CN112625982A

CN112625982A - 一种水稻秸秆还田腐熟菌剂及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112625982A
Application number: CN202110191081.8A
Authority: CN
Inventors: 路垚; 刘雅辉; 孙建平; 何宗均; 吕晶晶
Original assignee: INSTITUTE OF COASTAL AGRICULTURE HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES; Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: INSTITUTE OF COASTAL AGRICULTURE HEBEI ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES; Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-02-20
Filing date: 2021-02-20
Publication date: 2021-04-09

Abstract

本发明公开了一种水稻秸秆还田腐熟菌剂及其制备方法与应用。所述复合菌系HT20按重量份数由白蚁菌20%～50%，长柄木霉20%～50%,芬莱氏链霉菌20%～50%,葡萄球菌20%～50%，枯草芽孢杆菌10%～30%和胶胨样芽孢杆菌10%～30%复合而成，有效活菌数2×10⁸个/g。所述发明复合菌系HT20应用于水稻秸秆还田后对水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率均显著提高与施用市面购买的腐熟剂处理比较，水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率分别提高了10.02%、7.02%、11.83%和3.98%。

Description

一种水稻秸秆还田腐熟菌剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于农业微生物在处理水稻秸秆上的应用领域，涉及一种水稻秸秆还田腐熟菌剂及其在水稻秸秆还田上的应用。

背景技术

农作物秸秆主要指水稻、玉米等农作物收获后剩余的茎秆。全国每年秸秆产量近9亿 t，其中水稻、玉米、小麦和豆类的秸秆资源占秸秆总量的 80％左右，但是仍有近 2．0亿 t秸秆未被利用，这些未实现资源化利用的秸秆量大面广、乱堆乱放、随意焚烧，不仅浪费了资源，还加剧了温室气体的排放与雾霾天气的形成，造成严重的交通问题和生态环境污染问题。

水稻是世界三大粮食作物之一，也是我国的主要粮食作物,水稻秸秆作为一种数量巨大的有机肥源，富含纤维素、半纤维素及木质素等结构复杂的有机物，还含有大量的氮、磷、钾及其他微量元素,是一种可再生资源。水稻秸秆通过接种微生物菌种进行发酵处理后，产物作为有机肥料还田，可增加土壤中的有机质含量，提高土壤的理化性质，避免传统化肥带来的土壤板结等问题，达到培肥地力、提高作物产量的作用。

众多研究表明，微生物腐熟剂含有大量能分解纤维素、半纤维素和木质素的复合微生物菌群，能加快水稻秸秆的腐烂速度，缩短秸秆的腐烂时间。目前多数秸秆腐熟菌剂都是在正常温度下才能对秸秆进行正常发酵,而在北方冬天低温情况下难于发挥效果,另外,多数腐熟菌剂都是通过引进或筛选外地菌株进行生产制造和应用,也难于发挥效果,而本发明基于以上问题,从某块具体的田块筛选能在低温下分解纤维素的菌株并研制生产出专用腐熟菌剂后返还于该块地进行应用，避免外来菌株不适应环境发挥不了正常效果的问题。

