CN112675297A - 针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合及其设计方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合及其设计方法，设计方法包括如下步骤：收集靶向药物耐药突变数据；截取耐药突变多肽序列截取及预测MHC分子亲和力及免疫原性；靶向药物与耐药位点相互关系及药物聚类；人工设计相对应的疫苗多肽序列；通过这样的设计方法得到的靶向药物联合多肽疫苗组合能够覆盖常见的靶向治疗药物，可以有效降低肿瘤耐药发生概率，延长靶向药有效作用时间，增加患者的疾病响应率，具有广谱性，缩短个体化多肽疫苗从分析到治疗的时间，降低医疗成本。

Description

针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽 疫苗组合及其设计方法
本案是申请号为：201910086371.9，发明名称为：针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗及其设计方法的专利的分案。
技术领域
本发明涉及肿瘤疫苗领域，特别是一种针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗及其设计方法。
背景技术
近年来,肿瘤靶向治疗的进展随着分子生物学技术的发展和对发病机制从细胞、分子水平的进一步认识已经进入了一个全新的时代。这些领域的进展很快，迄今为止，很多靶向药物已经在临床起了极其重要甚至是奇迹般的作用。分子靶向治疗已成为外科、放化疗等肿瘤治疗的又一重要手段，在肿瘤治疗中发挥着越来越重要的作用。由于靶向治疗的高效率和低毒性，与传统的治疗和化疗相比，其优点是很明显的。靶向治疗发展迅速，有些已经按照循证医学的原则进入了国际肿瘤学界公认的标准治疗方案和规范。更多、更有希望的药物也在快马加鞭地研制和早期临床试验中。靶向药已成肿瘤治疗的一大利器。但是，随着治疗时间越来越长，多数患者出现耐药。至于耐药的具体机制，目前主要有3种。首先，通过基因突变产生耐药。基因检测阳性的患者约40％的基因会由原来基因产生新的基因，这会导致对原来的药物不敏感，从而产生耐药反应。其次，狡猾的癌细胞常常会“明修栈道暗度陈仓”，绕弯走另外一条路。这种情况在耐药患者中约占20％左右。除了以上两种耐药途径，剩下30％左右的患者的耐药机制，尚不明确。靶向后的“变身”(耐药)是不可避免的，几乎所有的靶向药物治疗都会出现耐药现象，其根本原因是由于癌细胞的异质性以及动态变化。目前一种靶向药物是针对癌细胞的某一个蛋白、某一个分子起作用，所以只能抑制肿瘤生长的一条通路而已。当一条通路受到抑制时，肿瘤细胞会自寻新的“生路”，选择其他通路合成自身生长所需要的物质，久而久之，分子靶向药物就失去了作用，从而产生耐药性，比如EGFR突变患者服用靶向药后出现耐药，50％～60％是因为再次发生基因突变，大多数突变为T790M突变，此时患者可以使用第三代靶向药物如奥斯替尼。大多数患者在接受EGFR-TKI治疗后的8-14个月会出现继发耐药，如何解决靶向药物治疗的耐药问题成为研究的热点。
近年来，由于肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原的发现，以及人们对肿瘤诱导免疫应答和肿瘤逃避免疫监视机制的深入研究和理解，肿瘤多肽疫苗的研究已经取得了可喜的成就。新生抗原是基因突变导致的肿瘤细胞表面表达的异常蛋白，与常规抗原靶点不同的是新生抗原只在肿瘤细胞表面表达不在正常细胞表面表达且能被免疫系统识别并激活免疫系统。2017年7月13日，Nature杂志同一天发布了两项基于neoantigen的个性化肿瘤疫苗治疗恶性黑色素瘤的成功案例。德国的Carmen Loquai教授和
Figure BDA0002795076430000011
türeci教授，利用neoantigen所对应的RNA做疫苗，一共治疗了13例病人。同一天，哈佛大学的CatherineJ.Wu教授带领的团队，利用neoantigen所对应的抗原肽做疫苗，也成功报道了治疗恶性黑色素瘤的案例。耐药位点多肽疫苗的一般设计流程，是找出导致靶向药物耐药的突变位点，分析出这些突变产生的新生抗原，制备能够被患者组织相容性复合体(MHC)特异识别的多肽疫苗，多肽制备既可以通过化学合成的方式获得，也可以使用核酸分子(例如DNA和RNA)通过转录和翻译的方式获得，或者也可以通过细菌或病毒为载体表达得到。将多肽疫苗注入患者体内，激活特异性T细胞应答和免疫风暴，使患者自身免疫系统能够有效识别、杀灭这一类带有耐药突变的肿瘤细胞。将多肽疫苗与靶向药联用一方面靶向药物可以对携带用药靶点的肿瘤细胞起到杀伤作用另一方面多肽疫苗激活的机体免疫系统可以在在耐药肿瘤细胞刚刚出现时就进行有效的识别并清除，从而延长靶向药物的作用时间，而且激活的免疫系统可以在体内长期保持对肿瘤细胞的杀伤作用，确保对耐药现象有持续的抑制性，在一定程度上克服由于耐药突变产生的靶向药物耐药性。市场需要一套针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗筛选和设计方法，可以有效降低肿瘤耐药发生概率，具有广谱性，缩短个体化多肽疫苗从分析到治疗的时间，降低医疗成本；本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗及其设计方法，提供的靶向药物联合多肽疫苗组合方案覆盖常见的靶向治疗药物，可以有效降低肿瘤耐药发生概率，延长靶向药有效作用时间，增加患者的疾病响应率，具有广谱性，缩短个体化多肽疫苗从分析到治疗的时间，降低医疗成本。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合，阿比特龙的多肽疫苗组合针对如下突变：AR-T878A，AR-T878S；AR-T878A的序列为：PIARELHQFAFDLLIKSHMKK；AR-T878S的序列为：PIARELHQFSFDLLIKSHM；恩扎鲁胺的多肽疫苗组合针对如下突变：AR-F877L，AR-T878A；AR-F877L的序列为：VQPIARELHQLTFDLLIKSHMK；AR-T878A的序列为：PIARELHQFAFDLLIKSHMKK；氟他胺的多肽疫苗组合针对如下突变：AR-T878A，AR-T878S，AR-V716M；AR-T878A的序列为：PIARELHQFAFDLLIKSHMKK；AR-T878S的序列为：PIARELHQFSFDLLIKSHM；AR-V716M的序列为：NELGERQLVHMVKWAKALPGF；酮康唑的多肽疫苗针对如下突变：AR-T878A；AR-T878A的序列为：PIARELHQFAFDLLIKSHMKK。
针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合的设计方法，包括如下步骤：寻找靶向药物耐药突变数据的数据；截取耐药突变多肽序列及预测MHC分子亲和力及免疫原性：对于点突变截取覆盖突变位点上下游16个氨基酸的多肽序列，对于移码突变截取向前延伸16个长度的氨基酸、向后延伸直到终止密码子的多肽序列作为耐药突变位点的突变型多肽，同时截取相应位置对应的野生型多肽序列，用至少一个数据库作为来源统计高频HLA分型及频率，将统计出的HLA合并去重之后作为用于预测的候选HLA分型，使用多款软件分析这些突变位点对应的多肽与HLA分子结合亲和力，综合多款软件将亲和力分为三类：强亲和力-SB、弱亲和力-WB和无亲和力，并与相对野生型多肽比较确定其亲和力变化，A类变化为由无亲和力变为有强亲和力，B类变化为由无亲和力变为弱亲和力，C类变化为由弱亲和力变为强亲和力，D类变化为无变化，内部排序认为A类优于B类优于C类优于D类，使用免疫原性预测工具预测其免疫原性，保留突变型多肽亲和力强、亲和力变化大并且免疫原性强的表位；靶向药物与耐药位点相互关系及药物聚类：对耐药位点亲和力打分：综合考虑位点有亲和力的表位个数及各表位亲和力变化大小，对A、B、C、D四类不同亲和力变化给予相对应的权重，根据每个表位对应的HLA频率大小给予权重,将位点的各表位累加求和；
Figure BDA0002795076430000021
AC：亲和力变化大小，A、B、C、D四类不同亲和力变化给予不同的权重；Fhla：对应的HLA频率；n：位点的各表位个数；综合分析靶向药物和耐药位点间相互关系结合靶向药物作用机制对靶向药物聚类从而将其分为7类：
第一类针对SMO突变产生耐药的Hedgehog信号通路拮抗剂维莫德吉，第二类针对BTK突变产生耐药的依鲁替尼，第三类针对AR耐药突变的一些抗雄激素类药物如阿比特龙等，第四类针对BRAF耐药突变的一些菲尼类药物，第五类针对ALK、MET等融合基因的一些络氨酸激酶抑制剂，第六类针对EGFR通路的络氨酸激酶抑制剂，第七类针对PI3K/AKT/mTOR通路的依维莫司等激酶抑制剂；
设计相对应的疫苗多肽序列。
前述的针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合的设计方法，截取耐药突变多肽序列及预测MHC分子亲和力及免疫原性：对于点突变截取覆盖突变位点上下游16个氨基酸的多肽序列，对于移码突变截取向前延伸16个长度的氨基酸、向后延伸直到终止密码子的多肽序列作为耐药突变位点的突变型多肽，同时截取相应位置对应的野生型多肽序列，用至少一个数据库作为来源统计高频HLA分型及频率，将统计出的HLA合并去重之后作为用于预测的候选HLA分型，所述数据库包括：公共数据库，临床患者数据库，使用多款软件分析这些突变位点对应的多肽与HLA分子结合亲和力，综合多款软件将亲和力分为三类：强亲和力-SB、弱亲和力-WB和无亲和力，并与相对野生型多肽比较确定其亲和力变化，所述多款软件包括：netMHCpan、netMHC及Pickpocket这三款软件，A类变化为由无亲和力变为有强亲和力，B类变化为由无亲和力变为弱亲和力，C类变化为由弱亲和力变为强亲和力，D类变化为无变化，内部排序认为A类优于B类优于C类优于D类，使用免疫原性预测工具预测其免疫原性，保留突变型多肽亲和力强、亲和力变化大并且免疫原性强的表位。
前述的针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合的设计方法，使用cytoscape对所有的靶向药物及耐药位点作网络图，耐药位点的大小代表其亲和力得分数，综合分析靶向药物和耐药位点间相互关系结合靶向药物作用机制对靶向药物聚类从而将其分为7类：第一类针对SMO突变产生耐药的Hedgehog信号通路拮抗剂维莫德吉，第二类针对BTK突变产生耐药的依鲁替尼，第三类针对AR耐药突变的一些抗雄激素类药物如阿比特龙等，第四类针对BRAF耐药突变的一些菲尼类药物，第五类针对ALK、MET等融合基因的一些络氨酸激酶抑制剂，第六类针对EGFR通路的络氨酸激酶抑制剂，第七类针对PI3K/AKT/mTOR通路的依维莫司等激酶抑制剂。
本发明的有益之处在于：
本发明提供的靶向药物联合多肽疫苗组合方案覆盖常见的靶向治疗药物；对比单独的靶向治疗，可以有效降低肿瘤耐药发生概率，延长靶向药有效作用时间；对比单独的多肽疫苗，我们提供的方案增加患者的疾病响应率；
无需经过患者遗传信息测序、专门测定患者HLA分型，具有一定的广谱性，大大缩短个体化多肽疫苗从分析到治疗的时间，降低医疗成本；另外多肽疫苗也产生毒副作用；
多肽疫苗本身可以保持长期的肿瘤杀伤效果，疫苗肽在体内被酶切成短多肽并MHC分子递呈出去被TCR识别，可以刺激机体产生特异性杀伤性T细胞和记忆T细胞，识别并清除携带突变的细胞，并且这种效果在体内可以长期保持；
提供了31个靶向药物的多肽疫苗，基本覆盖常见肿瘤靶向药物；
将靶向药物根据其机制和耐药突变聚类分析归为7大类，多靶点联合可以有效增加多肽疫苗对肿瘤细胞的杀伤效果，显著延长靶向药物有效作用时间。
附图说明
图1是本发明的靶向药物和耐药位点相互作用图；原点代表靶向药物，三角形代表耐药位点，三角形大小表示该位点对应多肽的亲和力得分，大圆圈将网络图分为7个部分，代表7个产品；
图2是本发明实验1的A-D的阴性对照和137条肽段的ELISPOT斑点数图；
图3是本发明实验2-1的各组的效应T细胞杀伤效率示意图；
图4是本发明实验2-2的各组的效应T细胞杀伤效率示意图；
图5是本发明实验2-3的各组的效应T细胞杀伤效率示意图；
图6是本发明实验2-4的各组的效应T细胞杀伤效率示意图；
图7是本发明实验2-5的各组的效应T细胞杀伤效率示意图；
图8是本发明实验2-6的各组的效应T细胞杀伤效率示意图；
图9是本发明实验2-7的各组的效应T细胞杀伤效率示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗的设计方法，包括如下步骤：
