CN112683819A - 一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于锌离子浓度测量领域，具体为一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法。本方法实现了锌离子与锌试剂络合物持久的稳定性，在弱碱性条件和表面活性剂聚乙烯醇的作用下，得到络合物，在液体培养基中静置后得到稳定的蓝紫色络合物。该方法利用表面活性剂来保持反应产物的稳定性，克服了以往形成络合物条件苛刻、反应过程复杂、不环保等缺点，具有操作简单、节省时间、反应条件温和、准确性高的优点。
Description
技术领域
本发明属于锌离子浓度测量领域，具体为一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法。
背景技术
随着科技不断进步，人类对重金属的需求日益增加。重金属污染问题严重影响到了人类的健康，成为目前最主要的环境问题之一，重金属污染主要源于采矿、冶炼、电镀等相关行业的工业废水及生化污水的随意排放。目前，由于矿产开采、污水排放等导致中国受Zn、Cu、Cd等重金属污染的耕地近1600万公顷。锌离子作为传统的重金属之一，还是动植物的一种必要微量元素，锌不能被生物降解，只能发生各种形态之间的相互转化，且通过食物链富集，可引发人类健康危害，因此，对于锌元素各类形态的提取及研究具有重要意义。为了研究微生物对重金属的成矿能力，需要测定重金属离子的浓度变化，目前常用的方法有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、X射线荧光光谱法、原子荧光光谱法等，这些传统方法设备成本高、局限性大。锌离子浓度测定的一般化学方法有锌试剂分光光度法和EDTA滴定法，现有的化学方法对于LB培养基锌离子浓度的测定不够精确，实验误差比较高，因此，提供一种操作方法简单、试验数据精确、参考对比度高、试验方法高效快捷的在液体培养基中测定锌离子浓度的方法，此方法具有广泛的市场前景。
发明内容
针对现有技术的缺点和不足，本发明提供了一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法。本方法操作简单、反应温和、准确性高，克服了现有技术中过程复杂、局限性大、测定不够精确等缺点。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法，包括以下步骤：
(1)将含有重金属锌离子和菌株的LB液体培养基进行离心，静置后吸取上清液备用，作为试样；
(2)配置多种浓度梯度的试样，向各浓度梯度的试样中加入盐酸溶液，水浴加热后，取出冷却；
(3)在所述各浓度梯度的试样中加入酚酞指示液，用氢氧化钠溶液调节至溶液呈粉色；
(4)配置锌试剂溶液：称取锌试剂溶于无水乙醇中放置过夜，使其全部溶解，并贮于棕色瓶中；
(5)向步骤(3)所述各浓度梯度的试样中加入缓冲溶剂和锌试剂溶液，静置后，再加入明胶和聚乙烯醇，用水稀释至锌试剂颜色无法遮蔽络合物颜色为止；
(6)放置后，在620nm处测定所述各浓度梯度的试样稀释后的吸光度，并绘制浓度曲线图；
(7)根据吸光度来计算锌离子浓度，其公式如下：
锌离子浓度＝(吸光度-0.0045)/0.0028。
进一步，所述步骤(1)中离心的转速为8000r/min，离心的时间为5～10min。不同浓度梯度的试样的离心最佳时间不同，离心可以去除吸附有重金属锌离子的菌株，因此，吸附效果好的试样离心时间长。
进一步，所述步骤(2)中各浓度梯度的试样浓度分别为300、500、700、1000、2000mg/Kg，盐酸溶液的浓度为0.05mol/L，水浴加热的温度为50℃，水浴加热的时间为3～5min。设定不同浓度梯度的试样是为了更好地观察此方法对不同锌离子浓度的测定效果。盐酸可以保持锌离子呈离子状态，实验发现浓度为0.05mol/L的盐酸溶液保持锌离子状态的效果最好，水浴可以挥发没有被消耗完的盐酸。对于低浓度的试样，盐酸剩余量多，所以水浴时间久一点。
进一步，所述步骤(3)中酚酞用胶头滴管滴2～3滴，约50微升，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.05mol/L。酚酞在pH＝8时开始变色，在pH＝8.5时锌试剂与锌离子形成络合物，所以显色剂选择酚酞最佳。低浓度的氢氧化钠溶液调节pH值容易影响试样的浓度，实验证明0.05mol/L的浓度效果最佳。
