.05%硫柳汞的PBS（pH 7.4）。在使用前，将其以20ul体积分装于EP管中，保存于-20°C的冰箱中，以保持其稳定性和活性。用于实验时，根据说明书，按1：25000比例，用样本稀释液进行稀释。
(7)单克隆AIGA标准品制备
一种商品化的人源化鼠抗IFN-γ单克隆抗体（Cat.No:A09D11-F84）订购于北京百新意生物科技有限公司。通过在室温下解冻原始抗体储存管，通过涡旋振荡器轻柔的反转充分混合，加入稀释液调整浓度至1mg/mL，然后以20ul分装至0.5ml无菌离心管中，于-20℃冰箱中保存，用于后续配制AIGA单克隆标准品（AIGA mono-Ab）。
2. 伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒使用方法如下：
（1）包被抗原
取96孔平底透明酶标板，在每个微孔中加入100ul浓度为2ug/ml的重组人IFN-γ工作液，然后将酶标板放置于4℃的冰箱中孵育过夜，以使IFN-γ充分地吸附到孔底上。
（2）第一次洗涤
使用移液枪吸取300ul的洗涤液，缓慢加入96孔板中，避免接触到孔的内壁，静置20秒，然后快速倒置96孔酶标板并用力甩掉洗涤液，随后将96孔酶标板稍加力在纸面上拍干。重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液。
（3）封闭
在每个孔中加入100ul提前配制好的封闭液，并将96孔酶标板放置在孵育机上，在37℃的条件下孵育45分钟。此步骤的目的是封闭96孔酶标板上未被IFN-γ结合的位点，以防止待测血清样本中的无关抗体与孔板上的空白位点结合，从而减少非特异性反应的发生，确保结果的准确性和可靠性。
（4）第二次洗涤
使用移液枪吸取300ul的洗涤液，缓慢加入96孔酶标板中避免接触到孔的内壁，静置20秒，然后用力甩掉洗涤液，最后将96孔酶标板稍加力在纸面上拍干。重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液。随后每孔加入150ul的liquid plate sealer液，在37℃的条件下孵育90分钟后，用枪头小心洗出液体，随后放置于37℃下90分钟。这一步骤完成之后，96孔酶标板可放干燥密封条件下，置于4℃冰箱稳定保存2年以上。
（5）配制标准品
临用时，将1小管标准品工作液在室温下解冻并按需依次稀释，制备了mono-Ab标准品（200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125 ng/ml、1.5625ng/ml）。样品稀释液则作为空白对照。
（6）加样
预先将患者血清稀释，根据不同的稀释倍数，用样本稀释液对样品进行稀释。稀释后的血清样品和标准品均取100ul，并加入到96孔酶标板中，于37°C孵育1小时。
（7）第三次洗涤
此步骤目的是去除多余的样品稀释液。使用移液枪吸取300ul的洗涤液，枪头避免接触到孔的内壁，缓慢加入96孔酶标板中，静置1分钟，然后用力甩掉洗涤液，最后将96孔酶标板稍加力在吸水纸面上拍干。重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液。
（8）二抗加入
此步骤的目的是使得以使抗IgG二抗与96孔酶标板微孔表面所捕获的AIGA相互结合。二抗偶联辣根过氧化酶（horse radish peroxidase， HRP），利用HRP催化底物的反应，产生可测量的信号。每孔加入100ul的HRP偶联山羊抗人IgG抗体，于37°C 下孵育40分钟。
（9）第四次洗涤
此步骤目的是去除多余的二抗稀释液。使用移液枪吸取300ul的洗涤液，枪头避免接触到孔的内壁，缓慢加入96孔酶标板中，静置1分钟，然后用力甩掉洗涤液，最后将96孔酶标板稍加力在吸水纸面上拍干。重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液。
（10）显色
使用移液枪吸取100ul显色剂四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine, TMB），枪头避免接触到孔的内壁，缓慢加入96孔酶标板中,注意此过程避免产生气泡，于37°C避光孵育10分钟。
（11）终止反应和检测
使用移液枪吸取100ul终止液，枪头避免接触到孔的内壁，缓慢加入96孔酶标板中,注意不要产生气泡，立即放进酶标仪中进行检测，在450nm下读取光密度值（opticaldensity, OD），记录结果。
（12）拟合样品OD值和AIGA浓度关系回归方程
将标准品的浓度值做为X轴数据、标准品OD值作为Y轴数据输入到ELISACalc软件中。
抗IFN-γ单抗作为标准品，其OD值在合理范围，如图1所示。
四参数Logistic回归示拟合效果优（r2>0.99），如图2所示。
抗人IgG(Fc)为二抗，随着AIGA水平升高，其误差更小，准确性更高，如图3所示：
马尔尼菲篮状菌病患者进行AIGA检测时最佳血清稀释倍数为2500倍，这有助于快速、便捷检测，并且降低实验成本和耗材。如图4所示：
上述实施例仅仅是本发明的一个具体实施方式，并不作为本发明的限定，任何对其进行的简单改进和替换均在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，包括包被液、重组人IFN-γ工作液、标准品工作液、洗涤液、封闭液、样本稀释液和山羊抗人IgG 二抗。
