CN112684073A - 一种同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法。本发明的目的在于提供一种同时提取小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分的方法，收集服用小金胶囊后的动物血液，离心分离得到血清，采用正己烷对上述血清中的两种挥发性成分麝香酮和肉桂酸龙脑酯进行提取。本发明的目的还在于提供一种同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法，其包括采用上述提取方式进行提取和对提取后的样本采用气相色谱‑质谱联用分析仪检测分析两个步骤。

Description

一种同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的 方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法。

背景技术

小金胶囊是《中国药典》2015版一部收载的一种具有散结消肿，化瘀止痛之功效的中药，它由人工麝香、木鳖子、草乌、枫香脂、乳香、没药、五灵脂、当归、地龙、香墨等10味药材制备而成。为了阐明其治疗机理，申请人对该中药进行了大量物质基础和作用机理研究。其中，对中药经口服后，进入动物体内的化学成分及其代谢产物进行了系统研究，发现麝香酮和肉桂酸龙脑酯是小金胶囊代谢后进入到血液中的两个关键的原型代谢物，为了更好的研究小金胶囊的代谢情况，阐明其治疗机理，为后续用药等提供依据，如何进行麝香酮和肉桂酸龙脑酯的定量检测就显得尤为重要。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种同时提取小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分的方法，包括以下步骤：收集服用小金胶囊后的动物血液，离心分离得到血清，采用正己烷对上述血清中的两种挥发性成分麝香酮和肉桂酸龙脑酯进行提取。

优选的，提取步骤如下：在血清中加入正己烷，涡旋混合后离心，分离得到上清液，干燥，然后采用甲醇复溶，即得。

本发明的目的之二在于提供一种同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法，采用上述的提取方式进行提取，对复溶后的液体采用气相色谱-质谱联用分析仪检测分析。

优选地，检测分析时采用离子检测模式监测和不分流进样。

优选地，检测分析时的离子组为：麝香酮，85、97、125、209、238；肉桂酸龙脑酯，77、109、131、153、284。

优选地，检测分析时的升温程序为：初始温度200～240℃，维持1～3min，然后以25～35℃/min的速率升温至260～300℃，维持0.5～1.5min，溶剂延迟1～3min。

更优选地，检测分析时的升温程序为：初始温度220℃，维持2min，然后以30℃/min的速率升温至280℃，维持1min，溶剂延迟2min。

优选地，检测分析时的色谱柱为：HP-5MS色谱柱。

优选地，检测分析的条件如下：色谱柱：30m×0.25mm×0.50μm的HP-5MS色谱柱；载气：高纯氮气，恒流模式，流速为0.7mL/min；程序升温：220℃维持2min，然后以30℃/min的速率升温至280℃，维持1min，溶剂延迟,4min；不分流进样，进样口温度为250℃；传输线温度：270℃，电离方式：电喷雾电离源(ESI)，电离能量：70eV；离子源温度：250℃；四级杆温度：150℃。

优选地，检测分析时的升温程序为：初始温度70～90℃，然后以15～25℃/min的速率升温至260～300℃。

本发明采用正己烷对服用了小金胶囊后的动物血清进行提取，然后采用气相色谱-质谱联用分析仪检测分析，能够同时对挥发性成分麝香酮和肉桂酸龙脑酯进行提取和检测，麝香酮的回收率可以达到96％～104％，检出限能达到0.06μg/mL，肉桂酸龙脑酯的回收率可以达到98％～104％，检出限能达到0.03μg/mL，操作简便、快速、准确、灵敏度高重复性好。

附图说明

图1为本发明实施例2中检测分析图谱；其中a为空白血浆提取液中麝香酮的检测图谱，b为空白血浆提取液中肉桂酸龙脑酯的检测图谱；c为标准溶液中麝香酮的检测图谱，d为标准溶液中肉桂酸龙脑酯的检测图谱；e为灌胃批号1小金胶囊的某只大鼠血浆提取液中麝香酮的检测图谱，f为灌胃批号1小金胶囊的某只大鼠血浆提取液中肉桂酸龙脑酯的检测图谱。

