CN112611816A - 一种山楂标准对照物质及其制备方法、检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种山楂标准对照物质及其制备方法、检测方法和应用。该山楂标准对照物质的制备方法,包括如下步骤:步骤1:用水提取山楂饮片,将水提取液干燥,得到干燥物;步骤2:用甲醇提取所述干燥物,将甲醇提取液蒸干,得到蒸干物;步骤3:将所述蒸干物在水和有机溶剂的混合液中溶解,得到混合物,将所述混合物注入高速逆变色谱仪,在特定条件下收集特定时间段的流出液,并将所述流出液干燥,制得所述山楂标准对照物质。该山楂标准对照物质的制备方法简单,提取的山楂标准对照物质纯度高,且该山楂标准对照物质中含有多种组分,可以提高山楂及以山楂作为原料的相关药物或制剂的质量标准,提高产品质量可控性。
Description
技术领域
本申请涉及一种山楂标准对照物质及其制备方法、检测方法和应用,属于中药技术领域。
背景技术
山楂主要为蔷薇科植物山里红、山楂及野山楂的干燥成熟果实,是大宗传统药材之一。山里红分布于东北、河北、山东、山西、内蒙古、江苏、陕西等地,在辽宁南部、华北各地广为栽培;山楂剩余山坡林边或灌木丛中,分布与山里红相似。野山楂生于山谷或山地灌木丛中,分布于河南、江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、云南等地。
山楂富含多种营养成分和微量元素,有消积导滞、补脾健胃、活血化瘀止痛等功效。随着山楂市场份额的不断增大,山楂药材的质量得到重视,山楂的有效成分从简单的定性研究转为定量研究。
由于中药制剂中含有复杂的化学成分,且含量高低差异较大,用一般的化学分析法难以起到满意的测试效果,多采用仪器分析法进行分析,但仪器分析法大多需要用对照品进行随行标准对照分析。现有的山楂药材及其制剂的质量评价大多数使用的是单一对照品,也有将两种或三种对照品混合后作为标准物质。由于标准对照物质通常要求高纯度,上述所用的对照品的直接来源一般是市场,尚未有从山楂中同时提取多种组分共同作为标准对照物质的报道。
发明内容
为了解决上述问题,本申请提供了一种山楂标准对照物质、其制备方法、检测方法及应用,该山楂标准对照物质的制备方法简单,提取的山楂标准对照物质纯度高,且该山楂标准对照物质中含有多种组分,可以提高山楂及以山楂作为原料的相关药物或制剂的质量标准,提高产品质量可控性。
根据本申请的一个方面,提供了一种山楂标准对照物质的制备方法,包括如下步骤:
步骤1:用水提取山楂饮片,将水提取液干燥,得到干燥物;
步骤2:用甲醇提取所述干燥物,将甲醇提取液蒸干,得到蒸干物;
步骤3:将所述蒸干物在水和有机溶剂的混合液中溶解,得到混合物,将所述混合物注入高速逆变色谱仪,在特定条件下收集特定时间段的流出液,并将所述流出液干燥,制得所述山楂标准对照物质。
优选的,所述步骤3中的有机溶剂为四氯化碳、甲醇和正丁醇。
优选的,所述步骤3中四氯化碳、甲醇、正丁醇和水的体积比为6-10:5-8:3-4:3-5;
优选的,所述步骤3中四氯化碳、甲醇、正丁醇和水的体积比为8:6:3.5:4。
优选的,所述步骤3中水、四氯化碳、甲醇和正丁醇混合分层后,上相溶液的体积与下相溶液的体积比为0.5-1.5:1-2。
优选的,上相溶液的体积与下相溶液的体积比为1:1.5。
优选的,所述步骤3中的特定条件包括:转速800-1000r/min,流速2.0-4.0mL/min,检测波长210-370nm;
所述特定时间段包括:25-65min和90-120min;
将所述流出液在温度不超过50℃的条件下减压下干燥;
优选的,所述特定条件包括:转速900r/min,流速3.0mL/min,检测波长330nm。
优选的,步骤1中,在用水提取山楂饮片之前,先将山楂饮片制成煮散饮片;
将所述水提取液在温度不高于50℃的条件下干燥。
优选的,步骤1中使用水提取山楂煮散饮片时,加入水的质量是山楂煮散饮片的10-100倍。
根据本申请的又一个方面,提供了一种山楂标准对照物质,包括如上述的制备方法制得的山楂标准对照物质。
优选的,所述山楂标准对照物质由新绿原酸、绿原酸、异绿原酸、金丝桃苷和异槲皮苷组成。
根据本申请的又一个方面,提供了经上述的制备方法制得的山楂标准对照物质或上述的山楂标准对照物质在评价山楂及以山楂作为原料的相关药物或制剂的质量时的应用。