1、靶向药物耐药突变数据收集：人类癌症相关体细胞突变目录Cosmic(数据库官网https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)对临床研究中的获得性耐药和原发性耐药的报道进行了整理和注释，包括基因、突变、药物，癌种及参考文献等信息。我们下载了FDA或者CFDA已批准的或处于临床试验III/IV期的所有靶向治疗药物耐药突变位点，对所有候选靶向药物和耐药突变尤其是支持的样本量较少的突变，进一步查找文献确定其可靠性，确定真正全面可靠的靶向药物耐药位点用于下游分析，例如cosmic收录有一条确定EGFR-T790M突变是奥斯替尼耐药位点的报道，但经过查找文献发现T790M不是奥斯替尼的耐药位点。
2、耐药突变多肽序列截取及MHC分子亲和力及免疫原性预测：
2.1、对于点突变截取覆盖突变位点上下游16个氨基酸的多肽序列，对于移码突变截取向前延伸16个长度的氨基酸、向后延伸直到终止密码子的多肽序列作为耐药突变位点的突变型多肽，同时截取相应位置对应的野生型多肽序列。
2.2、统计高频HLA分型及频率：高频HLA的来源主要有两部分，一是来自公共数据库的统计(IMGT/HLA及中华骨髓库)，结合近年文献报道的信息，汇总了中国人群比较常见的HLA等位基因分型；二是从临床患者的数据库中统计了出现频率比较高的一组HLA分型，具体的数据库如表2所示。将两组HLA合并去重之后作为用于预测的候选HLA分型。需要说明的是，数据库的选择不受限制，这只是一种优选实施例，也可以是其他几种数据库的组合统计。
2.3、我们使用netMHCpan、netMHC及Pickpocket三款软件分析了这些突变位点对应的多肽与2.2步中得到的HLA分子结合亲和力综合三款软件将亲和力分为三类(强亲和力-SB、弱亲和力-WB和无亲和力)，并与相对野生型多肽比较确定其亲和力变化(由无亲和力变为有强亲和力定义为A类变化、由无亲和力变为弱亲和力定义为B类变化、由弱亲和力变为强亲和力定义为C类变化、其它无变化的定义为D类变化，内部排序认为A类优于B类优于C类优于D类)，另外还使用IEDB提供的免疫原性预测工具预测其免疫原性，保留突变型多肽亲和力强、亲和力变化大并且免疫原性强的表位，共筛选得到31种靶向药物对应的137个耐药突变。
3、靶向药物与耐药位点相互关系及药物聚类：3.1对耐药位点亲和力打分：综合考虑位点有亲和力的表位个数及各表位亲和力变化大小(a.对A、B、C、D四类不同亲和力变化给予不同的权重，b.根据每个表位对应的HLA频率大小给予权重,c.将位点的各表位累加求和)。
Figure BDA0002795076430000031
Figure BDA0002795076430000032
AC：亲和力变化大小，A、B、C、D四类不同亲和力变化给予不同的权重；Fhla：对应的HLA频率；n：位点的各表位个数；
3.2使用cytoscape对所有的靶向药物及耐药位点作网络图(如图1)，耐药位点的大小代表其亲和力得分数，综合分析靶向药物和耐药位点间相互关系结合靶向药物作用机制对靶向药物聚类从而将其分为7类如图1所示。第一类针对SMO突变产生耐药的Hedgehog信号通路拮抗剂维莫德吉，第二类针对BTK突变产生耐药的依鲁替尼，第三类针对AR耐药突变的一些抗雄激素类药物如阿比特龙等，第四类针对BRAF耐药突变的一些菲尼类药物，第五类针对ALK、MET等融合基因的一些络氨酸激酶抑制剂，第六类针对EGFR通路的络氨酸激酶抑制剂，第七类针对PI3K/AKT/mTOR通路的依维莫司等激酶抑制剂。由于以上靶向药物聚类综合考虑了药物作用机制和与耐药位点之间的相互关系，将有相似作用机制和交叉耐药位点的靶向药物聚为一类，从而最大化的覆盖靶向药物的有免疫原性的耐药位点，并且可以显著降低由于患者自身HLA分子差异导致的“脱靶”现象，从而使得多肽疫苗可以最大范围内的对有类似耐药突变的肿瘤细胞起到杀伤作用，相对单药疫苗显著提高了其有效性。
4、多肽疫苗序列设计：作为一种实施例，可以通过人工设计相对应的疫苗多肽序列，也可以输入我们自主研发的疫苗设计程序iNeo-VaDes(V1.2)，设计多肽疫苗序列。作为一种针对靶向药物耐药的多肽疫苗疗法，在疫苗多肽设计过程中，本发明考虑了抗原表位分布，尽可能多的覆盖含有突变位点的表位，另外还考虑多肽的长度、疏水率等影响氨基酸合成效率的因素，以及多肽的毒性、同源性等影响多肽安全性的因素。本发明的疫苗多肽组合由包含以下137个突变的多肽序列组成，具体如下表1所示。5、疫苗制备：多肽疫苗的制备既可以直接使用化学合成的方式制备，也可以使用核酸分子(例如DNA和RNA)通过转录和翻译的方式获得，或者也可以通过细菌或病毒为载体表达得到。在本例中我们使用化学合成方式获得多肽疫苗。
表1：靶向药物耐药突变及多肽疫苗序列
Figure BDA0002795076430000033
表2：临床患者的数据库：
Figure BDA0002795076430000041
Figure BDA0002795076430000051
△本发明提供了31个靶向药物的多肽疫苗，基本覆盖常见肿瘤靶向药物，用以下实验对各个多肽的免疫原性进行实验验证：
实验1，多肽的免疫原性测定；实验目的：通过ELISpot实验，验证本发明中7个产品对应的多肽在人源化小鼠体内均能引起免疫反应。实验方法：实验多肽：7个产品多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成，多肽纯度均大于90％，内毒素含量低于0.5EU/mg。为了检测多肽的免疫反应，实施IFN-γ酶联免疫吸附(ELISPOT)测定法。详细的实验过程如下：选用8周龄人源化小鼠B-NSG(CD34+)24只，随机分为8组，每组3只。适应一周后，分为多肽组1(对应产品1)、多肽组2(对应产品2)、多肽组3(对应产品3)……多肽组7(对应产品7)，共计7组及阴性对照组编号8。采用CpG为佐剂(0.2μg/只)，多肽50μg每只,再与弗氏不完全佐剂Freund’s adjuvant(FIA，Sigma-Aldrich)1：1混匀，乳化30分钟，PBS与弗氏不完全佐剂1：1混合乳化30分钟作为阴性对照，四次于颈背部右胸皮下免疫，总剂量0.5mL/只，1周一次，共三周，第三次免疫后10天，取的小鼠脾脏，制备小鼠淋巴细胞悬液，用于ELISPOT检测。ELISPOT检测结果中，IFN-γ呈阳性结果的多肽，即判定为阳性候选多肽。实验按组别分别进行单肽有ELISPOT试验，即将小鼠淋巴细胞稀释成浓度为1-2*106/mL，铺24孔板，每孔1mL，分为对照组(与多肽相同浓度的DMSO)、相应的单条多肽组，PHA阳性对照组编号(PHA组淋巴细胞来源于阴性对照组)，每个处理重复3次(即3个复孔)，分别加入相应的多肽(10μg/mL)，预孵育72h后离心分离细胞，调整细胞浓度为2*106/mL，上IFN-γElispot板，按照IFN-γELISPOT试剂盒的说明书方法进行显色，运用CTL-ImmunoSpotS5系列酶联斑点分析仪读取产生的斑点数。IFN-γ阳性结果表明有抗原特异性T细胞产生，视为多肽能引起机体的免疫反应，斑点数的多少反映其免疫的强弱。
实验结果：为了进一步明确了各个单独多肽的免疫反应，分别进行了各个多肽组中其相应的单肽的ELISPOT实验，各多肽产生的斑点数见图2A-D，各个均能引起免疫反应，但各个多肽产生的斑点差异比较大，从10个斑点到200多个斑点不等，而对照组基本无斑点产生。结果分析：本发明中7个产品对应的多肽在人源化小鼠体内均能引起免疫反应。
实验二，验证本发明中7类靶向药物的耐药多肽疫苗的治疗及预防效果；
为了验证本发明中胃癌耐药多肽疫苗的治疗及预防效果，因此需要构建一套含本发明中特定突变位点的稳转细胞系，针对7类靶向药物分别进行如下7个实施例的实验准备；实施例1，第一类针对SMO突变产生耐药的Hedgehog信号通路拮抗剂维莫德吉(Vismodegib)的特定突变位点的稳转细胞系的构建：Vismodegib购于LC Laboratories，胃癌细胞株系AGS购于ATCC，FITC-CD44购于BD公司(BD555478)。细胞的制备：胃癌细胞株系AGS于含有10％FBS,100U/mL penicillin和100μg/mL streptomycin，2mmol/L l-glutamine的DMEM培养48h，换液并补加20ng/mL of EGF,bFGF,N-2(1×),和B27，继续培养72h,促进其形成椭球体(“spheroid formation media”)。椭球体经Accutase(InnovativeCell Technologies)酶解形成单细胞，用FITC-CD44流式抗体进行分选出阳性细胞作为后续的转染细胞，记为CD44+-AGS。
实验目的：为了验证本发明中胃癌耐药多肽诱导的T细胞具有杀伤活性，因此需要构建一套含本发明中特定突变位点的稳转细胞系，能够表达递呈这些多肽。a.构建突变位点真核表达质粒：采用人工合成的方法获得能够表达本发明中突变的全部15条疫苗多肽的mini-gene，由以下几部分组成：信号肽部分(lysosome-associated membraneglycoprotein 1，LAMP1)，15条突变多肽和MHC class I trafficking domain(MITD)，15条突变多肽之间用柔性连接肽GGSGGGGSGG连接，基因进行密码子优化后，上游引入GATATC(EcoR V)，下游引入CTCGAG(Xho I)，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)中，命名为smo15-pcDNA3.1(+)。同时合成相应野生型多肽作为对照(由于其中相邻的多肽可归到一条野生型长肽，故总共有7条野生型多肽)，命名为smow7-pcDNA3.1(+)。所有基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成和构建，smo15的氨基酸序列为:SEQ ID：NO 6所示；Smow7的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 7所示；其中第1-28个氨基酸为信号肽区域，用加粗斜体表示；下划线标注部分为MITD序列；
b.构建能够稳定表达突变多肽的细胞系：胃癌细胞株系CD44+-AGS以2*105/孔种于6孔板，待细胞覆盖70-80％时开始转染。分别将2.5μg smo15-pcDNA3.1(+)质粒和smow7-pcDNA3.1(+)质粒2稀释于2份100μl无血清RPMI-1640培养基中，再分别加入2.5μl PLUSTMReagents，室温孵育5min后，分别与含有5μl LipofectamineTM LTX的无血清RPMI-1640 100μl体系混合，室温孵育30min。将脂质体质粒络合物分别滴加于2份含有1000μl无血清RPMI-1640的待转染细胞中，前后轻轻摇匀，静置6h后更换为含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48h后，换为含700μg/mL G418及400μg/mL潮霉素B的10％血清的培养基进行细胞筛选。抗性筛选10-14天，待对照组细胞全部死亡，转染组细胞大量生长，将细胞消化，采用有限稀释法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700μg/mL G418，400μg/mL潮霉素B的培养基继续培养，隔天换液。继续培养约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入24孔板培养。同时转染pcDNA3.1(+)-Hygro空载体质粒作同法抗性筛选，作为对照细胞，命名为CD44+-AGS(含有pcDNA3.1(+))。上述方法中，用smo15-pcDNA3.1(+)质粒和smow7-pcDNA3.1(+)质粒构建的细胞系分别命名为smo15-ASG(含有smo15-pcDNA3.1(+))和smow7-AGS(含有smow7-pcDNA3.1(+))。
实施例2，第二类针对BTK突变产生耐药的依鲁替尼Ibrutinib的特定突变位点的稳转细胞系的构建：Ibrutinib(依鲁替尼)购于Selleck Chemicals，人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226(
Figure BDA0002795076430000061
CCL-155TM)购于ATCC，培养于RPMI 1640培养基加10％的胎牛血清。
实验目的：为了验证本发明中耐药多肽诱导的T细胞具有杀伤活性，因此需要构建一套含本发明中特定突变位点的稳转细胞系，能够表达递呈这些多肽
a.构建突变位点真核表达质粒：采用人工合成的方法获得能够表达本发明中突变的全部5条疫苗多肽的mini-gene，由以下几部分组成：信号肽部分(lysosome-associatedmembrane glycoprotein 1，LAMP1)，5条突变多肽和MHC class I trafficking domain(MITD)，5条突变多肽之间用柔性连接肽GGSGGGGSGG连接，基因进行密码子优化后，上游引入GATATC(EcoR V)，下游引入CTCGAG(Xho I)，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)中，命名为BTK5-pcDNA3.1(+)。同时合成相应野生型多肽作为对照，命名为BTKw2-pcDNA3.1(+)(由于其中4条多肽为SNP位点突变，故总共有2条野生型多肽)。所有基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成和构建，
