CN112661691B

CN112661691B - 一种邻硝基苯乙醇衍生物及其制备方法和应用

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Publication number: CN112661691B
Application number: CN202011633078.9A
Authority: CN
Inventors: 宋森川; 史华红; 麦裕良; 文武; 路芳
Original assignee: Institute of Chemical Engineering of Guangdong Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Chemical Engineering of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112661691A

Abstract

本发明公开了一种邻硝基苯乙醇衍生物及其制备方法和应用，所述邻硝基苯乙醇衍生物的结构式为

Description

一种邻硝基苯乙醇衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光染料技术领域，尤其涉及一种邻硝基苯乙醇衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

光致激发的荧光染料是一类平时处于稳定的“暗状态”，经合适波长的光照射激发后转换成“亮状态”，荧光强度有很大提升的化合物。基于这种特性，光致激发的荧光染料具有非常优秀的可控性，可以定时定区域发射。因此，光致激发的荧光染料被广泛应用在超分辨荧光显微镜、选择性细胞成像、荧光探针、动态生化过程监控等生物领域上，是如今生命科学研究中不可或缺的重要工具。

光致激发荧光染料分子的结构一般由生色团和笼弊基团构成，其中生色团起到发射荧光的作用；笼弊基团则是抑制生色团的荧光发射，使其处于稳定的“暗状态”的基团；两者由易感光的化学键相连。当光致激发荧光染料分子受到合适波长的光的照射后，易感光的化学键将受到破坏，从而使生色团脱离笼弊基团，开始发射荧光。目前常用的笼弊基团多为邻硝基苄醇的衍生物，如4,5-二甲氧基-2-硝基苄醇，这类化合物具有稳定，受激发后迅速断键放出生色团的优点。然而，邻硝基苄醇在发生光化学反应时易产生具有细胞毒性的副产物，这在生命科学研究中显然是应该尽量避免的。因此，合成新型的在发生光化学反应时不会产生有毒副产物的光激发荧光探针具有重大的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种邻硝基苯乙醇衍生物，该邻硝基苯乙醇衍生物在光照下能发出强烈的荧光，且在发生光化学反应时不产生有毒副产物。

本发明还提供所述邻硝基苯乙醇衍生物的制备方法和应用。

具体地，本发明采取如下的技术方案：

本发明的第一方面是提供一种邻硝基苯乙醇衍生物，所述邻硝基苯乙醇衍生物具有如下式1的结构式：

其中，所述R为C1～C18烷基。

优选地，所述R为C1～C10的支链烷烃或含支链的烷烃，更优选为C1～C5的支链烷烃或含支链的烷烃。在一些实施方式中，所述R包括-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂中的至少一种。

本发明的第二方面是提供一种邻硝基苯乙醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)使3-甲基-4-硝基苯甲酸甲酯

与聚甲醛反应，生成3-(2-羟乙基)-4-硝基苯甲酸甲酯

(2)使用还原剂还原所述3-(2-羟乙基)-4-硝基苯甲酸甲酯

的羰基，得到2-(5-羟甲基-2-硝基苯基)乙醇

(3)选择性氧化所述2-(5-羟甲基-2-硝基苯基)乙醇

得到3-(2-羟乙基)-4-硝基苯甲醛

(4)将2,3,3-三甲基-3H-吲哚

烷基化得到2,3,3-三甲基-3H-吲哚的N烷基化衍生物

(5)使所述2,3,3-三甲基-3H-吲哚的N烷基化衍生物

和3-(2-羟乙基)-4-硝基苯甲醛

发生缩合反应，得到结构式为

的邻硝基苯乙醇衍生物；

所述R为C1～C18烷基，X^-包括Cl^-、I^-、Br^-、HSO₃ ^-中的至少一种。

上述制备过程的反应路线为：

步骤(1)为对甲醛羰基的亲核加成，所述反应在避光条件下进行。

步骤(1)中，所述反应的温度为60～80℃，反应的时间为2～4小时。

步骤(1)中，所述反应在碱存在的条件下进行。所述碱包括苯酚钠、氢化钠、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾中的至少一种。通过使用碱拔出3-甲基-4-硝基苯甲酸甲酯中的甲基。

步骤(1)中，所述反应在溶剂存在下进行，所述溶剂包括二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的至少一种。

步骤(1)中，所述反应结束后还包括分离纯化步骤。所述分离纯化步骤具体为：采用有机溶剂对反应液进行萃取，然后将萃取后的有机相进行干燥、过滤、柱层析分离。所述萃取采用的有机溶剂为酯类溶剂，如乙酸乙酯。所述柱层析分离采用的淋洗液为乙酸乙酯/二氯甲烷混合液，所述乙酸乙酯与二氯甲烷的体积比为1:2～4，优选1:3。

