CN112625965A - 一种醋杆菌提取物、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品领域，具体讲，涉及一种醋杆菌提取物、其制备方法及应用。本发明的醋杆菌提取物中含有经60Co‑γ射线辐照后的醋杆菌的胞内物质。本发明的醋杆菌提取物原料易得，制备工艺简单，具有较高的抗氧化损伤和抗辐射损伤的作用，具有很强的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域，具体讲，涉及一种醋杆菌提取物、其制备方法及应用。
背景技术
辐射无处不在，人们除了会受到地壳中放射性核素、宇宙射线等的天然辐射，还会接触到工业核污染、医疗放射治疗的辐射以及日常生活中的电器辐射，例如，临床上用放射治疗恶性肿瘤；从核电站反应堆中释放出来的挥发性碘对环境和人类健康具有放射学危害。当机体受到辐照时，机体中的水发生电离分解产生多种自由基，攻击机体细胞组织从而造成损伤，这是电离辐射所致氧化损伤的理论基础。
目前对辐射损伤的防治已成为研究热点，传统辐射防护剂主要以人工合成的化学物质为主，在取得一定的治疗效果的同时，因其副作用大给机体带来了新的健康隐患。寻找高效、无毒副作用、可长期服用的新型天然辐射防护剂已成为目前的研究重点。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种醋杆菌提取物。
本发明的第二发明目的在于提供该醋杆菌提取物制备方法。
本发明的第三发明目的在于提供该醋杆菌提取物的应用。
为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
本发明涉及一种醋杆菌提取物，所述醋杆菌提取物中含有经60Co-γ射线辐照后的醋杆菌的胞内物。
可选的，所述醋杆菌提取物为所述胞内物的冻干粉；所述醋杆菌优选巴氏醋杆菌。
本发明涉及该醋杆菌提取物的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、将醋杆菌培养至对数期，采用60Co-γ辐照处理；
S2、收集菌体，破碎，离心收集上清液；
S3、冷冻干燥。
可选的，在S1中，将醋杆菌活化，接种，培养至对数期；所述接种优选按照5wt％的接种量进行接种。
可选的，所述60Co-γ处理为采用50～500Gy的总剂量处理菌体，优选采用250～500Gy的总剂量处理菌体；更优选以4Gy/min的剂量率进行辐射。
可选的，在S2中，将辐照处理后的发酵液离心收集菌体，进行破碎；
所述破碎的条件为：在300～500W条件下超声破碎细胞，工作3～5s，间歇5～8s，破碎处理的时间为20～60min；
优选为，在300W条件下超声破碎细胞，工作5s，间歇5s，破碎处理的时间为25min；
更优选的，所述离心的条件为0～6℃条件下，3000～5000rpm，离心时间为5～12min。
可选的，在S2中，所述破碎前还包括洗涤的步骤；所述洗涤为采用0.02mol/L、pH7.0的PBS洗涤菌体2～4次。
可选的，在S3中，将上清液过滤除菌后进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为：-90～-80℃条件下进行预冻，然后放进真空冷冻干燥机，冷阱温度为-80～-70℃，真空度1Pa，冷冻时间为24～36h。
本发明涉及该醋杆菌提取物在制备用于抗辐射损伤以及预防辐射损伤的食品中的应用。
本发明涉及该醋杆菌提取物在制备用于抗氧化损伤以及预防氧化损伤的食品中的应用。
本发明至少具有以下有益的效果：
本发明的醋杆菌提取物原料易得，制备工艺简单，具有较高的抗氧化损伤和抗辐射损伤的作用，具有很强的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例的醋杆菌提取物的制备流程图；
图2为对比药物条件下的醋杆菌微生物的存活个数；
图3为实施例1条件下的醋杆菌微生物的存活个数；
图4为对比药物和实施例1药物条件下醋杆菌的存活率比较图；
图5为对比药物条件下的醋杆菌微生物的存活个数；
图6为实施例2条件下的醋杆菌微生物的存活个数；
图7为对比药物和实施例2条件下醋杆菌的存活率比较图；