发明内容

本发明公开了一种水稻秸秆还田腐熟菌剂（复合菌系HT20），其特征在于它由可在低温下分解纤维素的多种菌株复合而成，它是由下述重量份数的各单菌株发酵物组成：

白蚁菌20～50份长柄木霉20～50份芬莱氏链霉菌20～50份,

葡萄球菌20～50份枯草芽孢杆菌10～30份胶胨样芽孢杆菌10～30份

有效活菌数2×108个/g；

水稻秸秆还田腐熟菌剂优选它是由下述重量份数的各单菌株发酵物组成：白蚁菌:长柄木霉:芬莱氏链霉菌:葡萄球菌:枯草芽孢杆菌:胶胨样芽孢杆菌=3:3:3:3:2:1

本发明所述白蚁菌（编号JGDZTX3）的生理生化特性如下：革兰氏阳性菌，耐低温。

所述长柄木霉（编号JGDZTZ2）的生理生化特性如下：培养初期形成基质菌丝，后期形成气生菌丝，分生孢子为球形、透明，在显微镜下单个孢子呈淡绿色，菌体耐低温。

所述芬莱氏链霉菌（编号SDT2NF3）的生理生化特性如下：培养初期形成基质菌丝，后期形成气生菌丝，螺旋状孢子丝，分生孢子为球形，革兰氏阳性菌，耐低温。

所述葡萄球菌（编号JGDZTX2）的生理生化特性如下：菌体呈圆形，排列成葡萄串状，无运动性，非致病性菌，革兰氏阳性球菌，耐低温。

本发明进一步公开了水稻秸秆还田腐熟菌剂（复合菌系HT20）的制备方法，其特征在于菌剂为复合菌剂由筛选的菌株白蚁菌、长柄木霉、芬莱氏链霉菌、葡萄球菌按一定比例与引进菌株枯草芽孢杆菌和胶胨样芽孢杆菌复合而成，各菌株均按照菌：蛭石=1:2吸附于蛭石上，复合时为固体相互混合。作为优选复合菌剂所筛选的菌株来自于河北省唐山市曹妃甸区农林科学院研究基地，研制生产成的水稻秸秆还田腐熟菌剂，菌株取之于该地而用之于该地。

本发明更进一步公开了水稻秸秆还田腐熟菌剂（复合菌系HT20）在在秸秆还田中的应用；所述的秸秆还田的应用指的是：对水稻分蘖和成穗率，水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率。实验结果显示：水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率分别提高了31.34%、32.95%、45.67%和10.24%。与施用市面购买的腐熟剂处理比较，水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率分别提高了10.02%、7.02%、11.83%和3.98%。

本发明更加详细的描述如下：

本发明提供的水稻秸秆还田腐熟菌剂（复合菌系HT20），它的活性成分包括白蚁菌（Isoptericola sp.）、长柄木霉（Trichoderma longibrachiatum）、芬莱氏链霉菌（Streptomyces finlayi ）、葡萄球菌（Staphylococcus sp.）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）和胶胨样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）。

所述枯草芽孢杆菌具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC11089的菌株。所述胶胨样芽孢杆菌具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC 10013的菌株。

本发明提供的水稻秸秆还田腐熟菌剂（复合菌系HT20），其特征在于它由可在4 ℃低温下分解纤维素的多种菌株复合而成。本发明从水稻田中分离筛选得到可在4 ℃低温降解纤维素的细菌3株、真菌2株和放线菌3株。在将以上菌株进行测量透明圈直径大小和纤维素菌酶活力的测定，分离出4株纤维素分解活力最佳的菌株，为白蚁菌、长柄木霉、芬莱氏链霉菌、葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和胶胨样芽孢杆菌。

本发明提供的水稻秸秆还田腐熟菌剂（复合菌系HT20），其特征在于复合菌剂由筛选的菌株（白蚁菌、长柄木霉、芬莱氏链霉菌、葡萄球菌）与引进菌株（枯草芽孢杆菌和胶胨样芽孢杆菌）复合而成。

本发明提供的水稻秸秆还田腐熟菌剂，其特征在于复合菌剂所筛选的菌株来自于河北省唐山市曹妃甸区农林科学院研究基地，研制生产成的水稻秸秆还田腐熟菌剂，菌株取之于该地而用之于该地，在此地应用效果最佳。

本发明的腐熟菌剂使用范围包括但不限于河北省唐山市曹妃甸区农林科学院研究基地，适合于北方低温稻区，例如东北地区、华北地区北部、西北地区北部等地稻区。

本发明公开的水稻秸秆还田腐熟菌剂及其制备方法与应用与现有技术相比，具有以下有益效果：

水稻秸秆还田腐熟菌剂（复合菌系HT20）应用于水稻秸秆还田后对水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率均显著提高；与秸秆不还田处理相似，秧苗分蘖没有因秸秆还田受到抑制，而且有效分蘖数比不还田处理还显著提高了3.03%；与不施腐熟剂还田的处理比较，水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率分别提高了31.34%、32.95%、45.67%和10.24%。与施用市面购买的腐熟剂处理比较，水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率分别提高了10.02%、7.02%、11.83%和3.98%。

