CN112675132B - 一种窄粒径分布的曲普瑞林微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制药领域，本发明公开了一种窄粒径分布的曲普瑞林微球的制备方法，包括：1）将醋酸曲普瑞林分散于二氯甲烷中制成混悬液A，将PLGA溶解于二氯甲烷中制成溶液B；2）将混悬液A和溶液B混合，二氯甲烷定重，逐渐加入二甲硅油进行凝聚反应，同时梯度调节凝聚转速，具体为二甲硅油的加入速度和凝聚转速在凝聚反应的前期大于后期；3）凝聚结束后将微球胚转移至正庚烷中进行硬化；硬化后过滤收集固体并洗涤，干燥；将微球与冻干介质重悬后，冷冻干燥即得成品。本发明通过梯度调控微球凝聚过程中凝聚剂（二甲硅油）的加入速度和凝聚转速，从而制得粒径分布窄、收率高的曲普瑞林微球。该微球通针性好，可提高患者治疗的顺应性。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，尤其涉及一种窄粒径分布的曲普瑞林微球的制备方法。
背景技术
促性腺激素释放激素(GnRH)，又称黄体激素释放激素(LHRH)，是与生殖功能密切相关的十肽激素。当外源性的LHRH或其类似物以生理脉冲频率(每90min一次)短期、小剂量给药时，会对垂体性腺系统起到促进作用，临床上可用于治疗性功能低下、不排卵、青春期延后等症状。而以非生理脉冲频率长期、大剂量给药时，可抑制垂体分泌黄体生成素和卵泡刺激素，导致性腺分泌激素能力下降，性器官萎缩，临床用于治疗一些激素依赖性疾病，如前列腺癌、子宫肌瘤、乳腺癌、子宫内膜异位以及青春期性早熟等。
曲普瑞林(Triptorelin，6-D色氨酸促黄体激素释放因子)是GnRH的类似物，通过将GnRH结构中第六位甘氨酸替换成D-色氨酸，将其生物活性提高约100倍。因此，曲普瑞林在治疗前列腺癌、子宫肌瘤、乳腺癌、子宫内膜异位上效果显著。根据醋酸曲普瑞林临床适应症的用药特点，患者往往需要长期给药，但常规的曲普瑞林醋酸曲普瑞林注射液存在生物半衰期较短、制剂稳定性差、口服给药难以吸收、且服药后副作用大等缺点。而曲普瑞林微球作为一种长效缓释制剂，由于其优良的缓释性能，极大地延长了曲普瑞林在人体内的半衰期，可以很好地提高患者的给药顺应性，改善吸收效率和治疗效果。目前醋酸曲普瑞林微球常见的制备方法有复乳法(如CN 105169366 B丽珠医药集团；CN 104010629 B山东绿叶集团；CN104523605A北京博恩特)，热熔挤出法(CN 102048699 B，长春金赛药业；CN105267153 B上海苏豪逸明制药)以及凝聚法(CN 109692325 A齐鲁制药)。其中凝聚法又称相分离法，其原理是在聚合物(PLGA)溶液中，加入与聚合物不互溶的溶媒(非溶媒)，引起相分离的同时将活性物质(曲普瑞林)包裹在PLGA内部形成微球的形式。更具体地，PLGA溶解在二氯甲烷中，曲普瑞林以固体形式分散在PLGA的二氯甲烷溶液中，二甲硅油作为与二氯甲烷互溶，但又不能溶解PLGA和曲普瑞林的非溶媒；随着二甲硅油的加入，PLGA和曲谱瑞林在二氯甲烷中的溶解度降低而发生凝聚(相分离)，形成微球胚；之后在硬化过程中除去二氯甲烷和二甲硅油，即得到曲普瑞林微球。相比于复乳法制备曲普瑞林微球，凝聚法制备的微球收率较高，且对微球突释性能控制得比较好。而对比热熔挤出法，采用凝聚法制备的微球API活性更高，热熔挤出法不适用于热敏感的原料药。
虽然凝聚法制备曲普瑞林微球具有上述优势，但该方法也存在微球粒径分布过宽的问题，这会导致在后期过筛时，粒径较大的微球无法过筛而损失；除此之外，大粒径的微球在进行肌肉注射给药时，疼痛感剧烈，患者耐受性较差。因此这一技术问题亟待解决。
发明内容
为了解决凝聚法制备曲普瑞林微球粒径分布过宽的技术问题，本发明提供了一种窄粒径分布的曲普瑞林微球的制备方法。本发明通过梯度调控微球凝聚过程中凝聚剂(二甲硅油)的加入速度和凝聚转速，从而制得粒径分布窄、收率高的曲普瑞林微球。该微球通针性好，可提高患者治疗的顺应性。
本发明的具体技术方案为：一种窄粒径分布的曲普瑞林微球的制备方法，包括以下步骤：
1)将醋酸曲普瑞林分散于二氯甲烷中，制成混悬液A，将PLGA溶解于二氯甲烷中，完全溶解后形成溶液B。
2)将混悬液A和溶液B混合均匀，二氯甲烷定重，混合均匀，向所得混合液中逐渐加入二甲硅油进行凝聚反应，同时梯度调节凝聚转速，具体为二甲硅油的加入速度和凝聚转速在凝聚反应的前期大于后期。
3)凝聚结束后，将所得微球胚快速转移至正庚烷中进行硬化；硬化结束后，过滤收集固体并洗涤，干燥；将所得干燥微球与冻干介质重悬后，冷冻干燥即得窄粒径分布的曲普瑞林微球。
本发明团队基于对凝聚法制备微球的过程研究，针对混合液在凝聚过程中会逐渐形成微球胚的特点，考察了醋酸曲普瑞林微球在凝聚过程的稳定性变化，同时检测其粒径变化和分布与凝聚剂(二甲硅油)的加入速度以及凝聚转速的相关性，首次提出通过梯度控制微球在凝聚过程中的凝聚转速和凝聚剂加入速度，来获得粒径分布窄的醋酸曲普瑞林微球。本发明制备出的微球，其粒径分布窄，过筛收率高(可达95％以上)；均一性好，药物释放平稳；且微球经干燥后，其混悬液通针性好，可极大提高患者在治疗过程中的顺应性。
具体地，在凝聚发生前期，即微球胚处于不稳定期，加快凝聚剂的加入速度，从而使凝聚过程尽快达到稳定期，在凝聚剂快速加入的过程中，使用较高的凝聚转速，从而使凝聚剂快速加入的同时，能快速均一地分散在聚合物溶液中，从而使聚合物溶液在凝聚过程形成大小均一的微球胚；而在凝聚过程逐渐达到稳态后，降低凝聚剂的加入速度，同时降低凝聚的搅拌转速，使整个凝聚系统更加稳定，从而得到粒径均一，分布窄的微球。