图2为对比例1中采用不同提取溶剂时的检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

材料：

液-质联用级甲醇(美国Fisher Scientific)，三氯甲烷、正己烷、乙醇、乙酸乙酯，均为分析纯，购于上海Richjoint化学试剂公司，麝香酮内标(3-甲基麝香酮)购于上海Sunny Biotec公司，肉桂酸龙脑酯为实验室合成(纯度98％以上)，其结构经1H NMR，13CNMR及气质联用鉴定。吐温-80购于美国Sigma–Aldrich，小金胶囊由健民药业集团股份有限公司提供。

实施例1

精密称取麝香酮与肉桂酸龙脑酯标准品，用甲醇定容于5mL容量瓶中，得到1mg/mL的标准母液，保存于4℃冰箱中。麝香酮母液经甲醇稀释为系列工作溶液，浓度分别为5.08、15.24、30.48、40.64、81.28、101.60μg/mL。肉桂酸龙脑酯母液经甲醇稀释为系列工作溶液，浓度分别为7.59、22.77、45.54、60.72、121.44、151.80μg/mL。所有溶液在进气相色谱-质谱联用仪(气质联用仪)之前均需经0.22μm滤膜过滤。

在实验中，我们通过比较不同的色谱柱、采集方式、进样模式、程序升温等，对小金胶囊代谢物中两种挥发性成分的分离效果进行摸索，优化气质联用仪分析的色谱条件。为了达到快速准确定量分析目的，对气质联用分析系列条件摸索与优化如下：

1)色谱柱选择：

通过采用HP-5MS(30m，0.25mm，0.50μm)和Rtx-5MS(30m，0.25mm，0.25μm)两种不同粒径的色谱柱进行对比分析，结果显示，采用HP-5MS色谱柱，两种成分的分离效果最好，故选择HP-5MS色谱柱。

2)质谱条件优化

因实验中需对小金胶囊代谢物中两种挥发性成分的定量分析，为了排除其他成分的干扰，最终采集方式是选择离子检测模式监测(SIM)。因两种成分相对含量均较低，故采用不分流进样方式。

在气质联用分析过程中，程序升温对化合物的分离至关重要。我们进行了以20℃/min的升温速率，从80℃一直升至280℃，结果发现两种成分的出峰时间均超过7min。为了缩短分析时间，我们选取了较快的升温速率(30℃/min)。最终确定升温程序为初始温度220℃，维持2min，然后以30℃/min的速率升温至280℃，并维持1min，总运行时间为5min，溶剂延迟2min。

经过上述实验摸索，最终确定气相色谱-质谱联用分析仪检测分析时的条件如下所示：

色谱柱：30m×0.25mm×0.50μm的HP-5MS色谱柱；载气：高纯氮气，恒流模式，流速为0.7mL/min；程序升温：220℃维持2min，然后以30℃/min的速率升温至280℃，维持1min，溶剂延迟,4min；不分流进样，进样口温度为250℃；传输线温度：270℃，电离方式：电喷雾电离源(ESI)，电离能量：70eV；离子源温度：250℃；四级杆温度：150℃。驻留时间为100ms/ion，离子对信息如下表1所示：

表1为检测时的离子对信息

序号	保留时间(min)	化合物	分子量	结构式	选择离子组
						1	3.01	麝香酮	238.41	C<sub>16</sub>H<sub>30</sub>O	85,97,125,209,238
2	4.34	肉桂酸龙脑酯	284.39	C<sub>19</sub>H<sub>24</sub>O<sub>2</sub>	77,109,131,153,284

方法学验证结果如下：

麝香酮和肉桂酸龙脑酯的标准曲线、最低检测限、最低定量限结果如下表2所示：

表2标准曲线、最低检测线、最低定量限的检测结果

麝香酮和肉桂酸龙脑酯的日内精密度、日间精密度、重复性、稳定性结果如表3：

表3精密度及重复性、稳定性检测结果

麝香酮和肉桂酸龙脑酯的回收率结果如表4：

表4回收率检测结果

实施例2

小金胶囊胃液制备：拆开小金胶囊，小金胶囊内药粉。称取169.5g药粉，用1200mL水浸泡过夜，然后水蒸馏5h，收得的挥发油按体积比2：1与吐温80混合于250mL烧瓶中，加入蒸馏后的溶液至250mL。