BTK5的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 8所示；BTKW2的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 9所示；其中第1-28个氨基酸为信号肽区域，用加粗斜体表示；下划线标注部分为MITD序列。
b.构建能够稳定表达突变多肽的细胞系：人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226以2*105/孔种于6孔板，待细胞覆盖70-80％时开始转染。分别将BTK5-pcDNA3.1(+)质粒和BTKw2-pcDNA3.1(+)质粒2稀释于2份100μl无血清RPMI-1640培养基中，再分别加入2.5μlPLUSTM Reagents，室温孵育5min后，分别与含有5μl LipofectamineTM LTX的无血清RPMI-1640 100μl体系混合，室温孵育30min。将脂质体质粒络合物分别滴加于2份含有1000μl无血清RPMI-1640的待转染细胞中，前后轻轻摇匀，静置6h后更换为含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48h后，换为含700μg/mL G418及400μg/mL潮霉素B的10％血清的培养基进行细胞筛选。抗性筛选10-14天，待对照组细胞全部死亡，转染组细胞大量生长，将细胞消化，采用有限稀释法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700μg/mL G418，400μg/mL潮霉素B的培养基继续培养，隔天换液。继续培养约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入24孔板培养。上述方法中，用BTK5-pcDNA3.1(+)质粒和BTKw2-pcDNA3.1(+)质粒构建的细胞系分别命名BTK5(含有BTK5-pcDNA3.1(+))和BTKw2(含有BTKw2-pcDNA3.1(+))。,
实施例3，第三类针对AR耐药突变的一些抗雄激素类药物如阿比特龙等的特定突变位点的稳转细胞系的构建；前列腺癌细胞系PC-3
(
Figure BDA0002795076430000062
CRL-1435TM)购于ATCC,培养于F-12K培养基加10％的胎牛血清。
实验目的：为了验证本发明中耐药多肽诱导的T细胞具有杀伤活性，因此需要构建一套含本发明中特定突变位点的稳转细胞系，能够表达递呈这些多肽。
a.构建突变位点真核表达质粒：采用人工合成的方法获得能够表达本发明中突变的全部4条疫苗多肽的mini-gene，由以下几部分组成：信号肽部分(lysosome-associatedmembrane glycoprotein 1，LAMP1)，4条突变多肽和MHC class I trafficking domain(MITD)，4条突变多肽之间用柔性连接肽GGSGGGGSGG连接，基因进行密码子优化后，上游引入GATATC(EcoR V)，下游引入CTCGAG(Xho I)，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)中，命名为AR4-pcDNA3.1(+)。同时合成相应野生型多肽作为对照，命名为ARw2-pcDNA3.1(+)(由于其中4条多肽为SNP位点突变，故总共有2条野生型多肽)。所有基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成和构建。AR4的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 10所示；ARW2的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 11所示；其中第1-28个氨基酸为信号肽区域，用加粗斜体表示；下划线标注部分为MITD序列。
b.构建能够稳定表达突变多肽的细胞系：前列腺癌细胞系PC-3以2*105/孔种于6孔板，待细胞覆盖70-80％时开始转染。分别将AR4-pcDNA3.1(+)质粒和ARw2-pcDNA3.1(+)质粒2稀释于2份100μl无血清RPMI-1640培养基中，再分别加入2.5μl PLUSTM Reagents，室温孵育5min后，分别与含有5μl LipofectamineTM LTX的无血清RPMI-1640 100μl体系混合，室温孵育30min。将脂质体质粒络合物分别滴加于2份含有1000μl无血清RPMI-1640的待转染细胞中，前后轻轻摇匀，静置6h后更换为含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48h后，换为含700μg/mL G418及400μg/mL潮霉素B的10％血清的培养基进行细胞筛选。抗性筛选10-14天，待对照组细胞全部死亡，转染组细胞大量生长，将细胞消化，采用有限稀释法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700μg/mL G418，400μg/mL潮霉素B的培养基继续培养，隔天换液。继续培养约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入24孔板培养。上述方法中，用AR4-pcDNA3.1(+)质粒和ARw2-pcDNA3.1(+)质粒构建的细胞系分别命名AR4(含有AR4-pcDNA3.1(+))和ARw2(含有ARw2-pcDNA3.1(+))。
实施例4，第四类针对BRAF耐药突变的一些菲尼类药物的特定突变位点的稳转细胞系的构建；
人黑素瘤细胞系A378购于ATCC,培养于DMEM培养基加10％的胎牛血清。
实验目的：为了验证本发明中耐药多肽诱导的T细胞具有杀伤活性，因此需要构建一套含本发明中特定突变位点的稳转细胞系，能够表达递呈这些多肽
a.构建突变位点真核表达质粒：采用人工合成的方法获得能够表达本发明中突变的全部7条疫苗多肽的mini-gene，由以下几部分组成：信号肽部分(lysosome-associatedmembrane glycoprotein 1，LAMP1)，7条突变多肽和MHC class I trafficking domain(MITD)，7条突变多肽之间用柔性连接肽GGSGGGGSGG连接，基因进行密码子优化后，上游引入GATATC(EcoR V)，下游引入CTCGAG(Xho I)，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)中，命名为ME7-pcDNA3.1(+)。同时合成相应野生型多肽作为对照，命名为MEw5-pcDNA3.1(+)(其中MAP2K1 124氨基酸位点突变体来源于同一条野生型多肽，可以合并为一条野生型长肽)。所有基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成和构建。
ME7的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 12所示；MEw5的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 13所示；其中第1-28个氨基酸为信号肽区域，用加粗斜体表示；下划线标注部分为MITD序列。
b.构建能够稳定表达突变多肽的细胞系：人黑素瘤细胞系A378以2*105/孔种于6孔板，待细胞覆盖70-80％时开始转染。分别将ME7-pcDNA3.1(+)质粒和MEw5-pcDNA3.1(+)质粒2稀释于2份100μl无血清RPMI-1640培养基中，再分别加入2.5μl PLUSTM Reagents，室温孵育5min后，分别与含有5μl LipofectamineTM LTX的无血清RPMI-1640 100μl体系混合，室温孵育30min。将脂质体质粒络合物分别滴加于2份含有1000μl无血清RPMI-1640的待转染细胞中，前后轻轻摇匀，静置6h后更换为含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48h后，换为含700μg/mL G418及400μg/mL潮霉素B的10％血清的培养基进行细胞筛选。抗性筛选10-14天，待对照组细胞全部死亡，转染组细胞大量生长，将细胞消化，采用有限稀释法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700μg/mL G418，400μg/mL潮霉素B的培养基继续培养，隔天换液。继续培养约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入24孔板培养。上述方法中，用ME7-pcDNA3.1(+)质粒和MEw5-pcDNA3.1(+)质粒构建的细胞系分别命名ME7(ME7-pcDNA3.1(+))和MEw5(含有MEw5-pcDNA3.1(+))。
实施例5，第五类针对ALK、MET等融合基因的一些络氨酸激酶抑制剂的特定突变位点的稳转细胞系的构建；
人非小细胞肺癌H2228(EML4-ALK variant 3a/b E6；A20)购于ATCC,培养于RPMI1640培养基加10％的胎牛血清。
实验目的：为了验证本发明中耐药多肽诱导的T细胞具有杀伤活性，因此需要构建一套含本发明中特定突变位点的稳转细胞系，能够表达递呈这些多肽
a.构建突变位点真核表达质粒：采用人工合成的方法获得能够表达本发明中突变的全部10条疫苗多肽的mini-gene，由以下几部分组成：信号肽部分(lysosome-associatedmembrane glycoprotein 1，LAMP1)，10条突变多肽和MHC class I trafficking domain(MITD)，10条突变多肽之间用柔性连接肽GGSGGGGSGG连接，基因进行密码子优化后，上游引入GATATC(EcoR V)，下游引入CTCGAG(Xho I)，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)中，命名为ALK10-pcDNA3.1(+)。同时合成相应野生型多肽作为对照，命名为ALKw5-pcDNA3.1(+)(其中ALK 1171氨基酸位点和1174氨基酸位点附近突变体来源于同一条野生型多肽，ALK 1196氨基酸位点和1202及1203氨基酸位点附近突变体来源于同一条野生型多肽，MET 1246氨基酸位点来源于同一条野生型多肽可以合并为一条野生型长肽，共计5条野生型长肽)。所有基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成和构建。
ALK10的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 14所示；ALKw5的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 15所示；其中第1-28个氨基酸为信号肽区域，用加粗斜体表示；下划线标注部分为MITD序列。
a.构建能够稳定表达突变多肽的细胞系
人非小细胞肺癌H2228以2*105/孔种于6孔板，待细胞覆盖70-80％时开始转染。分别将ALK10-pcDNA3.1(+)质粒和ALKw5-pcDNA3.1(+)质粒2稀释于2份100μl无血清RPMI-1640培养基中，再分别加入2.5μl PLUSTM Reagents，室温孵育5min后，分别与含有5μlLipofectamineTM LTX的无血清RPMI-1640 100μl体系混合，室温孵育30min。将脂质体质粒络合物分别滴加于2份含有1000μl无血清RPMI-1640的待转染细胞中，前后轻轻摇匀，静置6h后更换为含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48h后，换为含700μg/mL G418及400μg/mL潮霉素B的10％血清的培养基进行细胞筛选。抗性筛选10-14天，待对照组细胞全部死亡，转染组细胞大量生长，将细胞消化，采用有限稀释法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700μg/mL G418，400μg/mL潮霉素B的培养基继续培养，隔天换液。继续培养约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入24孔板培养。上述方法中，用ALK10-pcDNA3.1(+)质粒和ALKw5-pcDNA3.1(+)质粒构建的细胞系分别命名ALK10(ALK10-pcDNA3.1(+))和ALKw5(含有ALKw5-pcDNA3.1(+))。
