CN112641810A - 一种干酪乳杆菌k11与苦瓜皂苷降血糖组合物制备方法及应用 - Google Patents
一种干酪乳杆菌k11与苦瓜皂苷降血糖组合物制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于食品、生物医药微生物技术领域，公开了一种降血糖益生菌联合活性物质的制备方法及应用。所述降血糖组合物由副干酪乳杆菌K11(Lactobacillus casei K11)和苦瓜皂苷（BGE）组成，所述降血糖组合物的功能包括：复合制剂降血糖效果和机制，所述降血糖组合物的固体饮料的制备。本发明提供的益生菌组合物具有优良的降血糖效果，具有非常广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品、药品微生物技术领域，尤其涉及一种干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷联合降血糖功能、组合物制备方法及应用。
背景技术
2型糖尿病是一种慢性代谢性疾病，其特征是高血糖症。2型糖尿病引起许多并发症，包括对心脏，血管，神经，肾脏和眼睛的损害。2019年，全球约有4.63亿糖尿病患者因此，迫切需要找到一种新颖，安全，有效的方法来控制2型糖尿病。
益生菌通常被认为是安全的，并且在维持肠道菌群中起着重要的作用。它们对宿主产生有益的作用，被广泛用于缓解2型糖尿病。此外，苦瓜皂苷作为苦瓜中的一种活性成分，具有改善2型糖尿病及其并发症的潜力。但有关益生菌与苦瓜皂苷组合的缓解2型糖尿病目前未见报道。因此，筛选并开发优良的降血糖益生菌与活性物质组合产品具有重要的研究意义和应用价值。
在目前已经公开的文献与专利或专利申请中，例如CN202010334295.1公开了一种治疗二型糖尿病的复合微生物制剂；CN202010135872.4公开了一种可以用于改善糖尿病的复合益生菌；CN201510571262.8公开了一种具有稳态化调控血糖的营养产品。针对上述背景技术中已有的实现方案，这些专利或专利申请的共同点都是应用多株混合菌种或菌与多种成分混合使用来预防或缓解2型糖尿病，而多种混合物的成分或其他潜在副作用仍不够明朗。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：有关益生菌与苦瓜皂苷组合的降血糖的复合制剂目前未见报道。原因在于能够与苦瓜皂苷复配的有效益生菌未被有效开发，并且菌株的功能具有差异性，同时有效益生菌与苦瓜皂苷的合理配比与组合效果及机制未被有效验证与探究。
上述问题的瓶颈在于：缺乏有效的降血糖益生菌株和有效降血糖的益生菌与苦瓜皂苷协同效果的组合，缺乏降血糖组合物的效果验证与机制揭示。解决以上问题及缺陷的意义在于：开发出高效改善血糖的菌株与苦瓜皂苷组合物，揭示该组合物协同改善血糖的机制，为开发降血糖产品的提供可靠的理论依据和有效的干预方式。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种降血糖组合物制备方法及应用、尤其涉及一种能够显著降血糖的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合物及其用途。
本发明是这样实现的，一种降血糖组合物，所述降血糖组合物由干酪乳杆菌K11菌液和苦瓜皂苷水溶液混合，比例为1:8~10，浓度分别为109CFU/mL和0.01g/mL组成。
所述降血糖组合物调节2型糖尿病中的效果，干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合具有显著的改善2型糖尿病的功能，干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合干预2型糖尿病小鼠8周就可以能够延缓小鼠体重降低，空腹血糖从16.1mmol/L降低至9.38mmol/L，餐后血糖水平从28.06mmol/L降低至12.93mmol/L，增加肠道肠道激素胰升血糖素样肽1（GLP-1）水平至4.55pmol/L。
所述降血糖组合物调节2型糖尿病中的机制，干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合可以通过增加肠道内短链脂肪酸，特别是丁酸的含量。丁酸作为一种小分子活性物质，可以作用于肠道G蛋白欧联受体43，增加肠道GLP-1的表达，进而起到降低高血糖水平的作用。
所述降血糖组合物的固体饮料的制备，所述原料包括干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合的冻干粉、水果粉、低聚半乳糖粉、乳糖醇、麦芽糊精和柠檬酸；所述益生菌固体饮料的原料质量配比为：干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合的冻干粉5-7份、水果粉28-35份、低聚半乳糖粉18-22份、乳糖醇5-7份、麦芽糊精28-35份、柠檬酸0.5-1份。
所述方法制备的降血糖组合物的固体饮料，其特征在于，所述益生菌酸奶中，益生菌活菌数为109CFU/g。
本发明涉及的单菌株干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷便具有良好的血糖缓解效果，可以作为替代传统药物的优良微生物制剂，用于调节血糖，缓解2型糖尿病。与现有技术相比，本案例结合体外胃肠道生存能力评价法，快速、精准地获得了潜在的功能性菌株。通过2型糖尿病小鼠进行验证，获得了有效改善2型糖尿病的功能性菌株复合物。因此，本发明主要有以下优点：（1）菌株制备方法是安全且无污染。本发明提供的干酪乳杆菌K11菌粉的制备方法仅适用于绿色原料，所制备的细菌粉安全无毒，干燥过程不会污染环境；（2）菌株胃肠道存活性能突出。本发明提供的干酪乳杆菌K11具有良好的肠道生存能力，能够很好地耐受模拟胃肠道生存环境；（3）组合物降血糖效果显著。当干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合后，对2型糖尿病小鼠具有显著的改善效果，降低小鼠空腹和餐后血糖，与阳性药物阿卡波糖无显著性差异。
综上，本发明提供的益生菌与活性天然产物组合物具有优良的降血糖效果，是改善血糖的首选，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的降血糖组合物的制备方法流程图。
