CN112694499A - 一种交联剂及其制备与在质谱交联技术中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种交联剂及其制备与在质谱交联技术中的应用，属生物技术研究与开发领域。本发明提供一种交联剂及其制备方法以及其在质谱交联技术中的应用。利用该交联剂本发明提供了一种肽段分析的策略，提出了一种解析质谱交联肽段的方法；本发明提供的交联剂与蛋白交联后，没有任何副产物产生；提供的交联剂含有可富集的官能团；交联剂具有在CID模式下保持稳定，但能够在HCD模式下具有质谱可断裂性的特征；本发明提供的解析质谱交联肽段的策略，可以极大的减少数据处理时间并提高数据分析处理的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种交联剂及其制备与在质谱交联技术中的应用，属生物技术研究与开发领域。
背景技术
质谱交联技术是近些年发展起来的新技术，它是通过化学交联的方法，将蛋白质中距离接近、存在相互作用的位点进行共价连接，然后结合质谱技术进行交联肽段分析，以便全面了解生物体内目标功能体系的蛋白结构与相互作用信息。在该技术中，如何设计并使用交联剂对后续的处理和结果有非常大的影响。
为了解决从大量的数据中有效的提取并解读交联肽段的信息，新的交联剂及计算方法不断发展，尤其是质谱条件下可解离的交联剂以及亲和标签的引入可以大大提高数据处理的效率。本发明提供一种新的交联剂，它是一种可富集且质谱可断裂型交联剂；它在一般碰撞诱导中保持稳定(collision-induced dissociation，CID)，但能够在高能碰撞诱导下解离(high energy collision-induced dissociation，HCD)。同时利用该交联剂的这一特征，我们发展了一种新的数据分析策略，可以极大的提高数据处理效率。
发明内容
本发明的目的提供一类可富集且质谱可断裂型交联剂的制备及其在质谱交联技术中的应用。同时可解决如何从大量的数据中有效的提取并解读交联肽段的信息，提高数据处理效率的技术问题。
为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种交联剂，其化学结构如式(I)所示；
其中，X选自C,N。
优选地，交联剂包括化合物式I的盐或者溶剂合物。
优选地，所述化合物式I的盐设为钠盐或钾盐；所述化合物式I中乙烯基磺酰胺取代基位于磷酸基的邻位、间位或对位。
本发明提供一种交联剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将式II化合物与亚磷酸酯在催化剂、碱和溶剂下合成式III化合物；
步骤2：将步骤1合成的式III化合物与2-氯乙基磺酰氯在碱和溶剂下合成式IV；
步骤3：将步骤2合成的式IV合物进一步合成式Ⅰ化合物；
所述步骤1至步骤3中，X选自C，N，；Y选自卤族元素或三氟甲磺酸酯；R选自甲基、乙基、苄基。
优选地，所述交联剂具有在CID模式下保持稳定，但能够在HCD模式下质谱可断裂性的特征。
本发明提供的一种新的交联剂的制备。
本发明提供的一种交联剂在蛋白质交联反应中的应用。
本发明提供的一种交联剂在研究蛋白质结构或蛋白质相互作用中的应用。
本发明提供的一种交联剂在解析质谱交联肽段中的应用。
本发明提供了一种交联剂及其制备方法与在质谱交联技术中的应用。同时利用该交联剂本发明提供了一种策略，提出了一种解析质谱交联肽段的新方法。本发明提供的方法可以极大的提高数据处理效率。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的交联剂与蛋白交联后，没有任何副产物产生；本发明提供的交联剂含有可富集的官能团；本发明提供的交联剂具有在CID模式下保持稳定，但能够在HCD模式下具有质谱可断裂性的特征；本发明提供的解析质谱交联肽段的策略，可以极大的减少数据处理时间并提高数据分析处理的灵敏度。
附图说明
图1为本发明中涉及的交联剂与蛋白质交联后，交联肽段质谱图。
图2为本发明中涉及的交联剂与蛋白质交联后，数据处理流程。
图3为本发明中涉及化合物的结构式。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
本发明提供一种交联剂，其化学结构如式(I)所示；
其中，X选自C,N。
上述交联剂包括化合物式I的盐或者溶剂合物；化合物式I的盐设为钠盐或钾盐；上述化合物式I中乙烯基磺酰胺取代基位于磷酸基的邻位、间位或对位。
本发明提供一种交联剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将式II化合物与亚磷酸酯在催化剂、碱和溶剂下合成式III化合物；
步骤2：将步骤1合成的式III化合物与2-氯乙基磺酰氯在碱和溶剂下合成式IV；
步骤3：将步骤2合成的式IV合物进一步合成式Ⅰ化合物；
上述步骤1至步骤3中，X选自C，N，；Y选自卤族元素或三氟甲磺酸酯；R选自甲基、乙基、苄基。
上述交联剂具有在CID模式下保持稳定，但能够在HCD模式下质谱可断裂性的特征。
本发明提供的一种交联剂在蛋白质交联反应中的应用。
本发明提供的一种交联剂在研究蛋白质结构或蛋白质相互作用中的应用。
本发明提供的一种交联剂在解析质谱交联肽段中的应用。
实施例1
化合物pBVSP的制备
具体制备步骤如下：
步骤a：化合物2的合成：
将5-溴-1,3-苯二胺(1,200mg,1.07mmol)用THF(5mL)溶解于50mL微波反应管中，再依次加入碳酸铯(521mg,1.60mmol)，Pd(PPh3)4(58mg,0.05mmol)，亚磷酸二甲酯(147μL,1.60mmol)微波120℃，反应15mins。反相色谱(MeOH:H2O＝30％)分离得淡黄色固体I103mg，产率＝45％。1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ6.44(dd,J＝14.7,2.0Hz,2H),6.30(t,J＝2.1Hz,1H),3.71(s,3H),3.69(s,3H).13C NMR(126MHz,Methanol-d4)δ53.37,53.41,107.03,109.27,128.34,150.23,150.39.ESI-HRMS calcd for C8H14N2O3P[(M+H)+]:217.0737,found:217.0733；