作为优选，步骤1)中，将醋酸曲普瑞林分散于二氯甲烷中后，经超声10-30min分散或5000-15000rpm高速剪切10-30min后制成混悬液A。
作为优选，步骤2)中，所述醋酸曲普瑞林占定重后所得混合溶液重量的0.05-1％；PLGA占定重后所得混合液质量的1-10％。
作为优选，步骤2)中，定重后在5-25℃水浴、200-800rpm条件下混合5-15min。
作为优选，步骤2)中，所述二甲硅油的粘度为20-1000cst。
作为优选，步骤2)中，所述二甲硅油与二氯甲烷的质量比为0.5-1.6∶1。
本发明团队通过大量试验发现在上述比例下，最有利于微球的稳定性。
作为优选，步骤2)中，凝聚过程的温度控制在5-25℃，在二甲硅油的添加过程中，前1/2-2/3质量的二甲硅油，加入速度为二甲硅油总量的1/4-1/8min-1，凝聚转速为600-2000rpm；后1/3-1/2质量的二甲硅油，加入速度为二甲硅油总量的1/8-1/30min-1，凝聚转速为200-400rpm。
本发明团队基于大量试验，发现在上述特定工艺参数下，所得的微球的粒径均一更好，粒径分布更窄，且可同时保证收率。
作为优选，步骤3)中，硬化温度为5-25℃，硬化转速为200-1000rpm，硬化时间为0.5-1.5h。
作为优选，步骤3)中，硬化结束后，用5-25℃的正庚烷清洗硬化后所得微球，清洗时间20-40min，清洗转速为200-1000rpm；过滤收集固体用正庚烷洗涤，真空干燥。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明首次提出通过梯度控制微球在凝聚过程中的凝聚转速和凝聚剂加入速度，来获得粒径分布窄的醋酸曲普瑞林微球。本发明制备出的微球，其粒径分布窄，过筛收率高(可达95％以上)；均一性好，药物释放平稳；且微球经干燥后，其混悬液通针性好，可极大提高患者在治疗过程中的顺应性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种窄粒径分布的曲普瑞林微球的制备方法，包括以下步骤：
1)将醋酸曲普瑞林分散于二氯甲烷中，经超声10-30min分散或5000-15000rpm高速剪切10-30min后，制成混悬液A，将PLGA溶解于二氯甲烷中，完全溶解后形成溶液B。
2)将混悬液A和溶液B混合均匀，用二氯甲烷定重(醋酸曲普瑞林占定重后所得混合溶液重量的0.05-1％；PLGA占定重后所得混合液质量的1-10％)，定重后在5-25℃水浴、200-800rpm条件下混合5-15min。向所得混合液中逐渐加入粘度为20-1000cst二甲硅油(二甲硅油与二氯甲烷的质量比为0.5-1.6∶1)进行凝聚反应，同时梯度调节凝聚转速，具体为二甲硅油的加入速度和凝聚转速在凝聚反应的中前期大于后期。
优选地，在二甲硅油的添加过程中，前1/2-2/3质量的二甲硅油，加入速度为二甲硅油总量的1/4-1/8min-1，凝聚转速为600-2000rpm；后1/3-1/2质量的二甲硅油，加入速度为二甲硅油总量的1/8-1/30min-1，凝聚转速为200-400rpm。
3)凝聚结束后，将所得微球胚快速转移至5-25℃的正庚烷中进行硬化(硬化转速200-1000rpm)0.5-1.5h；硬化结束后，硬化结束后，用5-25℃的正庚烷清洗硬化后所得微球，清洗时间20-40min，清洗转速为200-1000rpm；过滤收集固体用正庚烷洗涤，真空干燥；将所得干燥微球与冻干介质重悬后，冷冻干燥即得窄粒径分布的曲普瑞林微球。
测试例1：微球凝聚过程二甲硅油(350cst)与二氯甲烷比例对微球胚稳定性影响探究。
准确称取8g PLGA溶于152g二氯甲烷中，完全溶解后，平均分成16等份，每份10g；在300rpm的搅拌条件下，分别按照二甲硅油和二氯甲烷重量比为0.1～1.6的比例进行凝聚反应；凝聚结束后，取样置于显微镜下观察微球胚形态，评估其是否处于稳定态。
表1二甲硅油与二氯甲烷比例对微球凝聚状态影响
备注：微球胚在凝聚中主要分为四个过程：
1)：相转变诱导剂(二甲硅油)加入量较低，诱导剂在有机相中形成假乳化状态，微球胚尚未形成，此时的状态记为Δ；
2)：随着二甲硅油加入量的增加，相转变逐渐发生，微球胚逐渐形成，但不稳定，易发生聚集，此时的状态记为○；
3)：二甲硅油的量达到一定程度，微球胚处于稳定状态，此时记为口；
4)：二甲硅油的量过多，导致微球胚聚集形成沉淀，此时状态记为☆；
由实验结果可以看出，对于350cst黏度二甲硅油，当二甲硅油与二氯甲烷比例为0.9～1.2时，微球胚处于稳定状态，此时将微球进行硬化，可以得到粒径分布更加稳定的微球。而二甲硅油黏度不同，微球凝聚处于稳定态时二甲硅油与二氯甲烷的比例也不同。对于低黏度二甲硅油，微球在凝聚过程处于稳定状态时二甲硅油与二氯甲烷的比例范围较小，随着二甲硅油黏度的升高，二甲硅油与二氯甲烷的比例范围提高。
测试例2：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，凝聚转速300rpm，2％油相浓度，20℃凝聚)