附图说明

图1为三株细菌分解纤维素的透明圈；

图2为三株放线菌分解纤维素的透明圈；

图3为葡萄糖标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

1、材料和方法

1.1材料

1.1.1样品来源河北省唐山市曹妃甸区农林科学院研究基地取样，分别为：水稻田秸秆还田2年土(SDT2N)、水稻田秸秆还田3年土(SDT3N)、水稻秸秆还田咸水土(SDTXS)、秸秆堆置土(JGDZT)。存放于自封袋中，封口，于4℃保存备用。

培养基

（1）初筛培养基：CMC-Na 10 g，(NH4)₂SO₄ 4 g，K₂HPO₄ 1 g，MgSO₄· 7H₂O 0.5 g，KH₂PO₄ 1 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，H₂O 1000 mL，pH 7.0~7.2。

（2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15~20 g，H₂O1000 mL，pH 7.0~7.2。

（3）PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15~20 g，H₂O 1000 mL，pH自然。

（4）高氏一号培养基：高氏1号：可溶性淀粉（20 g），KNO₃（1 g），K₂HPO₄（0.5 g），MgSO₄· 7H₂O（0.5 g），NaCl（0.5 g），FeSO₄· 7H₂O（0.01 g），琼脂 20 g，pH=7.4~7.6。

（5）种子培养基：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，(NH₄)₂SO₄3.0 g，FeSO₄· 7H₂O 0.005 g，KH₂PO₄ 1.0 g，MnSO₄· H₂O 0.0016 g，MgSO₄· 7H₂O 0.5 g，ZnSO₄· 7H₂O 0.0017 g，CaCl₂0.1 g，CoCl₂ 0.002 g，NaCl 0.1 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水1000 mL。

主要试剂和仪器

DNS 试剂、柠檬酸缓冲液、羧甲基纤维素钠、蛋白胨，葡萄糖。

恒温培养箱，恒温震荡摇床，无菌操作间，无菌操作台，发酵罐，菌种冰箱，紫外分光光度计，显微镜。

菌株分离筛选

1.2.1 菌株的分离纯化

将采集到的土壤样品，用无菌水制成10^-4，10^-5，10^-6稀释度的菌悬液，在固体初筛培养基上涂布，放置生化培养箱4 ℃培养5 d。将初筛得到的菌株在固体平板上分别编号，并将分离到的菌株划线纯化，然后每个平板倒入15 mL刚果红溶液（1 mL/mg）染色30 min，用1 mL/L氯化钠溶液脱色2-3次，挑选出有透明圈的菌株，只保留有透明圈的对应标号菌株，细菌保存至牛肉膏蛋白胨试管斜面培养基，真菌保存至 PDA 试管斜面培养基，放线菌存放至高氏一号试管斜面培养基，放置4 ℃冰箱保存。

菌株的培养和筛选

将保存的纯化的上述菌株接种于液体初筛培养基，放至摇床4 ℃恒温振荡培养5d，取100 uL菌液放入初筛固体平板培养基上用6 mm固定的牛津杯内，4 ℃恒温培养箱培养5 d，取出牛津杯，每个平板倒入15 mL 刚果红溶液 (1 mL/mg) 染色30 min，然后用 1mol/L 氯化钠溶液清洗脱色 2~3次，测量各菌株透明圈的直径，每个菌株做3个重复。

酶活力的测定（GB 20287-2006）

降解纤维素菌株的酶活力测定：将分离的所有菌株接种到种子培养基，4 ℃恒温振荡培养3 d，转接至初筛培养基培养5 d，测定CMC酶活力。

标准曲线绘制

取5支大试管，按表1用吸管准确吸取标准葡萄糖溶液（1000 μg/mL）与磷酸钠缓冲液混匀，即得各种不同浓度的标准葡萄糖溶液。每管中各加3.0 mL DNS显色液，摇匀后置于沸水浴中准确加热5.0 min后，流水冷却，摇匀后于490 nm处测定各管的OD值，以葡萄糖的微克数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