图8为未经诱导的巴氏醋杆菌胞内物对AML-12细胞的辐射损伤防护作用；
图9为总剂量为500Gy诱导的巴氏醋杆菌对AML-12细胞的辐射损伤防护作用；
图10为辐射剂量为750Gy对巴氏醋杆菌活性的影响；
图11为辐射剂量为500Gy对巴氏醋杆菌活性的影响；
图12为辐射剂量为250Gy对巴氏醋杆菌活性的影响。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)是我国食醋发酵的主要菌种，可以以氧气作为终端电子受体，氧化糖类和醇类生成相应的有机酸、酮和糖醇。醋杆菌把乙醇氧化为乙酸主要涉及乙醇呼吸链中的两个关键酶，即催化乙醇氧化成乙醛的乙醇脱氢酶和催化乙醛氧化的乙醛脱氢酶。本发明经锐意研究发现，60Coγ诱导的巴氏醋杆菌代谢物中的某些成分具有抗氧化损伤的效果，从而完成本发明。本发明实施例提出了一种巴氏醋杆菌来源的抗氧化、抗辐射防护剂，具体步骤涉及60Co-γ辐射诱导巴氏醋杆菌，获得巴氏醋杆菌的胞内物。
本文发明公开了一种醋杆菌提取物，含有经60Co-γ射线辐照后的醋杆菌的胞内物。
具体的，醋杆菌提取物为胞内物的冻干粉；醋杆菌优选巴氏醋杆菌。
在本发明实施例中，醋杆菌提取物的制备方法至少包括以下步骤：
S1、将醋杆菌培养至对数期，采用60Coγ辐照处理；
S2、收集菌体，破碎，离心收集上清液；
S3、冷冻干燥。
具体的，在S1中，将醋杆菌活化，接种，培养至对数期；接种优选按照5wt％的接种量进行接种。
具体的，本发明实施例中醋杆菌的培养条件为：培养基含葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、乙醇3wt％，培养温度30℃，180rpm，培养时间18～24h。
可选的，本发明实施例采用50～500Gy的总剂量处理菌体，优选采用250～500Gy的总剂量处理菌体。在该照射量下，醋杆菌产生参与抵制环境胁迫的功能物质的量可达到最大化，抗辐射抗氧化的性能最佳。
可选的，以2～6Gy/min的剂量率进行辐射，优选为4Gy/min，辐射时间为辐射总剂量除以剂量率。
具体的，在S2中，将辐照处理后的发酵液离心收集菌体，进行破碎。
具体的，本发明实施例中破碎的条件为：在300～500W条件下超声破碎细胞，工作3～5s，间歇5～8s，破碎处理的时间为20～60min，优选为在400W条件下超声破碎细胞，工作5s，间歇5s，破碎处理的时间为25min。
具体的，本发明实施例中离心的条件为0～6℃条件下，3000～5000rpm，离心时间为5～12min。
具体的，在S2中，破碎前还包括洗涤的步骤；洗涤为采用0.02mol/L、pH 7.0的PBS洗涤菌体2～4次。
具体的，在S3中，将上清液除菌过滤后进行冷冻干燥。除菌过滤的膜过滤孔径为0.22μm。冷冻干燥的条件为：-90℃～-80℃条件下进行预冻，然后放进真空冷冻干燥机，冷阱温度为-80℃～-70℃，真空度1Pa，冷冻时间为24～36h。冷冻干燥的条件优选为：-80℃条件下进行预冻，然后放进真空冷冻干燥机，冷阱温度为-70℃，真空度1Pa，冷冻时间为24～36h。
具体的，发明实施例的醋杆菌提取物的制备流程如图1所示。
本发明实施例还提出上述醋杆菌提取物在制备用于抗辐射损伤以及预防辐射损伤的食品中的应用。本发明实施例经实验发现，该醋杆菌提取物可增强60Co-γ处理肝细胞时细胞的活性，说明其具有抗辐射损伤以及预防辐射损伤的效果。
本发明实施例还提出上述醋杆菌提取物在制备用于抗氧化损伤以及预防氧化损伤的食品中的应用。本发明实施例经实验发现，该醋杆菌提取物可提高过氧化氢存在时的菌体存活率，从而说明其具有抗氧化损伤以及预防氧化损伤的效果。
实施例1醋杆菌提取物的制备
1、将醋杆菌培养至对数期，采用60Coγ辐照处理：
将4℃保存的菌种保藏编号为CGMCC 1.2269的巴氏醋杆菌接入液体培养基，在30℃，180rpm培养活化，然后用作种子液，按5％接种量接种到液体培养基，培养基含葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、乙醇3％。培养温度30℃，180rpm，培养时间18～24h。培养至对数生长期后，对菌体进行总量为500Gy辐射诱导处理，剂量率为4Gy/min。