进一步，所述步骤(4)中锌试剂为0.5g，无水乙醇为500mL。锌试剂浓度过高容易影响观察络合物的颜色，实验证明此浓度效果最佳。
进一步，所述步骤(5)中缓冲溶剂为0.05mol/L的磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液，静置时间为2min，各浓度梯度的试样、缓冲溶剂、锌试剂、明胶和聚乙烯醇的体积比为2：1：3：1：1。缓冲溶剂可以促进溶液pH的稳定，磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液稳定pH值的范围是6～9。明胶与聚乙烯醇可以保持络合物的稳定性，实验证明在此体积比下络合物的吸光度最大。
进一步，所述步骤(6)中放置的时间为35～55min。在35～55min后，络合物最稳定，由图1可知在120min前测定吸光度效果最好。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.络合物稳定性的时间大幅度提高；
2.本方法应用浓度范围更加广，高浓度也可以准确测定；
3.测定环境不再局限于水溶液，液体培养基也可以准确测定；
4.此方法原理步骤简单，操作过程方便。
附图说明
图1为各浓度梯度的试样形成蓝色络合物的稳定性变化曲线；
图2为各浓度梯度的试样在LB液体培养基中稳定存在的状态；
图3为本发明测定锌离子浓度的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
准备实验设备：搅拌装置，锥形瓶，一次性滴管，移液枪，电子天平，玻璃棒，恒温摇床，离心管，酶标仪，离心机。
准备实验物料：蒸馏水，聚乙烯醇，明胶，无水乙醇，氢氧化钠，硫酸锌，磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液，酚酞，盐酸溶液，酵母粉，氯化钠，蛋白胨。
(1)①将0.25g硫酸锌加入到100mL蒸馏水中充分溶解，制备成浓度为10000mg/Kg的锌离子溶液。称取5g酵母粉、10g氯化钠、10g蛋白胨配置1L的LB液体培养基，对锌离子溶液与液体培养基高压蒸汽灭菌。冷却后，量取200mL液体培养基放入到容量为500mL的锥形瓶中，挑取抗重金属菌株的单菌落于锥形瓶中，在37℃恒温摇床，转速为120r/min培养2d，制备成抗性菌株的种子液。
②在超净工作台中配置不同锌离子浓度梯度的试样。使用移液枪吸取浓度为10000mg/Kg的锌离子溶液3mL、5mL、7mL、10mL、20mL分别加到五个灭菌的容量为200mL的空锥形瓶中，在每个锥形瓶中加入10mL抗性菌株的种子液，用LB液体培养基把每个锥形瓶定容到100mL的刻度线，配置锌离子浓度分别为300、500、700、1000、2000mg/Kg的试样，在37℃恒温摇床，转速为120r/min培养3d，观察菌株生长情况，并测定各个试样的锌离子浓度。
③取各浓度梯度的试样50mL加入离心管中，在4℃下，进行离心，转速为8000r/min，浓度为1000mg/Kg、2000mg/Kg的试样离心时间为10min，浓度为700mg/Kg的试样离心时间为7min，浓度为300mg/Kg、500mg/Kg的试样离心时间为5min，静置后吸取上清液备用，作为新的试样；
(2)取各浓度梯度的试样10mL置于容量为50mL的离心管中，向各浓度梯度的试样中加入0.05mol/L的盐酸溶液500微升，开始水浴加热，浓度为300mg/Kg、500mg/Kg的试样水浴5min，浓度为700mg/Kg的试样水浴4min，浓度为1000mg/Kg、2000mg/Kg的试样水浴3min，随后取出冷却；
(3)向所述各浓度梯度的试样中加入2滴酚酞指示液，约50微升，用0.05mol/L的氢氧化钠溶液调节至溶液呈粉色，此时是锌离子与锌试剂形成络合物的最佳状态。
(4)配置锌试剂溶液：称取0.5g锌试剂溶于500mL无水乙醇中放置过夜，使其全部溶解，并贮于棕色瓶中；
(5)吸取5mL浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲剂和15mL锌试剂加入到各浓度梯度的试样中，等待3min后，再加入5mL的明胶和5mL的聚乙烯醇，用水稀释可以防止锌试剂颜色遮蔽络合物颜色，稀释至体积为50mL；
(6)放置35min后，在620nm处测定所述各浓度梯度的试样稀释后的吸光度。
(7)根据吸光度来计算锌离子浓度，其公式如下：
锌离子浓度＝(吸光度-0.0045)/0.0028。
实施例2