根据本申请的又一个方面,提供了一种山楂标准对照物质的检测方法,所述检测方法包括:
使用C18色谱柱,以乙腈为流动相A,以0.04%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度脱洗;柱温为30℃;流速为0.3ml/min;检测波长为330nm;
所述洗脱条件包括:0~5min,流动相A的体积分数2%,流动相B的体积分数为98%,5~8min,流动相A的体积分数变化为2~10%,流动相B的体积分数变化为98~90%;8~15min,流动相A的体积分数变化为10~14%,流动相B的体积分数变化为90~86%;15~20min,流动相A的体积分数变化为14~18%,流动相B的体积分数变化为86~82%;20~25min,流动相A的体积分数为18%,流动相B的体积分数为82%;25~32min,流动相A的体积分数变化为18~65%,流动相B的体积分数变化为82~35%;32~35min,流动相A的体积分数变化为65~85%,流动相B的体积分数变化为35~15%;35~37min,流动相A的体积分数为85%,流动相B的体积分数为15%;37~40min,流动相A的体积分数变化为85~2%,流动相B的体积分数变化为15~98%;40~50min,流动相A的体积分数为2%,流动相B的体积分数变化为98%。
优选的,色谱柱为Acclaim RSLC 120 C18色谱柱,色谱柱规格为2.1mm×150mm,2.2μm。
本申请的有益效果包括但不限于:
1.该山楂标准对照物质的制备方法简单,提取的山楂标准对照物质纯度高,且该山楂标准对照物质中含有多种组分,可以提高山楂及以山楂作为原料的相关药物或制剂的质量标准,提高产品质量可控性。
2.该山楂标准对照物质,可以用一个对照物质同时控制山楂及山楂作为原料的相关药物中多成分的定性定量分析,比用多个单一成分对照品成本降低、操作简便,并可以提高对山楂及山楂作为原料的相关药物质量可控性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解,构成本申请的一部分,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
图1为本申请实施例3涉及的山楂配方颗粒的特征图谱。
图2为本申请实施例3涉及的山楂标准对照物质特征图谱。
图3为本申请实施例3涉及的混合对照品的特征图谱。
图4为本申请实施例3涉及的对照药材的特征图谱。
图5为本申请实施例3涉及的山楂配方颗粒中辅料的特征图谱。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请,但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明,本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
实施例1
1.1山楂标准对照物质的制备方法
步骤1:取山楂饮片,制成煮散饮片,水提,水提取液50℃以下干燥,得干膏;
步骤2:干膏研细,加甲醇超声提取,甲醇提取液蒸干,得蒸干物;
步骤3:将蒸干物加入四氯化碳-甲醇-正丁醇-水的混合液中溶解,得混合物,将混合物注入高速逆流色谱仪,在转速800-1000r/min,流速2.0-4.0mL/min,检测波长210-370nm的条件下,收集25min-65min、90min-120min流出液,将流出液在低温减压干燥,制得山楂标准对照物质。
通过上述制备方法制备的山楂标准对照物质由新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、金丝桃苷和异槲皮素组成。
1.2四氯化碳-甲醇-正丁醇-水的体积比对制备山楂标准对照物质的影响
表1
四氯化碳-甲醇-正丁醇-水的体积比 | 山楂标准对照物质的产量 |
6:5:3:3 | 10mg |
8:6:3.5:4 | 23mg |
10:8:4:4 | 19mg |
如表1所示,当四氯化碳-甲醇-正丁醇-水的体积比为8:6:3.5:4时,对山楂标准对照物质的萃取效果最佳。
步骤3中在使用高速逆变色谱仪时,具体按如下步骤操作:
配液。超声脱气约20min,脱气后静置冷却至室温后泵液。
打开恒温水浴,将温度升至设定温度。
泵固定相。以10~20ml/min流速泵入固定相,检测器出口端流出固定相约20~50ml后停泵。