2、收集菌体，破碎，离心收集上清液：
将培养至对数期的菌体在转速为4000rpm，温度为4℃，时间为10min条件下进行离心，用浓度75mM的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，菌体质量和缓冲液体积配比为1：30～50mL，洗涤两次，弃上清，收集菌体。将菌体重悬于50～60mL磷酸盐缓冲液中，在冰水浴条件下进行超声破碎，破碎条件为：功率400W，超声运行5s，停止5s，共超声40min，直至悬液澄清。离心收集上清液的转速为4000rpm，温度为4℃，时间为10～15min。
3、将上清液过滤除菌后进行冷冻干燥：
膜过滤孔径为0.22μm，过滤后将上清液移至洁净的烧杯中，-80℃条件下进行预冻，最后放进真空冷冻干燥机，冷阱温度-70℃，真空度1Pa，冷冻时间为24h，最后制备成巴氏醋杆菌冻干粉。
实施例2醋杆菌提取物的制备
1、将醋杆菌培养至对数期，采用60Co-γ辐照处理：
将4℃保存的菌种保藏编号为CGMCC 1.2269的巴氏醋杆菌接入液体培养基，在30℃，180rpm培养活化，然后用作种子液，按5％接种量接种到液体培养基，培养基含葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、乙醇3％。培养温度30℃，180rpm，培养时间18～24h。培养至对数生长期后，对菌体进行总量为250Gy辐射诱导处理，剂量率为4Gy/min。
2、收集菌体，破碎，离心收集上清液：
将培养至对数期的菌体在转速为4000rpm，温度为4℃，时间为10min条件下进行离心，用浓度75mM的磷酸盐缓冲液洗涤菌体，菌体质量和缓冲液体积配比为1：30～50mL，洗涤两次，弃上清，收集菌体。将菌体重悬于50～60mL磷酸盐缓冲液中，在冰水浴条件下进行超声破碎，破碎条件为：功率400W，超声运行5s，停止5s，共超声40min，直至悬液澄清。离心收集上清液的转速为4000rpm，温度为4℃，时间为10～15min。
3、将上清液过滤除菌后进行冷冻干燥：
膜过滤孔径为0.22μm，过滤后将上清液移至洁净的烧杯中，-80℃条件下进行预冻，最后放进真空冷冻干燥机，冷阱温度-70℃，真空度1Pa，冷冻时间为36h，最后制备成巴氏醋杆菌冻干粉。
实验例1
对比药物的制备，步骤为：
1、将醋杆菌培养至对数期，
2、收集菌体，破碎，离心收集上清液：
3、将上清液过滤除菌后进行冷冻干燥。
具体条件同实施例1。
进行抗氧化损伤实验，具体实验方法为：
1、将菌种保藏编号为CGMCC 1.2269的巴氏醋杆菌在含葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、乙醇3％的培养基中培养至对数生长期；
2、将实施例1和对比药物的醋杆菌提取物溶于水，配制浓度分别为250μg/mL、500μg/mL、750μg/mL、1000μg/mL的溶液；
3、将以下各组混合物进行孵育：
对比组(D)：将含有3mL醋杆菌悬液、1mL对比样品溶液和1mL 25mmol/L的H2O2溶液的混合物在30℃下孵育1h，对比样品溶液浓度分别为250、500、750、1000μg/mL；
500Gy辐照低剂量组(IS-500Gy)：将含有3mL醋杆菌悬液、1mL样品溶液和1mL25mmol/L的H2O2溶液的混合物在30℃下孵育1h，500Gy诱导的样品溶液浓度分别为250、500、750、1000μg/mL；
模型组(J)：将含有3mL醋杆菌悬液、1mL PBS和1mL 25mmol/L的H2O2溶液的混合物在30℃下孵育1h；
空白组(C)：将3mL醋杆菌悬液、1mL PBS和1mL H2O在30℃下孵育1h。
然后用标准平板计数法将细胞悬液稀释到合适浓度，在30℃下培养72h。
4、计算巴氏醋杆菌细胞存活率：
Y％＝(Ai-Aj)/(A0-Aj)×100
其中A0是未经H2O2处理的菌落数；Ai是样品的菌落数；Aj是对照组(PBS代替样品)的菌落数。
其中，图2为对比药物条件下的醋杆菌细胞的存活个数，图3为实施例1条件下的醋杆菌的存活个数，计算存活率如图4所示，(模型组(J)相对于空白组(C)的损伤显著性表示为：###P<0.001。相对于模型组(J)的显著性表示为：***表示p<0.001)。