图2是干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷体外共培养的示意图。
图3(a)是本发明实施例提供的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合对2型糖尿病小鼠体重影响示意图。
图3(b)是本发明实施例提供的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合对2型糖尿病小鼠空腹血糖影响示意图。
图3(c)是本发明实施例提供的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合对2型糖尿病小鼠餐后血糖影响示意图。
图3(d)是本发明实施例提供的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合对2型糖尿病小鼠糖化血红蛋白影响示意图。
图3(e)是本发明实施例提供的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合对2型糖尿病小鼠口服糖耐量影响示意图。
图4是本发明实施例提供的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合对2型糖尿病小鼠肠道GLP-1影响示意图。
图5(a)是本发明实施例提供的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合对2型糖尿病小鼠肠道短链脂肪酸影响示意图。
图5(b)是本发明实施例提供的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合对2型糖尿病小鼠肠道脂肪酸受体FFA2影响示意图。
图5(c)是本发明实施例提供的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合对2型糖尿病小鼠肠道脂肪酸受体FFA3影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种降血糖组合物、制备方法及应用，下面结合附图1对本发明作详细的描述。
上述菌株保藏编号为：CCTCC NO: M 2020823，分类命名为：干酪乳杆菌K11Lactobacillus casei K11，保藏时间：2020年12月02日，保藏地址：中国武汉武汉大学。干酪乳杆菌K11 16sRNA序列为：GGAGTCAACATTGTTCGACTTCCCCTAATCATTTGTCCCACCTTAGACGGCTCGCTCCCTAAAAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCGCTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATCTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTCCATGTTGAATCTCGGTGCAAGCACCGATCATCAACGAGAACTCGTTCGACTGCATTATAGCAGCGGCCCATCC。
如图1所示，本发明实施例提供的一种降血糖组合物、制备方法及应用包括以下步骤：步骤一，干酪乳杆菌K11培养：将干酪乳杆菌K11接种到发酵罐的增菌MRS培养基中培养，得发酵液；步骤二，干酪乳杆菌K11干燥：将干酪乳杆菌K11依次进行冷冻前预冷处理、预冻处理、主干燥处理及解析干燥处理，完成动物双歧杆菌冻干产品的制备；步骤三，干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷复合制剂的制备，制备得到复合制剂；步骤四，干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷复合制剂的效果：将干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷灌胃2型糖尿病小鼠，检测其对血糖及胰岛素抵抗的影响；步骤五，干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷降糖机制，通过高效液相色谱肠道短链氨基酸及相关基因表达；步骤六，将干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷复合制剂合理配比水果粉、低聚半乳糖、乳糖醇、麦芽糊精和柠檬酸。
具体实施例
实施例1、产品与剂型
（1）干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合制剂的配方，由干酪乳杆菌K11菌液和苦瓜皂苷水溶液混合，比例为1:8~10，浓度分别为109CFU/mL和0.01g/mL组成。
（2）干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合制剂型，为粉状混合物。
（3）干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合制剂包装，加脱氧剂、抽真空、充氮气。
实施例2. 干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷具有显著改善2型糖尿病血糖的功能
（1）干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷具有良好的体外生长能力
选取不同浓度梯度的苦瓜皂苷 1mg mL-1、1.5 mg mL-1、2 mg mL-1和2.5 mg mL-1与干酪乳杆菌K11进行体外共培养50h，期间每隔2h测定一次菌体的生长浓度，结果如图2所示。干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合物在30h左右达到稳定期，与单一菌株相比，添加苦瓜皂苷对干酪乳杆菌K11的生长没有明显的抑制作用（见图2）。
（2）干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合具有良好的血糖改善效果