(1)①将0.25g硫酸锌加入到100mL蒸馏水中充分溶解，制备成浓度为10000mg/Kg的锌离子溶液。称取5g酵母粉、10g氯化钠、10g蛋白胨配置1L的LB液体培养基，对锌离子溶液与液体培养基高压蒸汽灭菌。冷却后，量取200mL液体培养基放入到容量为500mL的锥形瓶中，挑取抗重金属菌株的单菌落于锥形瓶中，在37℃恒温摇床，转速为120r/min培养2d，制备成抗性菌株的种子液。
②在超净工作台中配置不同锌离子浓度梯度的试样。使用移液枪吸取浓度为10000mg/Kg的锌离子溶液3mL、5mL、7mL、10mL、20mL分别加到五个灭菌的容量为200mL的空锥形瓶中，在每个锥形瓶中加入10mL抗性菌株的种子液，用液体LB培养基把每个锥形瓶定容到100mL的刻度线，配置锌离子浓度分别为300、500、700、1000、2000mg/Kg的试样，在37℃恒温摇床，转速为120r/min培养3d，观察菌株生长情况，并测定各个试样的锌离子浓度。
③取各浓度梯度的试样50mL加入离心管中，在4℃下，进行离心，转速为8000r/min，浓度为1000mg/Kg、2000mg/Kg的试样离心时间为10min，浓度为700mg/Kg的试样离心时间为7min，浓度为300mg/Kg、500mg/Kg的试样离心时间为5min，静置后吸取上清液备用，作为新的试样。
(2)取各浓度梯度的试样10mL置于容量为50mL的离心管中，向各浓度梯度的试样中加入0.05mol/L的盐酸溶液500微升，开始水浴加热，浓度为300mg/Kg、500mg/Kg的试样水浴5min，浓度为700mg/Kg的试样水浴4min，浓度为1000mg/Kg、2000mg/Kg的试样水浴3min，随后取出冷却。
(3)向所述各浓度梯度的试样中加入2滴酚酞指示液，约50微升，用0.05mol/L的氢氧化钠溶液调节至溶液呈粉色，此时是锌离子与锌试剂形成络合物的最佳状态。
(4)配置锌试剂溶液：称取0.5g锌试剂溶于500mL无水乙醇中放置过夜，使其全部溶解，并贮于棕色瓶中。
(5)吸取5mL浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲剂和15mL锌试剂加入到各浓度梯度的试样中，等待3min后，再加入5mL的明胶和5mL的聚乙烯醇，用水稀释可以防止锌试剂颜色遮蔽络合物颜色，稀释至体积为50mL。
(6)放置45min后，在620nm处测定所述各浓度梯度的试样稀释后的吸光度。
(7)根据吸光度来计算锌离子浓度，其公式如下：
锌离子浓度＝(吸光度-0.0045)/0.0028。
实施例3
(1)①将0.25g硫酸锌加入到100mL蒸馏水中充分溶解，制备成浓度为10000mg/Kg的锌离子溶液。称取5g酵母粉、10g氯化钠、10g蛋白胨配置1L的LB液体培养基，对锌离子溶液与液体培养基高压蒸汽灭菌。冷却后，量取200mL液体培养基放入到容量为500mL的锥形瓶中，挑取抗重金属菌株的单菌落于锥形瓶中，在37℃恒温摇床，转速为120r/min培养2d，制备成抗性菌株的种子液。
②在超净工作台中配置不同锌离子浓度梯度的试样。使用移液枪吸取浓度为10000mg/Kg的锌离子溶液3mL、5mL、7mL、10mL、20mL分别加到五个灭菌的容量为200mL的空锥形瓶中，在每个锥形瓶中加入10mL抗性菌株的种子液，用液体LB培养基把每个锥形瓶定容到100mL的刻度线，配置锌离子浓度分别为300、500、700、1000、2000mg/Kg的试样，在37℃恒温摇床，转速为120r/min培养3d，观察菌株生长情况，并测定各个试样的锌离子浓度。
③取各浓度梯度的试样50mL加入离心管中，在4℃下，进行离心，转速为8000r/min，浓度为1000mg/Kg、2000mg/Kg的试样离心时间为10min，浓度为700mg/Kg的试样离心时间为7min，浓度为300mg/Kg、500mg/Kg的试样离心时间为5min，静置后吸取上清液备用，作为新的试样。
(2)取各浓度梯度的试样10mL置于容量为50mL的离心管中，向各浓度梯度的试样中加入0.05mol/L的盐酸溶液500微升，开始水浴加热，浓度为300mg/Kg、500mg/Kg的试样水浴5min，浓度为700mg/Kg的试样水浴4min，浓度为1000mg/Kg、2000mg/Kg的试样水浴3min，随后取出冷却。
(3)向所述各浓度梯度的试样中加入2滴酚酞指示液，约50微升，用0.05mol/L的氢氧化钠溶液调节至溶液呈粉色，此时是锌离子与锌试剂形成络合物的最佳状态。
(4)配置锌试剂溶液：称取0.5g锌试剂溶于500mL无水乙醇中放置过夜，使其全部溶解，并贮于棕色瓶中。