从图2～图4可以看出，500Gy辐照诱导后，醋杆菌胞内物的抗氧化损伤作用提升了，在5mmol/L的过氧化氢损伤情况下，未辐照的胞内物加入后，菌体的最大存活率为25.17％，而辐照诱导后的巴氏醋杆菌存在时，菌体的最大存活率达到了95.92％。
实验例2
对比药物的制备，步骤为：
1、将醋杆菌培养至对数期，
2、收集菌体，破碎，离心收集上清液：
3、将上清液过滤除菌后进行冷冻干燥。
具体条件同实施例1。
进行抗氧化损伤实验，具体实验方法为：
1、将菌种保藏编号为CGMCC 1.2269的巴氏醋杆菌在含酵母膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙醇3％(V/V)的培养基中培养至对数生长期；
2、将实施例2和对比药物的醋杆菌提取物溶于水，配制浓度分别为250μg/mL、500μg/mL、750μg/mL、1000μg/mL的溶液；
3、将以下各组混合物进行孵育：
对比组(D)：将含有3mL醋杆菌悬液、1mL对比样品溶液和1mL 25mmol/L的H2O2溶液的混合物在30℃下孵育1h，对比样品溶液浓度分别为250、500、750、1000μg/mL；
250Gy辐照低剂量组(IS-250Gy)：将含有3mL醋杆菌悬液、1mL样品溶液和1mL25mmol/L的H2O2溶液的混合物在30℃下孵育1h，250Gy诱导的样品溶液浓度分别为250、500、750、1000μg/mL；
空白组(C)：将3mL醋杆菌悬液、1mL PBS和1mL H2O在30℃下孵育1h。
然后用标准平板计数法将细胞悬液稀释到合适浓度，在30℃下培养72h。
其中图5为对比药物条件下的醋杆菌的存活个数，图6为实施例2条件下的醋杆菌的存活个数，计算存活率如图7所示(模型组(J)相对于空白组(C)的损伤显著性表示为：###P<0.001，相对于模型组(J)的显著性表示为：***表示p<0.001)。
从图5～图7可以看出，250Gy辐照诱导后，醋酸菌胞内物的抗氧化损伤作用提升了，在5mmol/L的过氧化氢损伤情况下，未辐照的胞内物加入后，菌体的最大存活率为13％，而辐照诱导后的巴氏醋杆菌存在时，菌体的最大存活率达到了90％。
实验例3
对比药物的制备，步骤为：
1、将醋杆菌培养至对数期，
2、收集菌体，破碎，离心收集上清液：
3、将上清液过滤除菌后进行冷冻干燥。
具体条件同实施例1。
进行抗辐射实验，具体实验方法为：
1、将实施例1和对比药物的醋杆菌提取物溶于水，配制浓度分别为0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL的溶液；
2、将小鼠正常肝细胞AML-12细胞置37℃、5％CO2温箱培养使细胞贴壁；过夜培养后加入以下试剂处理12h；
对比试剂未辐照组(IS)、对比试剂辐照剂组(IS+IR)：分别加入0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL的对比药物溶液；
实施例1试剂未辐照组(IS-500Gy)、实施例1试剂辐照剂组(IS-500Gy+IR)：分别加入0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL的实施例1的醋杆菌提取物溶液；
3、将对比试剂辐照剂组(IS+IR)、实施例1试剂辐照剂组(IS-500Gy+IR)培养后的细胞进行辐射实验，辐射采用60Co-γ射线，辐射剂量为6Gy，辐射剂量率为2Gy/min，辐射后继续培养24h；
对比试剂未辐照组(IS)、实施例1试剂未辐照组(IS-500Gy)不进行辐射，培养24h。
4、将以上4组培养过后小心吸去上清，加入100μL新鲜培养基以及10μL CCK8溶液，继续培养4h，在酶标仪450nm处测量各孔的吸光值。
得到的实验结果如图8和图9所示。其中图8为未经诱导的巴氏醋杆菌胞内物的抗辐射损伤作用实验结果；图9为总剂量为250Gy诱导的巴氏醋杆菌的抗辐射损伤作用实验结果(图8中辐射损伤模型显著性表示为：###P<0.001，图9中辐射损伤防护的显著性表示为：***表示p<0.001)。
图8和图9可以看出，辐照诱导后的菌体胞内物相对于未辐照的胞内物明显提升了肝细胞在6Gy剂量下的存活率。