准确称取156mg醋酸曲普瑞林于90g二氯甲烷中，超声分散20min形成悬浮液A；将6.00gPLGA完全溶于140g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，二氯甲烷定重至306g。20℃水浴条件下，300rpm混合10min后，以30g/min的速度向其中匀速加入300g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为300rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用4.25L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用360mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝39μm，D50＝64μm，D90＝100μm，Span＝0.95；微球收率为76.6％。
测试例3：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，凝聚转速600rpm，2％PLGA，20℃凝聚)准确称取156mg醋酸曲普瑞林于90g二氯甲烷中，8000rpm剪切15min形成悬浮液A；将6.00gPLGA完全溶于140g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至306g。20℃水浴条件下，300rpm混合10min后，以30g/min的速度向其中匀速加入300g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为600rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用4.25L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用360mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝24μm，D50＝35μm，D90＝99μm；Span＝2.14；微球收率为74.7％。
测试例4：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，凝聚转速800rpm，4％PLGA，20℃凝聚)准确称取156mg醋酸曲普瑞林于60g二氯甲烷中，10000rpm剪切15min形成悬浮液A；将6.00gPLGA完全溶于80g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至156g。20℃水浴条件下，300rpm混合10min后，以15g/min的速度向其中匀速加入150g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为800rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，4.25L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用2.13L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用360mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝21μm，D50＝51μm，D90＝89μm；Span＝1.33；微球收率为68.6％。
测试例5：(二甲硅油(350cst)/DCM＝0.6：1，凝聚转速800rpm，4％PLGA，20℃凝聚，出现部分结块，微球收率低)
准确称取156mg醋酸曲普瑞林于60g二氯甲烷中，10000rpm剪切15min形成悬浮液A；将6.00g PLGA完全溶于80g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至156g。20℃水浴条件下，300rpm混合10min后，以9g/min的速度向其中匀速加入90g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为800rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，4.25L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用2.13L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用360mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝18μm，D50＝56μm，D90＝97μm；Span＝1.41；微球收率为47.4％。
测试例6：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，凝聚转速1000rpm，4％PLGA，20℃凝聚)
准确称取156mg醋酸曲普瑞林于60g二氯甲烷中，超声分散15min形成悬浮液A；将6.00g PLGA完全溶于80g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至156g。20℃水浴条件下，300rpm混合10min后，以15g/min的速度向其中匀速加入150g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为1000rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，4.25L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用2.13L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用360mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝24μm，D50＝48μm，D90＝98μm；Span＝1.54；微球收率为78.3％。