原样酶液的制备

取菌液10 mL，3000 r/min离心10 min，离心后的上清液即为原样酶液，供测试用。

测定步骤

每个样品取2支大试管，1支作为空白对照。样品管中加1.0 mL原样酶液，然后2支试管中分别加入4.0 mL已预热至60 ℃的CMC缓冲液，在60 ℃的水浴锅中反应20 min取出，每管立即加入3.0 mL DNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1.0 mL原样酶液。将2支试管放入沸水浴中，显色5 min后立即取出，流水冷却，用分光光度计于490 nm处测其OD值。

纤维素酶活计算

根据标准曲线将测得的OD值换算成葡萄糖微克数： U=k x (m₁-m₂)/20；1 mL原样酶液，1 min产生1 μg葡萄糖定义为1个酶活力单位（U）

1.4水稻秸秆还田腐熟菌剂的构建

将筛选得到的菌株与本实验室自存菌株（为枯草芽孢杆菌与胶胨样芽孢杆菌）进行各菌株之间的拮抗试验后，构建水稻秸秆还田腐熟菌剂。

菌株的鉴定

将田间应用效果好的复合菌剂的各菌株进行分子生物学的鉴定。鉴定方法为用引物27F/1492R或ITS1/ITS4进行PCR 扩增，然后将PCR 产物切胶纯化回收，用引物27F/1492R或ITS1/ITS4 测序，将测序结果序列在NCBI 上Blast 比对完成菌种鉴定。

水稻秸秆还田腐熟菌剂的田间应用

针对北方冬春季温度低，水稻秸秆还田后难以腐解，严重影响第二年耕作及秧苗分蘖生长的重大科学问题，开展不同菌剂对水稻分蘖和生长的影响研究，确定低温环境下适宜还田秸秆腐解的高效菌剂。

供试水稻品种为滨稻979，生育期170-175天，采用插秧栽培方式，插秧密度为30 x16cm。供试菌剂为自研HT20、市面购买腐熟剂。

处理：分别为配施HT20还田（B1），配施市面腐熟剂（B2），不加菌剂还田（B3），不还田处理（B4）。小区面积30m²，3次重复。4月10日播种育苗，5月15日插秧，栽培期间肥料、农药及水分管理措施同常规。

2、结果与分析

2.1纤维素降解菌的筛选

初步筛选得到可以低温生长的菌株55株，进一步通过透明圈在秸秆堆置土中筛选得到低温纤维素降解细菌3株，低温纤维素降解真菌2株，水稻田秸秆还田土中筛选得到低温纤维素降解放线菌3株。测定各菌株的透明圈直径和CMC酶活力，筛选出酶活力最佳菌株。以下3株细菌分别编号：JGDZTX1、JGDZTX2、JGDZTX3，2株真菌分别编号：JGDZTZ2、JGDZTZ3，3株放线菌分别编号：SDT2NF1、SDT2NF2、SDT2NF3。

2.2透明圈直径

3株细菌和3株放线菌均测得透明圈直径，2株真菌因长的过大，未测出透明圈直径。透明圈结果见表1、图1、图2：

表1 菌株透明圈

从表1可以看出，JGDZTX2、JGDZTX3、SDT2NF2、SDT2NF3的透明圈直径较大。

酶活性

2.3.1葡萄糖标准曲线（见图3）

2.3.2菌株CMC酶活性

表2 菌株CMC酶活性

由表2可以看出，JGDZTX3、JGDZTZ2、STD2NF3、JGDZTX2的CMC酶活性较高。

复合菌剂的构建

综合考虑筛选得到菌株的CMC酶活性，将CMC酶活性最佳的JGDZTX3、JGDZTZ2、STD2NF3与JGDZTX2四种菌发酵后，按一定比例与本实验室自存的枯草芽孢杆菌、胶胨样芽孢杆菌发酵液进行混合，构建复合菌系HT20。各菌株均（按照菌：蛭石=1:2）吸附于蛭石上，复合时为固体相互混合。复合方法见表3：