实验例4不同的辐射剂量对巴氏醋杆菌活性的影响
按照5％的接种量，将巴氏醋杆菌的种子液接种于含100mL培养基的250mL三角瓶中，30℃，180rpm，培养至对数期，60Coγ处理醋酸菌，辐射剂量为250Gy、500Gy、750Gy，剂量率为4Gy/min，未辐照的菌体做对照，通过稀释涂布平板法测定不同的辐照剂量对菌体活性的影响。
得到实验结果如图10～图12所示。
从图10～图12可以看出250Gy和500Gy的辐照剂量对菌体的活性无明显的影响，750Gy的剂量可以明显损伤细胞，致死率约为38.3％。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
Claims (10)
1.一种醋杆菌提取物，其特征在于，所述醋杆菌提取物中含有经60Co-γ射线辐照后的醋杆菌的胞内物。
2.根据权利要求1的醋杆菌提取物，其特征在于，所述醋杆菌提取物为所述胞内物的冻干粉；
所述醋杆菌优选巴氏醋杆菌。
3.一种如权利要求1或2所述的醋杆菌提取物的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1、将醋杆菌培养至对数期，采用60Co-γ辐照处理；
S2、收集菌体，破碎，离心收集上清液；
S3、冷冻干燥。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在S1中，将醋杆菌活化，接种，培养至对数期；
所述接种优选按照5wt％的接种量进行接种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述60Co-γ处理为采用50～500Gy的总剂量处理菌体，优选采用250～500Gy的总剂量处理菌体；更优选以4Gy/min的剂量率进行辐射。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在S2中，将辐照处理后的发酵液离心收集菌体，进行破碎；
所述破碎的条件为：在300～500W条件下超声破碎细胞，工作3～5s，间歇5～8s，破碎处理的时间为20～60min；
优选为，在400W条件下超声破碎细胞，工作5s，间歇5s，破碎处理的时间为25min；
更优选的，所述离心的条件为0～6℃条件下，3000～5000rpm，离心时间为5～12min。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在S2中，所述破碎前还包括洗涤的步骤；
所述洗涤为采用0.02mol/L、pH 7.0的PBS洗涤菌体2～4次。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在S3中，将上清液过滤除菌后进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为：
-90～-80℃条件下进行预冻，然后放进真空冷冻干燥机，冷阱温度为-80～-70℃，真空度1Pa，冷冻时间为24～36h。
9.如权利要求1或2所述的醋杆菌提取物或如权利要求3～8任一项所述的制备方法制备得到的醋杆菌提取物在制备用于抗辐射损伤以及预防辐射损伤的食品中的应用。
10.如权利要求1或2所述的醋杆菌提取物如权利要求3～8任一项所述的制备方法制备得到的醋杆菌提取物在制备用于抗氧化损伤以及预防氧化损伤的食品中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202011596974.2A CN112625965A (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 一种醋杆菌提取物、其制备方法及应用 |
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2020
- 2020-12-28 CN CN202011596974.2A patent/CN112625965A/zh active Pending
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