2型糖尿病小鼠的体重显着下降，而干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合干预小鼠8周后，糖尿病小鼠的体重明显得到恢复（图3a）。图3b和c显示了在潜在的益生菌和植物提取物干预后，糖尿病小鼠的每周空腹血糖和餐后血糖变化。结果表明，在第5周至第13周，糖尿病组小鼠的血糖水平显着高于正常组（p <0.05）。在第13周，干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组具有显著的降血糖能力，这使空腹血糖水平降低了38.27％，餐后血糖水平降低了58.56％，与阿卡波糖组无差异（p<0.05）。如图3d所示，糖尿病组小鼠的糖化血红蛋白水平显着高于正常组组（p <0.05）干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷具有更高的改善糖化血红蛋白的能力，将糖化血红蛋白水平降低至223.89和218.72 ng/mL（p<0.05）。糖尿病小鼠的OGTT结果如图3e所示。糖尿病小鼠的血糖水平在30分钟时急剧上升，并且血糖水平高于其他组（p <0.05）。与糖尿病小鼠相比，干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组AUC葡萄糖值显着降低，下调了41.06％（p <0.05）。如图4所示，与正常小鼠相比，糖尿病小鼠肠道GLP-1水平明显降低（p <0.05），而干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合物干预组小鼠肠道GLP-1水平升高（p <0.05）。
（3）干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷治疗糖尿病小鼠的可能机制
对小鼠肠道中短链氨基酸水平进行了测试。图5a显示，糖尿病小鼠肠道中的乙酸，丙酸和丁酸水平显著降低（p <0.05），而补充干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合物后，肠道中乙酸、丙酸和丁酸的水平显著增加，特别是丁酸增加最为显著（p <0.05）。肠道脂肪酸受体FFAR2和FFAR3的mRNA表达水平如图5b和c所示。与正常组相比，糖尿病小鼠肠中FFAR2的表达下降了48.43％（p <0.05）。而补充干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合物后FFAR2的表达得到了恢复（p <0.05）。而FFAR3的表达均未发现显着差异。这表明，干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合物可能通过增加肠道中丁酸的含量，增加了FFAR2的表达，从而增加肠道中GLP-1的含量，最终发挥调节血糖的作用。
实施例3、干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合固体饮料的制备方法
（1）原料配方(以基本100g计)一种益生菌固体饮料的的制作步骤如下：
原料配制：干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合的冻干粉5-7份、水果粉28-35份、低聚半乳糖粉18-22份、乳糖醇5-7份、麦芽糊精28-35份、柠檬酸0.5-1份。以上各成分按照重量进行配比。
（2）混合，将经步骤（1）的原料过80目筛后倒入混合机，转速1000r/h，混合时间40min，充分混匀。
（3）灌装，经步骤（3）混匀后的原料倒入灌装设备，灌装塑封后得益生菌固体饮料产品。（4）检验，益生菌固体饮料倍比稀释后经平板计数，干酪乳杆菌L. casei K11菌粉的活菌量大于1×109 CFU/g。
本发明涉及的单菌株干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合具有良好的调节血糖效果，可以作为替代传统药物的优良微生物制剂，用于调节血糖稳定。与现有技术相比，本发明主要有以下优点：
（1）菌株制备方法是安全且无污染。本发明提供的干酪乳杆菌K11菌粉的制备方法仅适用于绿色原料，所制备的细菌粉安全无毒，干燥过程不会污染环境；
（2）菌株胃肠道存活性能突出。本发明提供的干酪乳杆菌K11具有良好的肠道生存能力，能够很好地耐受模拟胃肠道生存环境；
（3）组合物降血糖效果显著。当干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合后，对2型糖尿病小鼠具有显著的改善效果，降低小鼠空腹和餐后血糖。
综上，本发明提供的干酪乳杆菌K11与苦瓜皂苷组合物具有优良的降血糖效果，是改善2型糖尿病的新选择，具有非常广泛的应用前景。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种降血糖组合物，其特征在于，所述降血糖组合物由干酪乳杆菌K11 ( Lactobacillus casei K11)和苦瓜皂苷（BGE）组成，其微生物保藏编号为：CCTCC NO: M2020823，分类命名为：干酪乳杆菌K11 Lactobacillus casei K11，保藏时间：2020年12月02日，保藏地址：中国武汉武汉大学。
2.一种利用权利要求1所述的降血糖的组合剂，所述干酪乳杆菌K11和苦瓜皂苷组合组成，干酪乳杆菌K11菌液与苦瓜皂苷水溶液混合，比例为1:8~10，浓度分别为109CFU/mL和0.01g/mL组成。
3.一种利用权利要求1所述降血糖组合物调节2型糖尿病中的效果，其特征在于，干酪乳杆菌和苦瓜皂苷组合具有显著的改善2型糖尿病的功能。
4.如权利要求1所述降血糖组合物调节2型糖尿病中的机制，其特征在于，干酪乳杆菌K11和苦瓜皂苷组合可以作用于肠道G蛋白欧联受体43，增加肠道GLP-1的表达，进而起到降低高血糖水平的作用。
5.一种利用权利要求1所述降血糖组合物的固体饮料的制备，其特征在于，所述原料包括干酪乳杆菌K11和苦瓜皂苷组合的冻干粉、水果粉、低聚半乳糖粉、乳糖醇、麦芽糊精和柠檬酸。
6.根据权利要求5所述方法制备的降血糖组合物的固体饮料，其特征在于，所述益生菌酸奶中，干酪乳杆菌K11活菌数为109CFU/g。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210413 |
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