表3 复合菌剂的构建

2.6菌株的鉴定

2.6.1 JGDZTX3 测序结果拼接序列如下：鉴定结果是Isoptericola sp.

ACCACTCCCCCCGGAAACCGGTTGGGCCATGAGCTTCGGGTGTTACCAACTTTCGTGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGGGATTCGCTCCACCTTACGGTATCGCAGCCCTCTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCCATGAGTCCCCGGCATAACCCGCTGGCAACATAGGACGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTGCACCGACCTTACGGGGCACCCATCTCTGAGTGTTTCCGGTGCATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGAACTCGTGGAATGAGCCCCACACCTAGTGCCCAACGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCATGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTGCGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTCCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCTAGTCTGCCCGTACCCGATGCAAGCCCGAGGTTGAGCCTCGGGATTTCACACCAGACGCGACAGACCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTGCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGACGCCTTGGTAGGCCATCACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGAGCCCATCCCCCACCGAAAAACTTTCCAACCCACACCATGCGATGCAGGCTCATATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAAGGCTTATCCCGAAGTGGAGGGCAGGTTGCTCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTGATCCACCCAGCAAGCTGGGCTTCACCGTTCGACTTGCA

2.6.2 JGDZTZ2 测序结果拼接序列如下：鉴定结果是Trichodermalongibrachiatum

ACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCAATGTGAACGTTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCTCCCGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCGGGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCCACAGCCGTAAAACACCCCAAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAG

2.6.3 STD2NF3测序结果拼接序列如下：鉴定结果是Streptomyces finlayi

ACAGCTCCCTCCCACAAGGGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCGCCTCGCGGCATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTGTGAGTCCCCATCACCCCGAAGGGCATGCTGGCAACACAGAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTATACCGACCACAAGGGGGGCACCATCTCTGATGCTTTCCGGTATATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAATGTCGCCAACACCTAGTTCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAATGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCACACTCTAGCTAGCCCGTATCGAATGCAGACTCGGGGTTAAGCCCCGAGCTTTCACATCCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTGCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGGCCATTACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTTCACCGCCGGAGCTTTTAACCCCGTCCCATGCGGGACAGAGTGTTATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGAAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCACCCCGAAGGGCTTCATCGTTCGACTTGCA

2.6.4 JGDZTX2 测序结果拼接序列如下：鉴定结果是Staphylococcus sp.

ACGGCTAGCTCCAAATGGTTACTCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATGCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATATAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACTGAGAACAACTTTATGGGATTTGCTTGACCTCGCGGTTTCGCTACCCTTTGTATTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCAACTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGCTTAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAAAACTCTATCTCTAGAGGGGTCAGAGGATGTCAAGATTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCACGCTTTCGCACATCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTGCGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTTCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGATTAGGTACCGTCAAGACGTGCATAGTTACTTACACATTTGTTCTTCCCTAATAACAGAGTTTTACGATCCGAAGACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAGCTAATGCGGCGCGGATCCATCTATAAGTGACAGCAAAACCGTCTTTCACTATTGAACCATGCGGTTCAATATATTATCCGGTATTAGCTCCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTATAGGTAGGTTATCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACGTCAGAGGAGCAAGCTCCTCGTCTGTTCGCTCGACTGCATGT

2.7 水稻秸秆还田腐熟菌剂的田间应用

表4 不同还田时期及不同菌剂配施还田对水稻分蘖的影响

从配施不同菌剂还田情况来看，施用复合菌系HT20对水稻分蘖和成穗率有较大影响（表4），施用低温启动型复合菌系HT20后，水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率均显著提高，4个处理中，位居第一位，不施用复合菌系的处理最低。施用HT20后水稻分蘖情况与秸秆不还田处理相似，秧苗分蘖没有因秸秆还田受到抑制，而且有效分蘖数比不还田处理还显著提高了3.03%。与不施腐熟剂还田的处理比较，水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率分别提高了31.34%、32.95%、45.67%和10.24%。与施用市面购买的腐熟剂处理比较，水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率分别提高了10.02%、7.02%、11.83%和3.98%。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市农业科学院,河北省农林科学院滨海农业研究所