实施例6，第六类针对EGFR通路的络氨酸激酶抑制剂的特定突变位点的稳转细胞系的构建；
人慢性粒细胞白血病细胞系THP-1(ATCC TIB-202)购于ATCC,培养于RPMI-1640培养基加10％的胎牛血清。
实验目的：为了验证本发明中耐药多肽诱导的T细胞具有杀伤活性，因此需要构建一套含本发明中特定突变位点的稳转细胞系，能够表达递呈这些多肽。
a.构建突变位点真核表达质粒：为了实现突变多肽的表达，本发明拟通过串连各个多肽基因(即mini-gene)在人慢性粒细胞白血病细胞系THP-1中过表达。但由于这些突变热点比较从集中(基因片段同源性高)，将这92条多肽对应的4个基因，分成2组，每组含有46个多肽的基因，分别克隆于真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)和pcDNA3.1-zeo(+)。每个载体能够表达本发明中突变的全部46条疫苗多肽的mini-gene，由以下几部分组成：信号肽部分(lysosome-associated membrane glycoprotein 1，LAMP1)，13条突变多肽和MHC classI trafficking domain(MITD)，46条突变多肽之间用柔性连接肽GGSGGGGSGG连接，基因进行密码子优化后，上游引入GATATC(EcoR V)，下游引入CTCGAG(Xho I)，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)中，命名为mut46-hygro(+)和mut46-zeo(+)。同时合成相应野生型多肽作为对照，命名为wid8-hygro(+)(其中ABL1蛋白直接选取第234-505氨基酸位点，FLT3蛋白选取第835氨基酸位点附近一条，EGFR蛋白选取第760和790氨基酸位点附近2条，KIT蛋白3条和PDGFRA蛋白1条野生型多肽)，其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)中，wid8-hygro(+)所有基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成和构建。
Mut46-hy的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 16所示；Mut46-zeo的氨基酸序列为：SEQID：NO 17所示；Wid8-hy的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 18所示；其中第1-28个氨基酸为信号肽区域，用加粗斜体表示；下划线标注部分为MITD序列。其中第1-28个氨基酸为信号肽区域，用加粗斜体表示；下划线标注部分为MITD序列。
b.构建能够稳定表达突变多肽的细胞系：人慢性粒细胞白血病细胞系THP-1以2*105/孔种于6孔板，待细胞覆盖70-80％时开始转染。分别将mut46-hygro(+)质粒和wid8-hygro(+)质粒2稀释于2份100μl无血清RPMI-1640培养基中，再分别加入2.5μl PLUSTMReagents，室温孵育5min后，分别与含有5μl LipofectamineTM LTX的无血清RPMI-1640 100μl体系混合，室温孵育30min。将脂质体质粒络合物分别滴加于2份含有1000μl无血清RPMI-1640的待转染细胞中，前后轻轻摇匀，静置6h后更换为含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48h后，换为含700μg/mL G418、及400μg/mL潮霉素B的10％血清的培养基进行细胞筛选。抗性筛选10-14天，待对照组细胞全部死亡，转染组细胞大量生长，将细胞消化，采用有限稀释法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700μg/mL G418，400μg/mL潮霉素B的培养基继续培养，隔天换液。继续培养约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入24孔板培养。上述方法中，用mut46-hygro(+)质粒和wid8-hygro(+)质粒构建的细胞系分别命名mut46(mut46-hygro(+))和wid8(含有wid8-hygro(+))。
将mut46(mut46-hygro(+))重新活化，并按上述转染流程，将mut46-zeo(+)导入上述细胞系，用400μg/mL zeo进行筛选，命名为mut92(mut46-hygro(+)，mut46-zeo(+))。
实施例7，第七类针对PI3K/AKT/mTOR通路的依维莫司等激酶抑制剂的特定突变位点的稳转细胞系的构建；
人胚肾成纤维细胞株HEK 293(
Figure BDA0002795076430000081
CRL-1573TM)购于ATCC，培养于10％FBS-DMEM培养基。
实验目的：为了验证本发明中耐药多肽诱导的T细胞具有杀伤活性，因此需要构建一套含本发明中特定突变位点的稳转细胞系，能够表达递呈这些多肽
a.构建突变位点真核表达质粒：采用人工合成的方法获得能够表达本发明中突变的全部3条疫苗多肽的mini-gene，由以下几部分组成：信号肽部分(lysosome-associatedmembrane glycoprotein 1，LAMP1)，3条突变多肽和MHC class I trafficking domain(MITD)，3条突变多肽之间用柔性连接肽GGSGGGGSGG连接，基因进行密码子优化后，上游引入GATATC(EcoR V)，下游引入CTCGAG(Xho I)，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-hygro(+)中，命名为MEM3-pcDNA3.1(+)。同时合成相应野生型多肽作为对照，命名为MEMw3-pcDNA3.1(+)。所有基因片段由南京金斯瑞生物科技有限公司代合成和构建。
MEM3的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 19所示；MEMw3的氨基酸序列为：SEQ ID：NO 20所示；其中第1-28个氨基酸为信号肽区域，用加粗斜体表示；下划线标注部分为MITD序列。
b.构建能够稳定表达突变多肽的细胞系：人胚肾成纤维细胞株HEK 293以2*105/孔种于6孔板，待细胞覆盖70-80％时开始转染。分别将MEM3-pcDNA3.1(+)质粒和MEMw3-pcDNA3.1(+)质粒2稀释于2份100μl无血清RPMI-1640培养基中，再分别加入2.5μl PLUSTMReagents，室温孵育5min后，分别与含有5μl LipofectamineTM LTX的无血清RPMI-1640 100μl体系混合，室温孵育30min。将脂质体质粒络合物分别滴加于2份含有1000μl无血清RPMI-1640的待转染细胞中，前后轻轻摇匀，静置6h后更换为含10％血清的RPMI-1640培养基，继续培养48h后，换为含700μg/mL G418及400μg/mL潮霉素B的10％血清的培养基进行细胞筛选。抗性筛选10-14天，待对照组细胞全部死亡，转染组细胞大量生长，将细胞消化，采用有限稀释法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700μg/mL G418，400μg/mL潮霉素B的培养基继续培养，隔天换液。继续培养约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入24孔板培养。上述方法中，用MEM3-pcDNA3.1(+)质粒和MEMw3-pcDNA3.1(+)质粒构建的细胞系分别命名MEM3(含有MEM3-pcDNA3.1(+))和MEMw3(含有MEMw3-pcDNA3.1(+))。
根据以上实施例1-7得到的多肽组1小鼠的淋巴细胞悬液做体外细胞杀伤实验，实验内容如下：
实验2-1：第一类靶向药物的多肽疫苗组的体外细胞杀伤实验；
实验目的：验证15条多肽的在体外细胞水平能够引起肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记smo15-ASG(含有smo15-pcDNA3.1(+))和smow7-AGS(含有smow7-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组和对照组用的靶细胞。(2)杀伤实验a.准备效应细胞：将实施例1中留取的多肽组1小鼠的淋巴细胞悬液，用RPMI 1640培养基重悬，台盼蓝染色计数。b.效应细胞CTL的诱导培养：将组2淋巴细胞稀释浓度为(1-2)*106/mL，铺6孔板，每孔3mL，用RPMI1640+10％FBS+1×penicillin(100μg/mL)+streptomycin(100μg/mL)+1×MEM non-essential amino acids+1mM sodium pyruvate+10mM HEPES buffer培养基进行培养，补加50U/mL的rhIL2。往每孔中加入10μg/mL对应的抗原肽pool组，培养7天，每3天半量换液，并补加相应的抗原肽和rhIL2；一周之后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将smo15-ASG(含有smo15-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将smow7-AGS(含有smow7-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图3所示，实验组(图3)诱导的效应T细胞其杀伤效率在40％-80％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明突变多肽组对靶细胞起到了杀伤作用。突变多肽组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达75％以上。
实验2-2：第二类靶向药物的多肽疫苗组的体外细胞杀伤实验
实验目的：验证5条多肽的在体外细胞水平能够引起肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记BTK5(含有BTK5-pcDNA3.1(+))和BTKw2(含有BTKw2-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组和对照组用的靶细胞。(2)杀伤实验a.准备效应细胞：将实施例2中留取的多肽组1小鼠的淋巴细胞悬液，用RPMI 1640培养基重悬，台盼蓝染色计数。b.效应细胞CTL的诱导培养：将组2淋巴细胞稀释浓度为(1-2)*106/mL，铺6孔板，每孔3mL，用RPMI1640+10％FBS+1×penicillin(100μg/mL)+streptomycin(100μg/mL)+1×MEM non-essential amino acids+1mM sodiumpyruvate+10mM HEPES buffer培养基进行培养，补加50U/mL的rhIL2。往每孔中加入10μg/mL对应的抗原肽pool组，培养7天，每3天半量换液，并补加相应的抗原肽和rhIL2；一周之后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将BTK5(含有BTK5-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将BTKw2(含有BTKw2-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图4所示，实验组(图4)诱导的效应T细胞其杀伤效率在40％-80％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明突变多肽组对靶细胞起到了杀伤作用。突变多肽组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达75％以上。
实验2-3：第三类靶向药物的多肽疫苗组的体外细胞杀伤实验