平衡。打开紫外检测器开始预热,正转转动主机至900rpm(FWD为正转,REV为反转),同时以3ml/min流速泵入流动相,至出口端流出流动相且此时紫外信号稳定,体系基本已平衡。
进样。以体系的上、下相溶解一定量的样品,超声溶解均匀后,在装样注射器中倒入样品溶液,将进样六通阀切换至load,推排气泡后吸液至样品全进入进样圈中,将load切换至inject,检测器、工作站调零开始记录。
接收流分。工作站记录,保存后采集数据,保存。
清洗。断开泵与主机的连接,将主机进口与气管出口连接,吹气;将主机中溶剂吹出后,泵入约50ml清洗液,吹气,重复此过程2~3次;最后一次长时间(1小时左右直至吹干)吹气时将主机内液体吹尽。
关机。
实施例2
山楂标准对照物质在评价山楂药物或制剂时使用的检测方法
使用高效液相色谱法检测
2.1色谱条件
色谱柱:Acclaim RSLC 120 C18,柱长150mm,内径2.1mm,粒径2.2μm;
检测波长:330nm;
流动相:乙腈为流动相A,0.04%磷酸为流动相B;
流速:0.3ml/min;
进样量:1~2μL;
柱温:30℃
按照表2中的梯度洗脱条件进行洗脱:
表2梯度洗脱条件
2.1.1检测波长的选择
称取0.5g的焦山楂配方颗粒样品,置具塞锥形瓶中,加入30%甲醇25ml,密塞,超声处理(功率150W,频率40kHz)30分钟,放冷,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。
供试品溶液进样,考察在254nm、285nm、330nm、360nm不同的四个波长下的色谱图。结果表明,检测波长为330nm时,色谱图基线噪音较低,信号峰数量较多,信号峰响应高,且分离度最好,所以选择330nm作为检测波长。
2.1.2流动相溶剂的选择
用焦山楂配方颗粒制备供试品溶液,分别考察乙腈-0.04%磷酸水(梯度洗脱)、乙腈-水(梯度洗脱)不同流动相机洗脱,记录色谱图。
结果表明,在乙腈-0.04%磷酸水梯度洗脱程序下,供试品色谱图基线噪音较低,信号峰数量较多,且分离度较好。因此确定以乙腈-0.04%磷酸做流动相。
2.1.3柱温的选择
用焦山楂配方颗粒制备供试品溶液,比较25℃、30℃、35℃不同柱温的测定结果。结果表明,柱温为30℃时基线噪音较低,分离度较好,因此柱温选择为30℃。
实施例3
山楂标准对照物质在评价山楂药物或制剂方面的应用
3.1供试品溶液的制备
称取0.5g的焦山楂配方颗粒样品,置具塞锥形瓶中,加入30%甲醇25ml,密塞,超声处理30分钟,放冷,摇匀,过滤,取续滤液作为供试品溶液。
3.2山楂标准对照物质对照品溶液的制备
称取通过本申请制备的山楂标准对照物质,精密称定,加甲醇使溶解,制成每1ml含0.1mg山楂标准对照物质的对照品溶液。
3.3混合对照品溶液
另称取新绿原酸、隐绿原酸和绿原酸、金丝桃苷和异槲皮苷对照品,精密称定,加甲醇制成1ml含新绿原酸9μg、隐绿原酸12μg、绿原酸98μg,含金丝桃苷19.6μg和异槲皮苷98μg的混合溶液,作为混合对照品溶液。
3.4对照药材溶液的制备
称取山楂对照药材0.5g,按照供试品溶液的制备方法制备得山楂对照药材参照物溶液。
3.5辅料溶液的制备
将辅料(糊精)按照供试品溶液的制备方法,同法制备辅料溶液。
将供试品溶液、对照品溶液,混合对照品溶液、对照药材溶液和辅料溶液按照实施例2中提供的高速液相色谱法进行特征图谱鉴定,鉴定结果参考图1-5。
图1中峰3是新绿原酸,峰4是绿原酸(S),峰5是隐绿原酸,峰6是金丝桃苷,峰7是异槲皮苷。
图2中峰1是新绿原酸,峰2是绿原酸(S),峰3是隐绿原酸,峰4是金丝桃苷,峰5是异槲皮苷。
图3中峰1是新绿原酸,峰2是绿原酸(S),峰3是隐绿原酸,峰4是金丝桃苷,峰5是异槲皮苷。
图4中峰3是新绿原酸,峰4是绿原酸(S),峰5是隐绿原酸,峰6是金丝桃苷,峰7是异槲皮苷。
图5中,山楂配方颗粒的辅料的特征图谱中未出现相应特征峰,因此可以确定辅料无干扰。
山楂配方颗粒的色谱图中(图1)呈现7个特征峰,除峰1、峰2外,其他5个特征峰与对照药材参照物色谱图中(图4)5个特征峰保留时间相对应,其中峰4、峰6、峰7分别与绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷对照品参照物峰的保留时间相对应,辅料阴性色谱图中(图5)未出现相应特征峰,因此确定辅料无干扰,此方法具有专属性。