步骤b：化合物3的合成
将化合物2(103mg,0.48mmol)用MeOH(4mL)溶解于10mL茄型瓶中，降温至0℃，缓慢滴加入三乙胺(533μL，3.84mmol)2-氯乙基磺酰氯(201μL,1.92mmol)后升温至室温反应5mins。反相色谱分离(MeOH:H2O＝40％)得淡黄色固体II 20mg，产率＝11％。1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ7.40(td,J＝2.1,0.6Hz,1H),7.23(d,J＝2.1Hz,1H),7.20(d,J＝2.1Hz,1H),6.69(d,J＝10.0Hz,1H),6.66(d,J＝10.0Hz,1H),6.26(d,J＝16.5Hz,2H),6.05(d,J＝9.9Hz,2H),3.77(s,3H),3.75(s,3H).13C NMR(126MHz,Methanol-d4)δ52.41,113.62,113.65,116.99,117.08,127.65,135.41,139.49,139.66.ESI-HRMS calcd forC12H18N2O7PS2[(M+H)+]:397.0288,found:397.0269；
步骤c：化合物pBVSP的合成：
将化合物3(20mg,0.05mmol)用6N HCl(1.5mL)溶解于10mL茄型瓶中，缓慢升温至90℃，反应24h。HPLC制备分离得淡黄色固体III 6.5mg，产率＝32％。1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ7.29(d,J＝4.4Hz,2H),7.27(s,1H),6.66(d,J＝10.0Hz,1H),6.62(d,J＝9.9Hz,1H),6.22(d,J＝16.5Hz,2H),5.99(d,J＝9.9Hz,2H).13C NMR(126MHz,Methanol-d4)δ114.10,118.77,128.70,136.85,139.92.ESI-HRMS calcd for C10H14N2O7PS2[(M+H)+]:368.9975,found:368.9964。
实施例2
pBVSP交联剂对蛋白BSA的交联：
将蛋白质BSA溶于PBS(pH＝7.4)缓冲溶液配成10mg/mL的溶液，将化合物pBVSP溶于H2O配成20mM的溶液。在一个15mL离心管中加入100μL的BSA溶液，然后加入40μL的小分子化合物pBVSP(30equiv)和9.86mL的PBS(pH＝7.4)缓冲溶液，在室温下振荡反应12小时。用过PallTMNanosep(3kDa Omega)除去小分子。
实施例3
pBVSP交联剂对E.coil细胞裂解液的交联：
化合物pBVSP(50mM，30μL)的水溶液加入到150μLE.coil裂解液(20mg/mL)的PBS(pH7.4，120uL)溶液中,所得混合物在室温下振荡反应30min。随后PallTMNanosep(3kDaOmega)除去小分子。
实施例4
蛋白样品处理：
所交联蛋白随后加入Tris-HCl(PH＝8.0)至最终浓度100mM,并采用还原烷基处理(先以20mM二硫苏糖醇56℃处理15分钟，随后以20mM碘代乙酰胺室温避光处理样品)。随后蛋白采用FASP(膜上酶解法)方法除去还原烷基化试剂。并加入Trypsin酶解(protein：enzyme＝50：1)过夜。酶解后的交联肽段随后采用Ti-IMAC(二氧化钛)方法富集含有磷酸化基团的肽段(即交联肽段)，除去非交联肽段。富集后的交联肽段采用自制的ZIPTIP C18小柱(Porous R2 beads)除盐并随后抽干，真空干燥。
实施例5
蛋白样品质谱数据处理及分析：
样品重新溶解在0.1％甲酸中，采用超高效液相-高分辨质谱(LC/MS/MS)方法分析。分析时，首先做一个survey scan确定信号的分子量，随后做一个高能HCD MS/MS scan(二级质谱)和一个低能CID scan(二级质谱)。在数据采集时，HCD的信号同CID信号相互独立。如果候选肽段序列正确，则二者的分值都高；当候选肽段的序列错误时，CID的分值很低。因此可以采用CID信号来独立验证HCD信号是否正确。数据处理采用图2所示方案。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种交联剂，其特征在于，其化学结构如式(I)所示；
其中，X选自C,N。
2.如权利要求1所述的一种交联剂，其特征在于：包括化合物式I的盐或者溶剂合物。
3.如权利要求2所述的一种交联剂，其特征在于：所述化合物式I的盐设为钠盐或钾盐；所述化合物式I中乙烯基磺酰胺取代基位于磷酸基的邻位、间位或对位。
4.一种交联剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将式II化合物与亚磷酸酯在催化剂、碱和溶剂下合成式III化合物；
步骤2：将步骤1合成的式III化合物与2-氯乙基磺酰氯在碱和溶剂下合成式IV；
步骤3：将步骤2合成的式IV合物进一步合成式Ⅰ化合物；
所述步骤1至步骤3中，X选自C，N，；Y选自卤族元素或三氟甲磺酸酯；R选自甲基、乙基、苄基。
5.如权利要求1-3中任一项所述的一种交联剂，其特征在于：具有可富集且质谱可断裂特征；所述交联剂具有在CID模式下保持稳定，但能够在HCD模式下质谱可断裂性的特征。
6.如权利要求1-3中任一项所述的一种交联剂在蛋白质交联反应中的应用。
7.如权利要求1-3中任一项所述的一种交联剂在研究蛋白质结构或蛋白质相互作用中的应用。
8.如权利要求1-3中任一项所述的一种交联剂在解析质谱交联肽段中的应用。
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