实验目的：验证4条多肽的在体外细胞水平能够引起肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记AR4(含有AR4-pcDNA3.1(+))和ARw2(含有ARw2-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组和对照组用的靶细胞。(2)杀伤实验a.准备效应细胞：将实施例3中留取的多肽组1小鼠的淋巴细胞悬液，用RPMI 1640培养基重悬，台盼蓝染色计数。b.效应细胞CTL的诱导培养：将组2淋巴细胞稀释浓度为(1-2)*106/mL，铺6孔板，每孔3mL，用RPMI1640+10％FBS+1×penicillin(100μg/mL)+streptomycin(100μg/mL)+1×MEM non-essential amino acids+1mM sodiumpyruvate+10mM HEPES buffer培养基进行培养，补加50U/mL的rhIL2。往每孔中加入10μg/mL对应的抗原肽pool组，培养7天，每3天半量换液，并补加相应的抗原肽和rhIL2；一周之后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将AR4(含有AR4-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将ARw2(含有ARw2-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔(可删除)。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图5所示，实验组(图5)诱导的效应T细胞其杀伤效率在40％-90％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明突变多肽组对靶细胞起到了杀伤作用。突变多肽组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达80％以
实验2-4：第四类靶向药物的多肽疫苗组体外细胞杀伤实验
实验目的：验证7条多肽的在体外细胞水平能够引起肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记ME7(ME7-pcDNA3.1(+))和MEw5(含有MEw5-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组和对照组用的靶细胞。(2)杀伤实验a.准备效应细胞：将实施例4中留取的多肽组1小鼠的淋巴细胞悬液，用RPMI 1640培养基重悬，台盼蓝染色计数。b.效应细胞CTL的诱导培养：将组2淋巴细胞稀释浓度为(1-2)*106/mL，铺6孔板，每孔3mL，用RPMI1640+10％FBS+1×penicillin(100μg/mL)+streptomycin(100μg/mL)+1×MEM non-essential amino acids+1mM sodium pyruvate+10mM HEPES buffer培养基进行培养，补加50U/mL的rhIL2。往每孔中加入10μg/mL对应的抗原肽pool组，培养7天，每3天半量换液，并补加相应的抗原肽和rhIL2；一周之后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将ME7(ME7-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将MEw5(含有MEw5-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔(可删除)。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图6所示，实验组(图6)诱导的效应T细胞其杀伤效率在45％-90％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明突变多肽组对靶细胞起到了杀伤作用。突变多肽组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达85％以上。
实验2-5：第五类靶向药物的多肽疫苗组体外细胞杀伤实验；
实验目的：验证10条多肽的在体外细胞水平能够引起肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记ALK10(ALK10-pcDNA3.1(+))和ALKw5(含有ALKw5-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组和对照组用的靶细胞。(2)杀伤实验a.准备效应细胞：将实施例5中留取的多肽组1小鼠的淋巴细胞悬液，用RPMI 1640培养基重悬，台盼蓝染色计数。b.效应细胞CTL的诱导培养：将组2淋巴细胞稀释浓度为(1-2)*106/mL，铺6孔板，每孔3mL，用RPMI1640+10％FBS+1×penicillin(100μg/mL)+streptomycin(100μg/mL)+1×MEM non-essential amino acids+1mM sodiumpyruvate+10mM HEPES buffer培养基进行培养，补加50U/mL的rhIL2。往每孔中加入10μg/mL对应的抗原肽pool组，培养7天，每3天半量换液，并补加相应的抗原肽和rhIL2；一周之后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将ALK10(ALK10-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将ALKw5(含有ALKw5-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔(可删除)。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。实验结果：如图7所示，实验组(图7)诱导的效应T细胞其杀伤效率在40％-90％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明突变多肽组对靶细胞起到了杀伤作用。突变多肽组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达80％以上。
实验2-6：第六类靶向药物的多肽疫苗组体外细胞杀伤实验；
实验目的：验证92条多肽的在体外细胞水平能够引起肿瘤细胞的杀伤效果。
实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记mut92(mut46-hygro(+)，mut46-zeo(+))和wid8(含有wid8-hygro(+))靶细胞，分别作为实验组和对照组用的靶细胞。(2)杀伤实验a.准备效应细胞：将实施例6中留取的多肽组1小鼠的淋巴细胞悬液，用RPMI 1640培养基重悬，台盼蓝染色计数。b.效应细胞CTL的诱导培养：将组2淋巴细胞稀释浓度为(1-2)*106/mL，铺6孔板，每孔3mL，用RPMI1640+10％FBS+1×penicillin(100μg/mL)+streptomycin(100μg/mL)+1×MEM non-essential amino acids+1mM sodiumpyruvate+10mM HEPES buffer培养基进行培养，补加50U/mL的rhIL2。往每孔中加入10μg/mL对应的抗原肽pool组，培养7天，每3天半量换液，并补加相应的抗原肽和rhIL2；一周之后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将mut92(mut46-hygro(+)，mut46-zeo(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将wid8(含有wid8-hygro(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。
实验结果：如图8所示，实验组(图8)诱导的效应T细胞其杀伤效率在40％-90％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明突变多肽组对靶细胞起到了杀伤作用。突变多肽组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达84％以上。
实验2-7：第七类靶向药物的多肽疫苗组体外细胞杀伤实验；实验目的：验证3条多肽的在体外细胞水平能够引起肿瘤细胞的杀伤效果。实验方法：(1)5-(6)-Carboxy-fluorescein succinimidyl ester(CFSE)染料购自Invitrogen公司。操作步骤按照试剂盒说明书进行。无菌条件下用CFSE标记MEM3(含有MEM3-pcDNA3.1(+))和MEMw3(含有MEMw3-pcDNA3.1(+))靶细胞，分别作为实验组和对照组用的靶细胞。(2)杀伤实验a.准备效应细胞：将实施例7中留取的多肽组1小鼠的淋巴细胞悬液，用RPMI 1640培养基重悬，台盼蓝染色计数。b.效应细胞CTL的诱导培养：将组2淋巴细胞稀释浓度为(1-2)*106/mL，铺6孔板，每孔3mL，用RPMI1640+10％FBS+1×penicillin(100μg/mL)+streptomycin(100μg/mL)+1×MEM non-essential amino acids+1mM sodium pyruvate+10mM HEPES buffer培养基进行培养，补加50U/mL的rhIL2。往每孔中加入10μg/mL对应的抗原肽pool组，培养7天，每3天半量换液，并补加相应的抗原肽和rhIL2；一周之后细胞重悬，用PBS洗涤2次，制备成效应细胞CTL。将MEM3(含有MEM3-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为实验组，每个实验组设置三个平行对照孔。将MEMw3(含有MEMw3-pcDNA3.1(+))靶细胞分别与效应细胞CTL按照1:5、1:10和1:20的细胞数目比进行混合，加入到U型96孔板内，每孔体积200μL，作为对照组，每个对照组设置三个平行对照孔。将96孔板放在37℃培养箱培养4h。将96孔板离心去上清，用200μL预冷的PBS将细胞沉淀重悬，转到流式上样管中，用碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)染色标记，浓度为1μg/m L，染色3min，马上进行流式上机检测。实验结果：如图9所示，实验组(图9)诱导的效应T细胞其杀伤效率在40％-80％不等，杀伤效率明显高于对照组，说明突变多肽组对靶细胞起到了杀伤作用。突变多肽组中，随着效靶比的升高，T细胞的杀伤作用越来越强，当效靶比为20:1时，其对靶细胞杀伤效率达70％以上。
根据以上7个实验，可以得知通过本发明的设计方法将靶向药物根据其机制和耐药突变聚类分析归位7大类，多靶点联合可以有效增加多肽疫苗对肿瘤细胞的杀伤效果，显著延长靶向药物有效作用时间。本发明提供一种针对肿瘤靶向药物耐药位点的多肽疫苗及其设计方法，提供的靶向药物联合多肽疫苗组合方案覆盖常见的靶向治疗药物，可以有效降低肿瘤耐药发生概率，延长靶向药有效作用时间，增加患者的疾病响应率，具有广谱性，缩短个体化多肽疫苗从分析到治疗的时间，降低医疗成本。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 杭州纽安津生物科技有限公司
<120> 针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合及其设计方法
<141> 2020-11-24
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 16
Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Ala Phe Asp Leu Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ser His Met Lys Lys
20
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 17
Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Ser Phe Asp Leu Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ser His Met
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 18
Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Leu Thr Phe Asp Leu Leu
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Ile Lys Ser His Met Lys
20
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Ala Phe Asp Leu Leu Ile Lys
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Ser His Met Lys Lys