表2测试例数据汇总
由测试例数据可以看出，针对350cst黏度二甲硅油，当二甲硅油与二氯甲烷比例为1∶1时(由表1可知，在0.9～1.2∶1范围内时，微球凝聚时处于稳定态)；当油相比例固定时，增大凝聚转速，微球粒径呈降低趋势(测试例2和3)；但当凝聚转速增大到一定转速后，凝聚转速对微球粒径影响相对较小(测试例4和6)；增大油相浓度后，即使增大凝聚转速，微球粒径也相应呈增大趋势(测试例3和4)；当微球凝聚处于非稳态时将其硬化，微球收率会因结块而收率降低，其粒径分布也较宽。
实施例1：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速800rpm，加入凝聚剂总量的2/3，加入速度为凝聚剂总量的1/6min-1；后转至300rpm，加入凝聚剂总量的1/3，加入速度为凝聚剂总量的1/15min-1。2％PLGA，20℃凝聚)
准确称取156mg醋酸曲普瑞林于90g二氯甲烷中，10000rpm剪切15min形成悬浮液A；
将6.00g PLGA完全溶于140g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至306g。20℃水浴条件下，300rpm混合10min后，以50g/min的速度向其中匀速加入200g 20℃的二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为800rpm；之后将凝聚剂加入速度降为20g/min，继续加入5min，凝聚转速为300rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为500rpm；之后采用4.25L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为500rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用360mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝22μm，D50＝32μm，D90＝46μm；Span＝0.75；微球收率为96.7％。
实施例2：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速1000rpm，加入凝聚剂总量的2/3，加入速度为凝聚剂总量的1/6min-1；后转至300rpm，加入凝聚剂总量的1/3，加入速度为凝聚剂总量的1/15min-1。4％PLGA，20℃凝聚)
准确称取156mg醋酸曲普瑞林于60g二氯甲烷中，10000rpm剪切15min形成悬浮液A；将6.00g PLGA完全溶于80g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至156g。20℃水浴条件下，300rpm混合10min后，以25g/min的速度向其中匀速加入100g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为1000rpm；之后将凝聚剂加入速度降为10g/min，继续加入5min，凝聚转速为300rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，4.25L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用2.13L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用360mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝16μm，D50＝31μm，D90＝51μm；Span＝1.13；微球收率为95.2％。
实施例3：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速1000rpm，加入凝聚剂总量的3/5，加入速度为凝聚剂总量的1/4min-1；后转至300rpm，加入凝聚剂总量的2/5，加入速度为凝聚剂总量的1/30min-1。4％PLGA，20℃凝聚)
准确称取156mg醋酸曲普瑞林于60g二氯甲烷中，超声分散15min形成悬浮液A；将6.00g PLGA完全溶于80g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至156g。20℃水浴条件下，500rpm混合5min后，以37.5g/min的速度向其中匀速加入90g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为1000rpm；之后将凝聚剂加入速度降为5g/min，继续加入12min，凝聚转速为300rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，4.25L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用2.13L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用360mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝18μm，D50＝32μm，D90＝46μm；Span＝0.88；微球收率为95.6％。