动物实验：12只雌性SD大鼠(体重200±20g)，购于上海西普博克实验动物有限公司，饲养于特殊无菌动物房，环境温度25±2℃，相对湿度55±5％，12h光暗循环，给予标准饲料和饮水，7天适应性饲养后禁食不禁水12h，然后随机分为2组(小金胶囊组和对照组)，每组6只动物。小金胶囊组大鼠灌胃给予小金胶囊胃液10mL/kg，对照组大鼠灌胃给予0.2％的吐温80溶液，灌胃后1.5h，大鼠经腹腔注射10％的水合氯醛麻醉，剖开腹部，通过肝门静脉收集全血。

按照上述方法对两批次的小金胶囊样品灌胃给药后，同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分的含量，具体步骤如下：

S1，血浆处理：收集到的血液，经过4000rpm在4℃离心10min，分离出血清。取血清200μL，加入800μL正己烷，涡旋混合5min，然后在13000rpm转速4℃下离心10min，分离上清液，转至1.5mL的Ep管中，30℃下氮气吹干，然后加入100μL甲醇，涡旋混合5min复溶，在13000rpm转速、4℃下离心10min，取上清液，进气质联用系统分析。

S2，按照实施例1中最终确定的检测分析方法进行检测分析，检测结果分别如图1和表5所示，其中，图1中e、f为灌胃批号1小金胶囊的某只大鼠血清中麝香酮和肉桂酸龙脑酯的检测结果：

表5不同批次的小金胶囊样品灌胃后，大鼠血清中麝香酮和肉桂酸龙脑酯的检测结果的平均值

对比例1

取相同的含药血清200μL，加入800μL的提取溶剂(分别选用三氯甲烷、正己烷、乙醇、乙酸乙酯作为提取溶剂)，涡旋混合5min，然后在13000rpm转速4℃下离心10min，分离上清液，转至1.5mL的Ep管中，30℃下氮气吹干，然后加入100μL甲醇，涡旋混合5min复溶，在13000rpm转速、4℃下离心10min，取上清液，按照实施例1中最终确定的检测分析方法进行检测分析，测定峰面积大小，结果如图2所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时提取小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：收集服用小金胶囊后的动物血液，离心分离得到血清，采用正己烷对上述血清中的两种挥发性成分麝香酮和肉桂酸龙脑酯进行提取。

2.根据权利要求1所述的同时提取小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分的方法，其特征在于，提取步骤如下：在血清中加入正己烷，涡旋混合后离心，分离得到上清液，干燥，然后采用甲醇复溶，即得。

3.一种同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的提取方式进行提取，对复溶后的液体采用气相色谱-质谱联用分析仪检测分析。

4.根据权利要求3所述的同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法，其特征在于，检测分析时采用离子检测模式监测和不分流进样。

5.根据权利要求3～4任一项所述的同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法，其特征在于，检测分析时的离子组为：麝香酮，85、97、125、209、238；肉桂酸龙脑酯，77、109、131、153、284。

6.根据权利要求3～4任一项所述的同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法，其特征在于，检测分析时的升温程序为：初始温度200～240℃，维持1～3min，然后以25～35℃/min的速率升温至260～300℃，维持0.5～1.5min，溶剂延迟1～3min。

7.根据权利要求6所述的同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法，其特征在于，检测分析时的升温程序为：初始温度220℃，维持2min，然后以30℃/min的速率升温至280℃，维持1min，溶剂延迟2min。

8.根据权利要求3～4任一项所述的同时检测小金胶囊原型代谢物中两种挥发性成分含量的方法，其特征在于，检测分析时的色谱柱为：HP-5MS色谱柱。

9.根据权利要求3～4任一项所述的同时检测小金胶囊型代谢物中两种挥发性成分含量的方法，其特征在于，检测分析的条件如下：色谱柱：30m×0.25mm×0.50μm的HP-5MS色谱柱；载气：高纯氮气，恒流模式，流速为0.7mL/min；程序升温：220℃维持2min，然后以30℃/min的速率升温至280℃，维持1min，溶剂延迟2min；不分流进样，进样口温度为250℃；传输线温度：270℃，电离方式：电喷雾电离源ESI，电离能量：70eV；离子源温度：250℃；四级杆温度：150℃。

10.根据权利要求3～4任一项所述的同时检测小金胶囊型代谢物中两种挥发性成分含量的方法，其特征在于，检测分析时的升温程序为：初始温度70～90℃，然后以15～25℃/min的速率升温至260～300℃。

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