20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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20
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<211> 630
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
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Leu Leu Leu Leu Gly Leu Met His Cys Ala Ser Ala Leu Gln Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Met Leu Arg Leu Gly Ile Phe Gly
35 40 45
Phe Leu Val Phe Gly Phe Val Leu Ile Thr Phe Ser Cys Lys Lys Lys
50 55 60
Lys Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Phe Gly
65 70 75 80
Phe Val Leu Ile Thr Phe Ser Tyr His Phe Tyr Asp Phe Phe Asn Gln
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Ile Thr Phe Ser Cys His Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Gly Ser Gly
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His Phe Phe Asn Gln Ala Glu Trp Glu Arg Ser Lys Lys Lys Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Phe Thr Glu Ala Glu His Gln Asp
245 250 255
Met Arg Ser Tyr Ile Ala Ala Phe Gly Ala Val Thr Lys Lys Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Met Phe Gly Thr Gly Ile Ala Met
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Lys Lys Lys Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val
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Leu Ile Thr Phe Ser Cys His Phe Tyr Tyr Phe Phe Asn Gln Ala Glu
325 330 335
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu Met
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Leu Leu Leu Leu Gly Leu Met His Cys Ala Ser Ala Leu Gln Pro Ile
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Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Ala Phe Asp Leu Leu Ile Lys Ser His
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Met Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val Gln Pro
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Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Leu Thr Phe Asp Leu Leu Ile Lys Ser
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His Met Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asn Glu Leu
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Gly Glu Arg Gln Leu Val His Met Val Lys Trp Ala Lys Ala Leu Pro
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Gly Phe Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro Ile Ala Arg
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Glu Leu His Gln Phe Ser Phe Asp Leu Leu Ile Lys Ser His Met Gly
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Gly Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Val Gly Ile Val Ala Gly
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Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Thr Val
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Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Thr Phe Asp Leu Leu Ile Lys
35 40 45
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50 55 60
Gly Glu Arg Gln Leu Val His Met Val Lys Trp Ala Lys Ala Leu Pro
65 70 75 80
Gly Phe Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Val Gly Ile
85 90 95
Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile Gly Ala Val Val
100 105 110
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115 120 125
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Asp Gly Glu Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr
50 55 60
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp
85 90 95
Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Lys Lys
100 105 110
Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Lys Arg Leu Glu
115 120 125
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Leu Gln Val Leu His Glu Cys Asn
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Gly Gly Gly Ser Gly Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu
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100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Phe Ile Leu Leu Glu Leu Met
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Cys Pro Gly Pro Gly Arg Val Ala Lys
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ile Asp Leu Ser Gln Val
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly
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260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ser Leu Ala Tyr Asn Lys Phe
275 280 285
Ser Ile Glu Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Leu Leu Lys Lys Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly His Leu Val Lys Val Ala Asp
305 310 315 320
Phe Gly Met Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Lys Lys Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ile Asp Leu Ser Gln Val Tyr
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Gly Ser Gly Gly Arg Glu Cys Asn Arg Gln Glu Val Asn Ala Phe Val
740 745 750
Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
755 760 765
Ser Gly Gly Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala Arg Ala Gly
770 775 780
Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
785 790 795 800
Ser Gly Gly Ser Ala Met Glu Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Val Ile His
805 810 815
Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
820 825 830
Gly Thr Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Lys Phe Leu Lys Glu
835 840 845
Ala Ala Val Met Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
850 855 860
Val Glu Glu Phe Leu Lys Glu Ala Ala Ala Met Lys Glu Ile Lys His
865 870 875 880
Pro Asn Leu Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Met
885 890 895
Ala Thr Gln Ile Ser Ser Ala Met Asp Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe
900 905 910