<120> 一种水稻秸秆还田腐熟菌剂及其制备方法与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accactcccc ccggaaaccg gttgggccat gagcttcggg tgttaccaac tttcgtgact 60

tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cagcgttgct gatctgcgat 120

tactagcgac tccgacttca tggggtcgag ttgcagaccc caatccgaac tgagaccggc 180

tttttgggat tcgctccacc ttacggtatc gcagccctct gtaccggcca ttgtagcatg 240

cgtgaagccc aagacataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccgagt 300

tgaccccggc agtctcccat gagtccccgg cataacccgc tggcaacata ggacgagggt 360

tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420

cacctgtgca ccgaccttac ggggcaccca tctctgagtg tttccggtgc atgtcaagcc 480

ttggtaaggt tcttcgcgtt gcatcgaatt aatccgcatg ctccgccgct tgtgcgggcc 540

cccgtcaatt cctttgagtt ttagccttgc ggccgtactc cccaggcggg gcacttaatg 600

cgttagctgc ggcacggaac tcgtggaatg agccccacac ctagtgccca acgtttacgg 660

catggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccatg ctttcgctcc tcagcgtcag 720

ttgcggccca gagacctgcc ttcgccatcg gtgttcctcc tgatatctgc gcattccacc 780

gctacaccag gaattccagt ctcccctacc gcactctagt ctgcccgtac ccgatgcaag 840

cccgaggttg agcctcggga tttcacacca gacgcgacag accgcctacg agctctttac 900

gcccaataat tccggacaac gcttgcgccc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960

tagccggcgc ttcttctgca ggtaccgtca cttgcgcttc ttccctgctg aaagaggttt 1020

acaacccgaa ggccgtcatc cctcacgcgg cgtcgctgca tcaggcttgc gcccattgtg 1080

caatattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc 1140

cggtcgccct ctcaggccgg ctacccgtcg acgccttggt aggccatcac cccaccaaca 1200

agctgatagg ccgcgagccc atcccccacc gaaaaacttt ccaacccaca ccatgcgatg 1260

caggctcata tccggtatta gaccccgttt ccaaggctta tcccgaagtg gagggcaggt 1320

tgctcacgtg ttactcaccc gttcgccact gatccaccca gcaagctggg cttcaccgtt 1380

cgacttgca 1389

<210> 2

<211> 619

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acctgcggag ggatcattac cgagtttaca actcccaaac cccaatgtga acgttaccaa 60

tctgttgcct cggcgggatt ctcttgcccc gggcgcgtcg cagccccgga tcccatggcg 120

cccgccggag gaccaactcc aaactctttt ttctctccgt cgcggctccc gtcgcggctc 180

tgttttattt ttgctctgag cctttctcgg cgaccctagc gggcgtctcg aaaatgaatc 240

aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga 300

taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc 360

gccagtattc tggcgggcat gcctgtccga gcgtcatttc aaccctcgaa cccctccggg 420

gggtcggcgt tggggatcgg cccctcaccg ggccgccccc gaaatacagt ggcggtctcg 480

ccgcagcctc tcctgcgcag tagtttgcac actcgcaccg ggagcgcggc gcggccacag 540

ccgtaaaaca ccccaaactt ctgaaatgtt gacctcggat caggtaggaa tacccgctga 600

acttaagcat atcaataag 619

<210> 3

<211> 1394

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acagctccct cccacaaggg gttgggccac cggcttcggg tgttaccgac tttcgtgacg 60

tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cagcaatgct gatctgcgat 120

tactagcaac tccgacttca tggggtcgag ttgcagaccc caatccgaac tgagaccggc 180

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caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc 420

catgcaccac ctgtataccg accacaaggg gggcaccatc tctgatgctt tccggtatat 480

gtcaagcctt ggtaaggttc ttcgcgttgc gtcgaattaa gccacatgct ccgctgcttg 540

tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttt agccttgcgg ccgtactccc caggcgggga 600