步骤(2)为对酯基的还原反应，所述还原在避光条件下进行。

步骤(2)中，所述还原的温度为0～70℃，时间为2～4小时。

步骤(2)中，所述还原剂包括氢化锂铝(LiAlH₄)、二异丁基氢化铝(DIBALH)中的至少一种。

步骤(2)中，所述还原结束后还包括分离纯化步骤。所述分离纯化步骤具体为：采用有机溶剂对反应液进行萃取，然后将萃取后的有机相进行干燥、浓缩、柱层析分离。所述萃取采用的有机溶剂为酯类溶剂，如乙酸乙酯。所述柱层析分离采用的淋洗液为乙酸乙酯/二氯甲烷混合液，所述乙酸乙酯与二氯甲烷的体积比为2～4:1，优选3:1。

步骤(3)为对羟基的选择性氧化，所述氧化在避光条件下进行。

步骤(3)中，所述氧化的温度为0～70℃，优选室温；氧化的时间为10～15小时。

步骤(3)中，所述氧化剂包括二氧化锰。步骤(3)通过采用二氧化锰作为氧化剂可对2-(5-羟甲基-2-硝基苯基)乙醇中的对位羟基进行选择性氧化。

步骤(3)中，所述氧化结束后还包括分离纯化步骤。所述分离纯化步骤具体为：过滤所述氧化剂，对滤液进行柱层析分离。所述柱层析分离采用的淋洗液为乙酸乙酯/二氯甲烷混合液，所述乙酸乙酯与二氯甲烷的体积比为1:2～4，优选1:3。

步骤(4)为季铵盐的形成，通过将2,3,3-三甲基-3H-吲哚与R-X反应得到

X包括Cl、I、Br、HSO₃中的至少一种。

步骤(4)中，所述反应结束后还包括分离纯化步骤。所述分离纯化步骤具体为：对反应混合物进行浓缩、干燥、洗涤、重结晶。

步骤(5)为醛基和活泼甲基的缩合反应，所述2,3,3-三甲基-3H-吲哚的N烷基化衍生物和3-(2-羟乙基)-4-硝基苯甲醛的摩尔比为1:1～1.2。

步骤(5)中，所述反应在避光条件下进行。

步骤(5)中，所述反应的温度为30～50℃。

步骤(5)中，所述反应结束后还包括分离纯化步骤。所述分离纯化步骤具体为：对反应混合物的有机相进行洗涤、干燥、浓缩，得到浓缩液，最后对所述浓缩液进行柱层析分离。所述洗涤采用的洗涤液包括水和/或稀盐酸。所述柱层析分离采用的淋洗液为乙酸乙酯/己烷混合液，所述乙酸乙酯与己烷的体积比为1:0.5～1.5，优选1:1。

上述制备过程中，最初的原料之一3-甲基-4-硝基苯甲酸甲酯可直接购买，也可以通过使3-甲基-4-硝基苯甲酸与甲醇进行酯化反应而得。所述甲醇既作为反应物也作为溶剂，需加量加入；酸为浓硫酸，反应温度使甲醇保持回流。

本发明的第三方面是提供所述邻硝基苯乙醇衍生物在制备荧光探针、制备荧光标志、细胞染色或组织染色中的应用。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种新型的邻硝基苯乙醇衍生物，为荧光染料，在光照下能发出强烈的荧光，且在发生光化学反应时不产生有毒副产物，在生命科学研究中具有很好的应用前景。本发明的制备方法简单，条件温和，适用于规模化生产。

附图说明

图1为化合物8经紫外光照射不同时间的荧光强度。

具体实施方式

以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。以下描述中，如无特殊说明，冰浴对应的温度约为0℃，室温为15～25℃。

化合物8

的合成：

第一步：3-甲基-4-硝基苯甲酸甲酯的制备

将化合物1(3-甲基-4-硝基苯甲酸，10g)置于250mL的圆底烧瓶中，加入100mL甲醇，向所得溶液逐滴加入浓硫酸(2mL)，回流反应4小时。反应结束后将所得溶液浓缩，后加入蒸馏水稀释(100mL)，用乙酸乙酯萃取数次，合并有机相并依次用碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤。所得溶液用无水硫酸钠干燥后，蒸干可得到10.3g淡黄色固体化合物2(3-甲基-4-硝基苯甲酸甲酯)。

化合物2的¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ7.97-8.03(m,3H),3.96(s,3H),2.63(s,3H)ppm。

第二步：3-(2-羟乙基)-4-硝基苯甲酸甲酯的制备

在25mL圆底烧瓶中分别加入化合物2(2.92g)、DMSO(8mL)、多聚甲醛(0.45g)和苯酚钠(250mg)。在80℃避光的条件下搅拌反应3小时。反应结束后加入100mL蒸馏水，混合物用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相并用硫酸镁干燥。随后过滤浓缩得到粗产物和未反应原料的混合物。混合物经柱层析分离回收原料化合物2约1.9g，并得到0.9g淡黄色固体的化合物3(3-(2-羟乙基)-4-硝基苯甲酸甲酯)(淋洗液为乙酸乙酯/二氯甲烷体积比为1:3的溶液)。