Ile His Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Pro Gly
915 920 925
Ile Asp Leu Ser Gln Val Tyr Gly Leu Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Met
930 935 940
Glu Arg Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Lys Ile Cys
945 950 955 960
Asp Phe Gly Leu Ala Arg His Ile Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val
965 970 975
Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Lys Ile Cys Asp Phe
980 985 990
Gly Leu Ala Arg Glu Ile Lys Asn Asp Ser Asn Tyr Val Val Lys Gly
995 1000 1005
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ala Arg Asp Ile Lys Asn
1010 1015 1020
Gly Ser Asn Tyr Val Val Lys Gly Asn Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1025 1030 1035 1040
Ser Gly Gly Cys Thr Ile Gly Gly Pro Thr Leu Val Ile Glu Glu Tyr
1045 1050 1055
Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Lys Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly
1060 1065 1070
Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ser Tyr Leu Gly Asn His Met Asn Ile Ala
1075 1080 1085
Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Ile Gly Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly
1090 1095 1100
Gly Gly Ser Gly Gly Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val
1105 1110 1115 1120
Ile Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1125 1130 1135
Gly Ser Gly Gly Ser Phe Ala Glu Ile His Gln Ala Phe Glu Arg Met
1140 1145 1150
Phe Gln Glu Ser Ser Ile Ser Asp Glu Lys Lys Lys Gly Gly Ser Gly
1155 1160 1165
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Thr Val Ala Val Lys Thr Leu Lys
1170 1175 1180
Lys Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe Leu Lys Gly Gly Ser Gly Gly
1185 1190 1195 1200
Gly Gly Ser Gly Gly Thr Glu Phe Met Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Gly
1205 1210 1215
Tyr Leu Arg Glu Cys Asn Arg Gln Glu Val Lys Gly Gly Ser Gly Gly
1220 1225 1230
Gly Gly Ser Gly Gly Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln Phe
1235 1240 1245
Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1250 1255 1260
Gly Ser Gly Gly Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Phe Met
1265 1270 1275 1280
Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala His Ala Lys Lys Lys Gly Gly Ser Gly
1285 1290 1295
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu
1300 1305 1310
Leu Gln Leu Leu Gly Val Cys Thr Arg Glu Pro Gly Gly Ser Gly Gly
1315 1320 1325
Gly Gly Ser Gly Gly Glu Arg Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Glu Val
1330 1335 1340
Leu Ser Tyr Leu Gly Asn His Met Asn Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly
1345 1350 1355 1360
Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ala Ala Leu Tyr Lys Asn Leu Leu His Phe
1365 1370 1375
Lys Glu Ser Ser Cys Ser Asp Ser Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1380 1385 1390
Ser Gly Gly Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Lys Asn Tyr Ser Asn
1395 1400 1405
Tyr Val Val Lys Gly Asn Ala Arg Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1410 1415 1420
Gly Gly Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Lys Asn Asp Phe Asn Tyr Val
1425 1430 1435 1440
Val Lys Gly Asn Ala Arg Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1445 1450 1455
Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile
1460 1465 1470
Gly Ala Val Val Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly
1475 1480 1485
Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly
1490 1495 1500
Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala
1505 1510
<210> 18
<211> 625
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 18
Met Ala Ala Pro Gly Ser Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Met His Cys Ala Ser Ala Leu Gln Lys Trp
20 25 30
Glu Met Glu Arg Thr Asp Ile Thr Met Lys His Lys Leu Gly Gly Gly
35 40 45
Gln Tyr Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr
50 55 60
Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Glu Asp Thr Met Glu Val Glu Glu Phe
65 70 75 80
Leu Lys Glu Ala Ala Val Met Lys Glu Ile Lys His Pro Asn Leu Val
85 90 95
Gln Leu Leu Gly Val Cys Thr Arg Glu Pro Pro Phe Tyr Ile Ile Thr
100 105 110
Glu Phe Met Thr Tyr Gly Asn Leu Leu Asp Tyr Leu Arg Glu Cys Asn
115 120 125
Arg Gln Glu Val Asn Ala Val Val Leu Leu Tyr Met Ala Thr Gln Ile
130 135 140
Ser Ser Ala Met Glu Tyr Leu Glu Lys Lys Asn Phe Ile His Arg Asp
145 150 155 160
Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn His Leu Val Lys Val
165 170 175
Ala Asp Phe Gly Leu Ser Arg Leu Met Thr Gly Asp Thr Tyr Thr Ala
180 185 190
His Ala Gly Ala Lys Phe Pro Ile Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ser Leu
195 200 205
Ala Tyr Asn Lys Phe Ser Ile Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val
210 215 220
Leu Leu Trp Glu Ile Ala Thr Tyr Gly Met Ser Pro Tyr Pro Gly Ile
225 230 235 240
Asp Leu Ser Gln Val Tyr Glu Leu Leu Glu Lys Asp Tyr Arg Met Glu
245 250 255
Arg Pro Glu Gly Cys Pro Glu Lys Val Tyr Glu Leu Met Arg Ala Cys
260 265 270
Trp Gln Trp Asn Pro Ser Asp Arg Pro Ser Phe Ala Glu Ile His Gln
275 280 285
Ala Phe Glu Thr Met Phe Gln Glu Ser Ser Ile Ser Asp Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala
305 310 315 320
Arg Asp Ile Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val Arg Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
340 345 350
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Lys Gly Gly Ser Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr
370 375 380
Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys
385 390 395 400
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val Lys Ile Cys Asp Phe
405 410 415
Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn Tyr Val Ser Lys Gly