(5)吸取5mL浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲剂和15mL锌试剂加入到各浓度梯度的试样中，等待3min后，再加入5mL的明胶和5mL的聚乙烯醇，用水稀释可以防止锌试剂颜色遮蔽络合物颜色，稀释至体积为50mL。
(6)放置55min后，在620nm处测定所述各浓度梯度的试样稀释后的吸光度。
(7)根据吸光度来计算锌离子浓度，其公式如下：
锌离子浓度＝(吸光度-0.0045)/0.0028。
如图1所示，浓度为300、500、700、1000、2000mg/Kg的试样在620nm处吸光度与时间的关系图中，在35min后，各浓度梯度的试样所形成的络合物稳定性开始平稳，且此稳定性可以保持1h以上。放置35～55min，各浓度梯度的试样络合物处于稳定状态，在放置55～120min的时间内，任一时间测定的吸光度都是相同的。与现有技术相比，本发明所形成的络合物稳定性时间更久，在络合物稳定的时间段内测定吸光度，结果更加准确，因此适用的浓度范围也更加广泛。如图2所示，为各浓度梯度的试样形成稳定络合物的实物图，此方法对不同浓度试样的反应，差异性明显，说明此方法对高浓度的样品也适合，改进了现有技术此处的不足。如图3所示，标准曲线相关性较好，测定锌离子浓度数值准确性高。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而并非对其进行限制，凡未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的范围内。
Claims (7)
1.一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将含有重金属锌离子和菌株的LB液体培养基进行离心，静置后吸取上清液备用，作为试样；
(2)配置多种浓度梯度的试样，向各浓度梯度的试样中加入盐酸溶液，水浴加热后，取出冷却；
(3)在所述各浓度梯度的试样中加入酚酞指示液，用氢氧化钠溶液调节至溶液呈粉色；
(4)配置锌试剂溶液：称取锌试剂溶于无水乙醇中放置过夜，使其全部溶解，并贮于棕色瓶中；
(5)向步骤(3)所述各浓度梯度的试样中加入缓冲溶剂和锌试剂溶液，静置后，再加入明胶和聚乙烯醇，用水稀释至锌试剂溶液颜色无法遮蔽络合物颜色为止；
(6)放置后，在620nm处测定所述各浓度梯度的试样稀释后的吸光度，并绘制浓度曲线图；
(7)根据吸光度来计算锌离子浓度，其公式如下：
锌离子浓度＝(吸光度-0.0045)/0.0028。
2.根据权利要求1所述的一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法，其特征在于：所述步骤(1)中离心的转速为8000r/min，离心的时间为5～10min。
3.根据权利要求1所述的一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法，其特征在于：所述步骤(2)中各浓度梯度的试样的浓度分别为300、500、700、1000、2000mg/Kg，所述盐酸溶液的浓度为0.05mol/L，所述水浴加热的温度为50℃，水浴加热的时间为3～5min。
4.根据权利要求1所述的一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法，其特征在于：所述步骤(3)中酚酞指示液用胶头滴管滴2～3滴，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.05mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法，其特征在于：所述步骤(4)中锌试剂为0.5g，无水乙醇为500mL。
6.根据权利要求1所述的一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法，其特征在于：所述步骤(5)中缓冲溶剂为0.05mol/L的磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液，所述静置的时间为2min，所述各浓度梯度的试样、缓冲溶剂、锌试剂溶液、明胶和聚乙烯醇的体积比为2:1:3:1:1。
7.根据权利要求1所述的一种在液体培养基中测定锌离子浓度的方法，其特征在于：所述步骤(6)中放置的时间为35～55min。
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