说明使用本申请中的山楂标准对照物质,可以用一个对照物质同时控制山楂及山楂作为原料的相关药物中多成分的定性定量分析,比用多个单一成分对照品成本降低、操作简便,并可以提高对山楂及山楂作为原料的相关药物质量可控性。
实施例4
特征图谱方法学考察
采用实施例2中的色谱条件,考察稳定性、中间精密度和重复性,计算参照峰(S峰)对比各特征峰的相对保留时间和相对峰面积,确定方法是否符合要求。
4.1稳定性试验
考察同一份供试品溶液在不同时间点进样(0h、2h、4h、6h、8h、10h、),计算各特征峰相对保留时间、相对峰面积和相对标准偏差,确认是否符合要求(RSD≤3%)。
表3特征图谱稳定性研究相对保留时间计算表
区分 | 0h | 2h | 4h | 6h | 8h | 10h | RSD% |
峰1 | 0.3080 | 0.3083 | 0.3076 | 0.3078 | 0.3075 | 0.3070 | 0.1 |
峰2 | 0.4672 | 0.4679 | 0.4669 | 0.4671 | 0.4666 | 0.4663 | 0.1 |
峰3 | 0.8532 | 0.8528 | 0.8533 | 0.8538 | 0.8539 | 0.8536 | 0.0 |
峰4(S) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.0 |
峰5 | 1.0537 | 1.0532 | 1.0530 | 1.0532 | 1.0532 | 1.0530 | 0.0 |
峰6 | 1.5974 | 1.5969 | 1.5980 | 1.5982 | 1.5979 | 1.5978 | 0.0 |
峰7 | 1.6296 | 1.6288 | 1.6299 | 1.6304 | 1.6299 | 1.6300 | 0.0 |
表4特征图谱稳定性研究相对峰面积计算表
区分 | 0h | 2h | 4h | 6h | 8h | 10h | RSD% |
峰1 | 0.4782 | 0.4785 | 0.4775 | 0.4761 | 0.4768 | 0.4766 | 0.2 |
峰2 | 0.2738 | 0.2725 | 0.2768 | 0.2786 | 0.2855 | 0.2899 | 2.4 |
峰3 | 0.0886 | 0.0873 | 0.0870 | 0.0865 | 0.0856 | 0.0869 | 1.1 |
峰4(S) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.0 |
峰5 | 0.1113 | 0.1112 | 0.1123 | 0.1115 | 0.1110 | 0.1112 | 0.4 |
峰6 | 0.0380 | 0.0393 | 0.0383 | 0.0377 | 0.0389 | 0.0389 | 1.6 |
峰7 | 0.0337 | 0.0343 | 0.0334 | 0.0334 | 0.0331 | 0.0331 | 1.4 |
通过表3和4可知,供试品溶液在10h内稳定,因此建议供试品在10h内测定。
4.2中间精密度试验
用同一份供试品溶液连续进样6次,计算各特征峰相对保留时间、相对峰面积和相对标准偏差,确认是否符合要求(RSD≤2%)。
表5特征图谱精密度研究相对保留时间计算表
区分 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD% |
峰1 | 0.3081 | 0.3079 | 0.3085 | 0.3128 | 0.3071 | 0.3067 | 0.7 |
峰2 | 0.4677 | 0.4666 | 0.4673 | 0.4751 | 0.4656 | 0.4644 | 0.8 |
峰3 | 0.8534 | 0.8534 | 0.8538 | 0.8538 | 0.8533 | 0.8531 | 0.0 |
峰4(S) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.0 |
峰5 | 1.0534 | 1.0537 | 1.0530 | 1.0531 | 1.0535 | 1.0532 | 0.0 |
峰6 | 1.5979 | 1.5984 | 1.5983 | 1.5939 | 1.5968 | 1.5985 | 0.1 |