420 425 430
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Arg Glu Ala Leu Met Ser
435 440 445
Glu Leu Lys Val Leu Ser Tyr Leu Gly Asn His Met Asn Ile Val Asn
450 455 460
Leu Leu Gly Ala Cys Thr Ile Gly Gly Pro Thr Leu Val Ile Thr Glu
465 470 475 480
Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
485 490 495
Ser Gly Gly Glu Ala Ala Leu Tyr Lys Asn Leu Leu His Ser Lys Glu
500 505 510
Ser Ser Cys Ser Asp Ser Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
515 520 525
Gly Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Lys Asn Asp Ser
530 535 540
Asn Tyr Val Val Lys Gly Asn Ala Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala
545 550 555 560
Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Val Gly Ile Val Ala
565 570 575
Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Thr
580 585 590
Val Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser
595 600 605
Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr
610 615 620
Ala
625
<210> 19
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 19
Met Ala Ala Pro Gly Ser Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Met His Cys Ala Ser Ala Leu Gln Thr Gln
20 25 30
Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Leu Arg Arg Ile Ser Lys Gln Leu
35 40 45
Pro Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly His Glu Cys Asn
50 55 60
Ser Pro Tyr Ile Val Gly Leu Tyr Gly Ala Phe Tyr Ser Asp Gly Glu
65 70 75 80
Ile Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val Lys Val
85 90 95
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser
100 105 110
Val His Lys Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Val Gly
115 120 125
Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile Gly Ala Val
130 135 140
Val Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val
165 170 175
Ser Leu Thr Ala
180
<210> 20
<211> 180
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 20
Met Ala Ala Pro Gly Ser Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Met His Cys Ala Ser Ala Leu Gln Thr Gln
20 25 30
Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Gln Leu
35 40 45
Pro Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly His Glu Cys Asn
50 55 60
Ser Pro Tyr Ile Val Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Tyr Ser Asp Gly Glu
65 70 75 80
Ile Lys Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val Lys Val
85 90 95
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser
100 105 110
Val His Lys Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Val Gly
115 120 125
Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile Gly Ala Val
130 135 140
Val Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val
165 170 175
Ser Leu Thr Ala
180
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 21
Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Ser Phe Asp Leu Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ser His Met
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 22
Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu Val His Met Val Lys Trp Ala Lys
1 5 10 15
Ala Leu Pro Gly Phe
20
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 23
Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Ala Phe Asp Leu Leu Ile Lys
1 5 10 15
Ser His Met Lys Lys
20

Claims (4)

1.针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合，其特征在于，
阿比特龙的多肽疫苗组合针对如下突变：AR-T878A，AR-T878S；
AR-T878A的序列为：PIARELHQFAFDLLIKSHMKK；
AR-T878S的序列为：PIARELHQFSFDLLIKSHM；
恩扎鲁胺的多肽疫苗组合针对如下突变：AR-F877L，AR-T878A；
AR-F877L的序列为：VQPIARELHQLTFDLLIKSHMK；
AR-T878A的序列为：PIARELHQFAFDLLIKSHMKK；
氟他胺的多肽疫苗组合针对如下突变：AR-T878A，AR-T878S，AR-V716M；
AR-T878A的序列为：PIARELHQFAFDLLIKSHMKK；
AR-T878S的序列为：PIARELHQFSFDLLIKSHM；
AR-V716M的序列为：NELGERQLVHMVKWAKALPGF；
酮康唑的多肽疫苗针对如下突变：AR-T878A；
AR-T878A的序列为：PIARELHQFAFDLLIKSHMKK。
2.针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：
寻找靶向药物耐药突变数据的数据；
截取耐药突变多肽序列及预测MHC分子亲和力及免疫原性：
对于点突变截取覆盖突变位点上下游16个氨基酸的多肽序列，对于移码突变截取向前延伸16个长度的氨基酸、向后延伸直到终止密码子的多肽序列作为耐药突变位点的突变型多肽，同时截取相应位置对应的野生型多肽序列，
用至少一个数据库作为来源统计高频HLA分型及频率，将统计出的HLA合并去重之后作为用于预测的候选HLA分型，
使用多款软件分析这些突变位点对应的多肽与HLA分子结合亲和力，综合多款软件将亲和力分为三类：强亲和力-SB、弱亲和力-WB和无亲和力，并与相对野生型多肽比较确定其亲和力变化，
A类变化为由无亲和力变为有强亲和力，
B类变化为由无亲和力变为弱亲和力，
C类变化为由弱亲和力变为强亲和力，
D类变化为无变化，
内部排序认为A类优于B类优于C类优于D类，
使用免疫原性预测工具预测其免疫原性，保留突变型多肽亲和力强、亲和力变化大并且免疫原性强的表位；
靶向药物与耐药位点相互关系及药物聚类：
对耐药位点亲和力打分：
综合考虑位点有亲和力的表位个数及各表位亲和力变化大小，对A、B、C、D四类不同亲和力变化给予相对应的权重，根据每个表位对应的HLA频率大小给予权重,将位点的各表位累加求和；
Figure FDA0002795076420000021
AC：亲和力变化大小，A、B、C、D四类不同亲和力变化给予不同的权重；
Fhla：对应的HLA频率；
n：位点的各表位个数；
综合分析靶向药物和耐药位点间相互关系结合靶向药物作用机制对靶向药物聚类从而将其分为7类：
第一类针对SMO突变产生耐药的Hedgehog信号通路拮抗剂维莫德吉，
第二类针对BTK突变产生耐药的依鲁替尼，
第三类针对AR耐药突变的一些抗雄激素类药物如阿比特龙等，
第四类针对BRAF耐药突变的一些菲尼类药物，
第五类针对ALK、MET等融合基因的一些络氨酸激酶抑制剂，
第六类针对EGFR通路的络氨酸激酶抑制剂，
第七类针对PI3K/AKT/mTOR通路的依维莫司等激酶抑制剂；
设计相对应的疫苗多肽序列。
3.根据权利要求2所述的针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合的设计方法，其特征在于，
截取耐药突变多肽序列及预测MHC分子亲和力及免疫原性：
对于点突变截取覆盖突变位点上下游16个氨基酸的多肽序列，对于移码突变截取向前延伸16个长度的氨基酸、向后延伸直到终止密码子的多肽序列作为耐药突变位点的突变型多肽，同时截取相应位置对应的野生型多肽序列，
用至少一个数据库作为来源统计高频HLA分型及频率，将统计出的HLA合并去重之后作为用于预测的候选HLA分型，所述数据库包括：公共数据库，临床患者数据库，
使用多款软件分析这些突变位点对应的多肽与HLA分子结合亲和力，综合多款软件将亲和力分为三类：强亲和力-SB、弱亲和力-WB和无亲和力，并与相对野生型多肽比较确定其亲和力变化，所述多款软件包括：netMHCpan、netMHC及Pickpocket这三款软件，
A类变化为由无亲和力变为有强亲和力，
B类变化为由无亲和力变为弱亲和力，
C类变化为由弱亲和力变为强亲和力，
D类变化为无变化，
内部排序认为A类优于B类优于C类优于D类，
使用免疫原性预测工具预测其免疫原性，保留突变型多肽亲和力强、亲和力变化大并且免疫原性强的表位。
4.根据权利要求2所述的针对靶向药物阿比特龙、恩扎鲁胺、氟他胺、酮康唑聚的多肽疫苗组合的设计方法，其特征在于，
使用cytoscape对所有的靶向药物及耐药位点作网络图，耐药位点的大小代表其亲和力得分数，综合分析靶向药物和耐药位点间相互关系结合靶向药物作用机制对靶向药物聚类从而将其分为7类：
第一类针对SMO突变产生耐药的Hedgehog信号通路拮抗剂维莫德吉，
第二类针对BTK突变产生耐药的依鲁替尼，
第三类针对AR耐药突变的一些抗雄激素类药物如阿比特龙等，
第四类针对BRAF耐药突变的一些菲尼类药物，
第五类针对ALK、MET等融合基因的一些络氨酸激酶抑制剂，
第六类针对EGFR通路的络氨酸激酶抑制剂，
第七类针对PI3K/AKT/mTOR通路的依维莫司等激酶抑制剂。
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