实施例4：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速800rpm，加入凝聚剂总量的3/5，加入速度为凝聚剂总量的1/5min-1；后转至200rpm，加入凝聚剂总量的2/5，加入速度为凝聚剂总量的1/25min-1。4％PLGA，20℃凝聚)
准确称取324mg醋酸曲普瑞林于100g二氯甲烷中，超声分散20min形成悬浮液A；将12.00g PLGA完全溶于150g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至312g。20℃水浴条件下，600rpm混合5min后，以60.0g/min的速度向其中匀速加入180g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为800rpm；之后将凝聚剂加入速度降为12g/min，继续加入10min，凝聚转速为200rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为600rpm；之后采用4.26L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用720mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝24μm，D50＝35μm，D90＝48μm；Span＝0.69；微球收率为97.8％。
实施例5：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速800rpm，加入凝聚剂总量的3/5，加入速度为凝聚剂总量的1/8min-1；后转至200rpm，加入凝聚剂总量的2/5，加入速度为凝聚剂总量的1/30min-1。4％PLGA，10℃凝聚)
准确称取324mg醋酸曲普瑞林于100g二氯甲烷中，10000rpm剪切20min形成悬浮液A；将12.00g PLGA完全溶于150g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至312g。10℃水浴条件下，600rpm混合5min后，以37.5g/min的速度向其中匀速加入180g 10℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为800rpm；之后将凝聚剂加入速度降为10g/min，继续加入12min，凝聚转速为200rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至10℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为600rpm；之后采用4.26L 10℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为600rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用720mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝28μm，D50＝37μm，D90＝57μm；Span＝0.78；微球收率为96.3％。
实施例6：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1.2∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速800rpm，加入凝聚剂总量的3/5，加入速度为凝聚剂总量的1/4min-1；后转至200rpm，加入凝聚剂总量的2/5，加入速度为凝聚剂总量的1/30min-1。4％PLGA，15℃凝聚)
准确称取324mg醋酸曲普瑞林于100g二氯甲烷中，10000rpm剪切20min形成悬浮液A；
将12.00g PLGA完全溶于150g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至312g。15℃水浴条件下，200rpm混合15min后，以90.0g/min的速度向其中匀速加入216g 15℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为800rpm；之后将凝聚剂加入速度降为12g/min，继续加入144g二甲硅油，凝聚转速为200rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至10℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为600rpm；之后采用4.26L 10℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用720mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝28μm，D50＝42μm，D90＝66μm；Span＝0.90；微球收率为95.2％。