峰7 | 1.6297 | 1.6304 | 1.6302 | 1.6254 | 1.6284 | 1.6304 | 0.1 |
表6特征图谱精密度研究相对峰面积计算表
区分 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD% |
峰1 | 0.4550 | 0.4533 | 0.4542 | 0.4511 | 0.4532 | 0.4511 | 0.3 |
峰2 | 0.2651 | 0.2640 | 0.2661 | 0.2674 | 0.2660 | 0.2634 | 0.6 |
峰3 | 0.0871 | 0.0875 | 0.0868 | 0.0866 | 0.0862 | 0.0856 | 0.8 |
峰4(S) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.0 |
峰5 | 0.1120 | 0.1116 | 0.1111 | 0.1104 | 0.1115 | 0.1105 | 0.6 |
峰6 | 0.0340 | 0.0338 | 0.0332 | 0.0331 | 0.0337 | 0.0326 | 1.6 |
峰7 | 0.0318 | 0.0314 | 0.0315 | 0.0305 | 0.0316 | 0.0309 | 1.6 |
通过表5和6可知,供试品溶液各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%,表明山楂供试品溶液的液相色谱特征图谱的中间精密度符合要求。
4.3重复性试验
用同一批样品制备6份供试品溶液,分别进样检测,计算各特征峰相对保留时间、相对峰面积和相对标准偏差,确认是否符合要求(RSD≤3%)。
表7特征图谱重复性研究相对保留时间计算表
区分 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | RSD% |
峰1 | 0.3084 | 0.3076 | 0.3078 | 0.3080 | 0.3080 | 0.3074 | 0.1 |
峰2 | 0.4694 | 0.4677 | 0.4677 | 0.4682 | 0.4678 | 0.4663 | 0.2 |
峰3 | 0.8538 | 0.8529 | 0.8529 | 0.8527 | 0.8532 | 0.8523 | 0.1 |
峰4(S) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.0 |
峰5 | 1.0529 | 1.0526 | 1.0527 | 1.0529 | 1.0534 | 1.0533 | 0.0 |
峰6 | 1.5963 | 1.5963 | 1.5956 | 1.5964 | 1.5980 | 1.5970 | 0.1 |
峰7 | 1.6286 | 1.6283 | 1.6274 | 1.6285 | 1.6302 | 1.6287 | 0.1 |
表8特征图谱重复性研究相对峰面积计算表
区分 | 0h | 2h | 4h | 6h | 8h | 10h | RSD% |
峰1 | 0.4479 | 0.4473 | 0.4472 | 0.4451 | 0.4464 | 0.4453 | 0.3 |
峰2 | 0.2587 | 0.2575 | 0.2606 | 0.2621 | 0.2647 | 0.2656 | 1.2 |
峰3 | 0.0843 | 0.0839 | 0.0834 | 0.0831 | 0.0825 | 0.0828 | 0.8 |
峰4(S) | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 1.0000 | 0.0 |
峰5 | 0.1128 | 0.1125 | 0.1128 | 0.1121 | 0.1124 | 0.1120 | 0.3 |
峰6 | 0.0364 | 0.0369 | 0.0361 | 0.0358 | 0.0367 | 0.0361 | 1.2 |
峰7 | 0.0331 | 0.0332 | 0.0328 | 0.0323 | 0.0327 | 0.0323 | 1.1 |