化合物3的¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.50(s,1H),8.13(d,J＝8.1Hz,1H),7.51(d,J＝8.1Hz,1H),4.81(s,5H),3.18(t,J＝6.0Hz,2H)ppm。

第三步：2-(5-羟甲基-2-硝基苯基)乙醇的制备

将500mg的化合物3溶解于无水THF(2mL)并置于冰浴中冷却，在氮气保护下逐滴加入二异丁基氢化铝DIBALH(以5mL 1.0M的THF溶液加入)，并保持冰浴反应半小时。随后移除冰浴，在室温下避光继续搅拌3小时。接着加入甲醇(10mL)来终止反应，并用盐酸调节溶液的pH值为3～4。用乙酸乙酯萃取数次，合并后的有机相经硫酸钠干燥后过滤并浓缩可得粗产物。粗产物经柱层析分离(淋洗液为乙酸乙酯/二氯甲烷体积比为3:1的溶液)得到306mg橘黄色固体化合物4(2-(5-羟甲基-2-硝基苯基)乙醇)。

化合物4的¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ7.97(d,J＝8.1Hz,1H),7.44(s,1H),7.39(d,J＝8.4Hz,1H),4.80(d,J＝5.1Hz,2H),3.98(dd,J＝3.3,11.4Hz,2H),3.21(t,J＝6.6Hz,2H)ppm。

第四步：3-(2-羟乙基)-4-硝基苯甲醛的制备

将化合物4(100mg)溶解于3mL无水二氯甲烷中，再加入二氧化锰粉末(227mg)，所得悬浮液室温避光搅拌反应过夜。向反应混合物中加入适量乙酸乙酯，随后用硅藻土过滤除去二氧化锰粉末得到粗产物，粗产物经柱层析分离后(淋洗液为乙酸乙酯/二氯甲烷体积比为1:3的溶液)得到77mg黄色固体化合物5[3-(2-羟乙基)-4-硝基苯甲醛]。

化合物5的¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ10.1(s,1H),8.00(d,J＝8.5Hz,1H),7.96(s,1H),7.89(d,J＝8.5Hz,1H),3.99(t,J＝5.0Hz,2H),3.21(t,J＝5.0Hz,2H)ppm。¹³C NMR(500MHz,CDCl₃):190.6,153.4,138.7,134.2,128.5,125.5,62.5,35.7ppm。

第五步：碘化(2,3,3-三甲基-1-丙基-3H-吲哚)的制备

将化合物6(1.0g)溶于5mL乙醇，随后向溶液中加入1-碘丙烷(5.3mL)。反应混合物搅拌回流15小时后浓缩并真空干燥得到粗产物。粗产物用乙醚洗涤后，经丙酮重结晶可得到0.72g粉色固体化合物7[碘化(2,3,3-三甲基-1-丙基-3H-吲哚)]。

化合物7的¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ1.04(t,3H,J＝7.2Hz),1.34(m,2H),1.64(s,6H),2.67(s,3H),4.17(t,2H,J＝7.8Hz),7.63(d,2H,J＝7.4Hz),7.82(m,2H)ppm。

第六步：邻硝基苯乙醇衍生物化合物8的制备

将50mg的化合物5和77mg的化合物7溶解置于50mL圆底烧瓶，向其中加入15mL乙醇溶解混合物，随后向溶液中滴加几滴乙酸。将烧瓶置于40℃下避光搅拌反应24小时，之后向烧瓶中加入乙酸乙酯(50mL)终止反应。有机相依次用稀盐酸和水洗涤一次，最后用硫酸钠干燥。干燥后的溶液浓缩后得到粗产物，粗产物经柱层析分离(淋洗液为乙酸乙酯/己烷体积比为1:1的溶液)得到50mg橘黄色固体化合物8。

化合物8的¹H NMR(500MHz,DMSO):δ8.00-8.04(m,3H),7.91(dd,J＝1.5,16.5Hz,1H),7.79(m,2H),7.52(d,2H,J＝7.4Hz),7.37(dd,J＝2.0,17Hz,1H),4.24(t,2H,J＝7.2Hz),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),3.04(t,J＝6.0Hz,2H),1.64(m,2H),1.32(s,3H),1.17(s,3H),0.91(t,3H,J＝9.6Hz)ppm。

化合物8的性能：

化合物8在光照下可发生如下光致关环反应，发出荧光：

将37.8mg化合物8溶解于10mL体积比为3:1的甲醇/PBS溶液(10mM，pH＝7.4)。将溶液置于365nm紫外下照射1分钟内即可观察到强烈的荧光，分别记录照射0.5、1、2、3、5、8、11、14分钟后的荧光发射，可观测到发射强度提升达200倍以上，结果如图1所示，化合物的最大发射峰位于568nm。照射30分钟后，向溶液中加入甲醇稀释到100mL，并将稀释后的溶液通过ESI-MS检测，可得在378和360附近找到两个明显的分子离子峰，分别归属于化合物8和8'。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。