实施例7：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速1000rpm，加入凝聚剂总量的3/5，加入速度为凝聚剂总量的1/5min-1；后转至400rpm，加入凝聚剂总量的2/5，加入速度为凝聚剂总量的1/30min-1。10％PLGA，20℃凝聚)
准确称取810mg醋酸曲普瑞林于120g二氯甲烷中，超声分散20min形成悬浮液A；将30.00g PLGA完全溶于150g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至330g。20℃水浴条件下，800rpm混合10min后，以60.0g/min的速度向其中匀速加入180g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为1000rpm；之后将凝聚剂加入速度降为10g/min，继续加入12min，凝聚转速为400rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至20℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为600rpm；之后采用4.26L 10℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用1.8L正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝27μm，D50＝39μm，D90＝60μm；Span＝0.85；微球收率为98.1％。
实施例8：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速2000rpm，加入凝聚剂总量的3/5，加入速度为凝聚剂总量的1/5min-1；后转至400rpm，加入凝聚剂总量的2/5，加入速度为凝聚剂总量的1/25min-1。4％PLGA，20℃凝聚)
准确称取324mg醋酸曲普瑞林于120g二氯甲烷中，超声分散20min形成悬浮液A；将12.00g PLGA完全溶于150g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至312g。20℃水浴条件下，800rpm混合10min后，以60.0g/min的速度向其中匀速加入180g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为2000rpm；之后将凝聚剂加入速度降为12g/min，继续加入10min，凝聚转速为300rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至20℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用4.26L 10℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用720mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝24μm，D50＝36μm，D90＝50μm；Span＝0.67；微球收率为98.3％。
实施例9：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速800rpm，加入凝聚剂总量的2/3，加入速度为凝聚剂总量的1/6min-1；后转至200rpm，加入凝聚剂总量的1/3，加入速度为凝聚剂总量的1/15min-1。1％PLGA，20℃凝聚)
准确称取81mg醋酸曲普瑞林于90g二氯甲烷中，10000rpm剪切10min形成悬浮液A；将3.00g PLGA完全溶于140g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至303g。20℃水浴条件下，300rpm混合10min后，以50g/min的速度向其中匀速加入200g 20℃的二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为800rpm；之后将凝聚剂加入速度降为20g/min，继续加入5min，凝聚转速为200rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为500rpm；之后采用4.25L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为500rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用180mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝15μm，D50＝21μm，D90＝30μm；Span＝0.71；微球收率为95.6％。
实施例10：(二甲硅油(350cst)/DCM＝0.9∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速800rpm，加入凝聚剂总量的2/3，加入速度为凝聚剂总量的1/6min-1；后转至300rpm，加入凝聚剂总量的1/3，加入速度为凝聚剂总量的1/30min-1。4％PLGA，20℃凝聚)