通过表7和8可知,供试品溶液各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%,表明山楂供试品溶液的液相色谱特征图谱的重复性符合要求。
以上所述,仅为本申请的实施例而已,本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制,而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种山楂标准对照物质的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:用水提取山楂饮片,将水提取液干燥,得到干燥物;
步骤2:用甲醇提取所述干燥物,将甲醇提取液蒸干,得到蒸干物;
步骤3:将所述蒸干物在水和有机溶剂的混合液中溶解,得到混合物,将所述混合物注入高速逆变色谱仪,在特定条件下收集特定时间段的流出液,并将所述流出液干燥,制得所述山楂标准对照物质。
2.根据权利要求1所述的山楂标准对照物质的制备方法,其特征在于,所述步骤3中的有机溶剂为四氯化碳、甲醇和正丁醇。
3.根据权利要求2所述的山楂标准对照物质的制备方法,其特征在于,所述步骤3中四氯化碳、甲醇、正丁醇和水的体积比为(6-10):(5-8):(3-4):(3-5);
优选的,所述步骤3中四氯化碳、甲醇、正丁醇和水的体积比为8:6:3.5:4。
4.根据权利要求2所述的山楂标准对照物质的制备方法,其特征在于,所述步骤3中水、四氯化碳、甲醇和正丁醇混合分层后,上相溶液的体积与下相溶液的体积比为(0.5-1.5):(1-2)。
优选的,上相溶液的体积与下相溶液的体积比为1:1.5。
5.根据权利要求1所述的山楂标准对照物质的制备方法,其特征在于,所述步骤3中的特定条件包括:转速800-1000r/min,流速2.0-4.0mL/min,检测波长210-370nm;
所述特定时间段包括:25-65min和90-120min;
将所述流出液在温度不超过50℃的条件下减压下干燥;
优选的,所述特定条件包括:转速900r/min,流速3.0mL/min,检测波长330nm。
6.根据权利要求1所述的山楂标准对照物质的制备方法,其特征在于,步骤1中,在用水提取山楂饮片之前,先将山楂饮片制成煮散饮片;将所述水提取液在温度不高于50℃的条件下干燥;
步骤2中使用的是甲醇。
7.一种山楂标准对照物质,其特征在于,包括如权利要求1至6任一项所述的制备方法制得的山楂标准对照物质。
8.根据权利要求7所述的山楂标准对照物质,其特征在于,所述山楂标准对照物质由新绿原酸、绿原酸、异绿原酸、金丝桃苷和异槲皮苷组成。
9.权利要求1至6任一项所述的制备方法制得的山楂标准对照物质或权利要求7至8所述的山楂标准对照物质在评价山楂及以山楂作为原料的相关药物或制剂的质量时的应用。
10.一种山楂标准对照物质的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括:
使用C18色谱柱,以乙腈为流动相A,以0.04%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度脱洗;柱温为30℃;流速为0.3ml/min;检测波长为330nm;
所述洗脱条件包括:0~5min,流动相A的体积分数2%,流动相B的体积分数为98%,5~8min,流动相A的体积分数变化为2~10%,流动相B的体积分数变化为98~90%;8~15min,流动相A的体积分数变化为10~14%,流动相B的体积分数变化为90~86%;15~20min,流动相A的体积分数变化为14~18%,流动相B的体积分数变化为86~82%;20~25min,流动相A的体积分数为18%,流动相B的体积分数为82%;25~32min,流动相A的体积分数变化为18~65%,流动相B的体积分数变化为82~35%;32~35min,流动相A的体积分数变化为65~85%,流动相B的体积分数变化为35~15%;35~37min,流动相A的体积分数为85%,流动相B的体积分数为15%;37~40min,流动相A的体积分数变化为85~2%,流动相B的体积分数变化为15~98%;40~50min,流动相A的体积分数为2%,流动相B的体积分数变化为98%。
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