2.如权利要求1所述的伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述包被液的制作方法如下：称取碳酸钠,碳酸氢钠,溶于超纯水中，充分混匀至完全溶解即制备得到包被液；其中碳酸钠、碳酸氢钠与超纯水的质量体积比为0.8：1.465：500 g/ml。
3.如权利要求1所述的伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，重组人IFN-γ工作液的制作方法如下：采用1×磷酸缓冲盐溶液将重组人IFN-γ稀释至50 ug/mL的浓度即得到重组人IFN-γ工作液。
4.如权利要求1所述的伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为1×PBS溶液。
5.如权利要求1所述的伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液的制作方法如下：将人血白蛋白溶于1×磷酸缓冲盐溶液形成终浓度为5%人血白蛋白原溶液即得到封闭液。
6.如权利要求1所述的伽马干扰素自身抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液为5%人血白蛋白原溶液，用于实验时稀释样本血清和酶标抗人IgG二抗。
7.一种伽马干扰素自身抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、包被抗原：
取96孔平底透明酶标板，在每个微孔中加入100ul浓度为2ug/ml的重组人IFN-γ工作液，然后将酶标板放置于4℃的冰箱中孵育过夜，以使IFN-γ充分地吸附到孔底上；
步骤二、第一次洗涤：
使用移液枪吸取300ul的洗涤液，缓慢加入96孔板中，静置20秒，然后倒置96孔酶标板并甩掉洗涤液，随后将96孔酶标板在纸面上拍干，重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液；
步骤三、封闭：
在每个微孔中加入100ul封闭液，并将96孔酶标板放置在孵育机上，在37℃的条件下孵育45分钟；
步骤四、第二次洗涤：
使用移液枪吸取300ul的洗涤液，加入96孔酶标板中，静置20秒，然后甩掉洗涤液，最后将96孔酶标板在纸面上拍干，重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液，随后每个微孔加入150ul的liquid plate sealer液，在37℃的条件下孵育90分钟后，用枪头吸出液体，随后放置于37℃下90分钟使96孔酶标板干燥，然后进行步骤五或放于避光条件下保存；
步骤五、配制标准品：
标准品工作液在室温下解冻并使用样品稀释液按需依次稀释，制备200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125 ng/ml、1.5625 ng/m的mono-Ab标准品，样品稀释液作为空白对照；
步骤六、加样：
将患者血清采用样本稀释液稀释2500倍，稀释后的血清样品和标准品均取100ul，并加入到96孔酶标板中，于37°C孵育1小时；
步骤七、第三次洗涤：
使用移液枪吸取300ul的洗涤液，加入96孔酶标板中，静置1分钟，然后甩掉洗涤液，最后将96孔酶标板在吸水纸面上拍干，重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液；
步骤八、二抗加入：
此步骤的目的是使得以使抗IgG二抗与96孔酶标板微孔表面所捕获的AIGA相互结合。二抗偶联辣根过氧化酶（horse radish peroxidase， HRP），利用HRP催化底物的反应，产生可测量的信号。每孔加入100ul的HRP偶联山羊抗人IgG抗体，于37°C 下孵育40分钟；
步骤九、第四次洗涤：
使用移液枪吸取300ul的洗涤液，加入96孔酶标板中，静置1分钟，然后甩掉洗涤液，最后将96孔酶标板在吸水纸面上拍干，重复3次，以确保孔中没有残留的洗涤液；
步骤十、显色：
使用移液枪吸取100ul显色剂四甲基联苯胺，加入96孔酶标板中,此过程避免产生气泡，于37°C避光孵育10分钟；
步骤十一、终止反应和检测
使用移液枪吸取100ul终止液2MH2SO4，加入96孔酶标板中,此过程避免产生气泡，立即放进酶标仪中进行检测，在450nm下读取光密度值，记录结果；
步骤十二、拟合样品OD值和AIGA浓度关系回归方程：
将标准品的浓度值做为X轴数据、标准品OD值作为Y轴数据输入到ELISACalc软件中，选择Logistic曲线拟合，得到曲线拟合方程，然后根据血清样本的OD值，通过方程计算出浓度，再乘以样品稀释度，即得到血清样品中伽马干扰素自身抗体的浓度。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118112252A true CN118112252A (zh) | 2024-05-31 |
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