准确称取324mg醋酸曲普瑞林于100g二氯甲烷中，超声分散20min形成悬浮液A；将12.00g PLGA完全溶于150g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至312g。20℃水浴条件下，400rpm混合15min后，以45.0g/min的速度向其中匀速加入180g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为800rpm；之后将凝聚剂加入速度降为9g/min，继续加入10min，凝聚转速为300rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用4.26L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用720mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝17μm，D50＝32μm，D90＝43μm；Span＝0.81；微球收率为96.3％。
实施例11：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速600rpm，加入凝聚剂总量的3/5，加入速度为凝聚剂总量的1/5min-1；后转至200rpm，加入凝聚剂总量的2/5，加入速度为凝聚剂总量的1/30min-1。4％PLGA，20℃凝聚)
准确称取324mg醋酸曲普瑞林于100g二氯甲烷中，10000rpm剪切20min形成悬浮液A；将12.00g PLGA完全溶于150g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至312g。20℃水浴条件下，600rpm混合5min后，以60.0g/min的速度向其中匀速加入180g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为600rpm；之后将凝聚剂加入速度降为10g/min，继续加入12min，凝聚转速为200rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用4.26L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用720mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝21μm，D50＝35μm，D90＝53μm；Span＝0.91；微球收率为96.4％。
实施例12：(二甲硅油(350cst)/DCM＝1∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速600rpm，加入凝聚剂总量的3/5，加入速度为凝聚剂总量的1/5min-1；后转至400rpm，加入凝聚剂总量的2/5，加入速度为凝聚剂总量的1/30min-1。4％PLGA，20℃凝聚)
准确称取324mg醋酸曲普瑞林于100g二氯甲烷中，10000rpm剪切20min形成悬浮液A；将12.00g PLGA完全溶于150g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至312g。20℃水浴条件下，600rpm混合5min后，以60.0g/min的速度向其中匀速加入180g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为600rpm；之后将凝聚剂加入速度降为10g/min，继续加入12min，凝聚转速为400rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用4.26L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用720mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝26μm，D50＝36μm，D90＝58μm；Span＝0.89；微球收率为95.3％。
实施例13：(二甲硅油(1000cst)/DCM＝1.6∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速800rpm，加入凝聚剂总量的3/5，加入速度为凝聚剂总量的1/8min-1；后转至300rpm，加入凝聚剂总量的2/5，加入速度为凝聚剂总量的1/30min-1。4％PLGA，20℃凝聚)
准确称取324mg醋酸曲普瑞林于120g二氯甲烷中，超声分散20min形成悬浮液A；将12.00g PLGA完全溶于150g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至312g。20℃水浴条件下，800rpm混合5min后，以60.0g/min的速度向其中匀速加入288g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为800rpm；之后将凝聚剂加入速度降为16g/min，继续加入12min，凝聚转速为300rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用4.26L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用720mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝24μm，D50＝30μm，D90＝45μm；Span＝0.63；微球收率为96.2％。