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gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc 720

agcgtcagta atggcccaga gatccgcctt cgccaccggt gttcctcctg atatctgcgc 780

atttcaccgc tacaccagga attccgatct cccctaccac actctagcta gcccgtatcg 840

aatgcagact cggggttaag ccccgagctt tcacatccga cgtgacaagc cgcctacgag 900

ctctttacgc ccaataattc cggacaacgc tcgcacccta cgtattaccg cggctgctgg 960

cacgtagtta gccggtgctt cttctgcagg taccgtcact tgcgcttctt ccctgctgaa 1020

agaggtttac aacccgaagg ccgtcatccc tcacgcggcg tcgctgcatc aggctttcgc 1080

ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc 1140

agtgtggccg gtcgccctct caggccggct acccgtcgtc gccttggtag gccattaccc 1200

caccaacaag ctgataggcc gcgggctcat ccttcaccgc cggagctttt aaccccgtcc 1260

catgcgggac agagtgttat ccggtattag accccgtttc cagggcttgt cccagagtga 1320

agggcagatt gcccacgtgt tactcacccg ttcgccacta atccaccccg aagggcttca 1380

tcgttcgact tgca 1394

<210> 4

<211> 1421

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acggctagct ccaaatggtt actccaccgg cttcgggtgt tacaaactct cgtggtgtga 60

cgggcggtgt gtacaagacc cgggaacgta ttcaccgtag catgctgatc tacgattact 120

agcgattcca gcttcatata gtcgagttgc agactacaat ccgaactgag aacaacttta 180

tgggatttgc ttgacctcgc ggtttcgcta ccctttgtat tgtccattgt agcacgtgtg 240

tagcccaaat cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300

accggcagtc aacttagagt gcccaactta atgatggcaa ctaagcttaa gggttgcgct 360

cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 420

tcactctgtc ccccgaaggg gaaaactcta tctctagagg ggtcagagga tgtcaagatt 480

tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggtcc 540

ccgtcaattc ctttgagttt caaccttgcg gtcgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600

gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660

tggactacca gggtatctaa tcctgtttga tccccacgct ttcgcacatc agcgtcagtt 720

acagaccaga aagtcgcctt cgccactggt gttcctccat atctctgcgc atttcaccgc 780

tacacatgga attccacttt cctcttctgc actcaagttt tccagtttcc aatgaccctc 840

cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaaaaaac cgcctacgcg cgctttacgc 900

ccaataattc cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960

gccgtggctt tctgattagg taccgtcaag acgtgcatag ttacttacac atttgttctt 1020

ccctaataac agagttttac gatccgaaga ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc 1080

aggctttcgc ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctggaccgtg 1140

tctcagttcc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtt gccttggtaa 1200

gccgttacct taccaactag ctaatgcggc gcggatccat ctataagtga cagcaaaacc 1260

gtctttcact attgaaccat gcggttcaat atattatccg gtattagctc cggtttcccg 1320

aagttatccc agtcttatag gtaggttatc cacgtgttac tcacccgtcc gccgctaacg 1380

tcagaggagc aagctcctcg tctgttcgct cgactgcatg t 1421

Claims

1.一种水稻秸秆还田腐熟菌剂，其特征在于它由可在低温下分解纤维素的多种菌株复合而成，它是由下述重量份数的各单菌株发酵物组成：

白蚁菌20～50份长柄木霉20～50份芬莱氏链霉菌20～50份,

有效活菌数2×108个/g。

2.权利要求1所述水稻秸秆还田腐熟菌剂它是由下述重量份数的各单菌株发酵物组成：白蚁菌:长柄木霉:芬莱氏链霉菌:葡萄球菌:枯草芽孢杆菌:胶胨样芽孢杆菌=3:3:3:3:2:1。

3.权利要求1所述水稻秸秆还田腐熟菌剂的制备方法，其特征在于菌剂为复合菌剂由筛选的菌株白蚁菌、长柄木霉、芬莱氏链霉菌、葡萄球菌按一定比例与引进菌株枯草芽孢杆菌和胶胨样芽孢杆菌复合而成，各菌株均按照菌：蛭石=1:2吸附于蛭石上，复合时为固体相互混合。

4.权利要求1所述水稻秸秆还田腐熟菌剂在秸秆还田中的应用；所述的秸秆还田的应用指的是：对水稻分蘖和成穗率，水稻分蘖生长速度、最高分蘖数、有效分蘖数及成穗率。