实施例14：(二甲硅油(50cst)/DCM＝0.5∶1，梯度改变凝聚转速，初始凝聚转速1000rpm，加入凝聚剂总量的2/3，加入速度为凝聚剂总量的1/6min-1；后转至300rpm，加入凝聚剂总量的1/3，加入速度为凝聚剂总量的1/30min-1。4％PLGA，20℃凝聚)
准确称取324mg醋酸曲普瑞林于120g二氯甲烷中，超声分散20min形成悬浮液A；将12.00g PLGA完全溶于150g二氯甲烷中，记为溶液B；将A和B混合后，定重至312g。20℃水浴条件下，600rpm混合10min后，以25.0g/min的速度向其中匀速加入100g 20℃二甲硅油进行凝聚反应，凝聚转速为1000rpm；之后将凝聚剂加入速度降为5g/min，继续加入10min，凝聚转速为300rpm。凝聚结束后，将凝聚液快速转移至15℃，8.5L正庚烷溶液中硬化1h，硬化转速为800rpm；之后采用4.26L 15℃正庚烷清洗硬化后的微球，清洗0.5h，清洗转速为800rpm。微球采用10μm筛网进行过滤收集，并用720mL正庚烷对微球进行冲洗，冲洗后真空干燥并冷冻干燥。微球的D10＝21μm，D50＝32μm，D90＝58μm；Span＝1.16；微球收率为95.2％。
表3实施例数据汇总
由实施例数据结果可以看出，对于350cst黏度二甲硅油，按照本发明思路，在凝聚反应前期，微球胚处于不稳定状态，此时通过加快二甲硅油加入速度，同时提高微球凝聚时的凝聚转速，可以获得粒径较小的微球胚；而在凝聚后期，由于微球胚逐渐进入稳定态，此时适当降低微球凝聚转速，同时降低二甲硅油的加入速度，能够使二甲硅油更加均匀分散的同时，又不会因为凝聚转速太快而破坏前期凝聚的微球胚；按照本发明思路进行微球凝聚，微球的粒径分布均较窄，且收率均高于95％，既提高了收率，节省了成本，同时又获得了释放平稳，患者顺应性高的产品。
对比分析实施例数据可以发现，该发明思路具有较宽的操作范围：对于350cst二甲硅油，当二甲硅油与二氯甲烷的比例在0.9～1.2之间时，前期凝聚转速为600～2000rpm，后期凝聚转速为200～400范围内，微球的收率均在95％以上。对于1000cst黏度的二甲硅油，微球胚处于稳定态时二甲硅油与二氯甲烷的比例范围要宽于350cst黏度硅油，而对于50cst黏度的二甲硅油，其微球处于稳定态是二甲硅油与二氯甲烷的比例范围则明显窄于350cst黏度的硅油；与此同时，在相同条件下凝聚得到的稳定态的微球时，低黏度的硅油，其二甲硅油与二氯甲烷的比例较低，而对于高粘度硅油，其二甲硅油与二氯甲烷的比例较高。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (8)
1.一种窄粒径分布的曲普瑞林微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将醋酸曲普瑞林分散于二氯甲烷中，制成混悬液A，将PLGA溶解于二氯甲烷中，形成溶液B；
2）将混悬液A和溶液B混合均匀，用二氯甲烷定重，混合均匀，向所得混合液中逐渐加入二甲硅油进行凝聚反应，凝聚过程的温度控制在5-25℃，同时梯度调节凝聚转速，在二甲硅油的添加过程中，前1/2-2/3质量的二甲硅油，加入速度为二甲硅油总量的1/4-1/8 min-1，凝聚转速为600 -2000 rpm；后1/3-1/2质量的二甲硅油，加入速度为二甲硅油总量的1/8-1/30 min-1，凝聚转速为200-400 rpm；
3）凝聚结束后，将所得微球胚快速转移至正庚烷中进行硬化；硬化结束后，过滤收集固体并洗涤，干燥；将所得干燥微球与冻干介质重悬后，冷冻干燥即得窄粒径分布的曲普瑞林微球。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1）中，将醋酸曲普瑞林分散于二氯甲烷后，经超声10-30 min分散或5000-15000 rpm高速剪切10-30 min后制成混悬液A。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述醋酸曲普瑞林占定重后所得混合溶液重量的0.05-1%；PLGA占定重后所得混合液重量的1-10%。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，定重后在5-25 ℃水浴、200-800 rpm条件下混合5-15 min。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述二甲硅油的粘度为20~1000 cst。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述二甲硅油与二氯甲烷的质量比为0.5-1.6:1。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3）中，硬化温度为5-25 ℃，硬化转速为200-1000 rpm，硬化时间为0.5-1.5 h。
8.如权利要求1或7所述的制备方法，其特征在于：步骤3）中，硬化结束后，用5-25 ℃的正庚烷清洗硬化后所得微球，清洗时间20-40 min，清洗转速为200-1000 rpm；过滤收集固体用正庚烷洗涤，真空干燥。
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