CN112604657A - 一种万古霉素磁性硅胶微球固定相及其制备方法和应用 - Google Patents

一种万古霉素磁性硅胶微球固定相及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种万古霉素磁性硅胶微球固定相及其制备方法和应用，涉及色谱固定相技术领域。以单分散的磁性硅胶微球为基质，在其表面修饰甲基丙烯酸缩水甘油酯，再将万古霉素接枝到修饰后的磁性硅胶微球上，形成单分散的万古霉素磁性硅胶微球固定相。该万古霉素磁性硅胶微球固定相制备过程简单、反应条件温和、反应可控，可用于高效液相色谱，高效快速地完成多种对映体的分离。

Description

一种万古霉素磁性硅胶微球固定相及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及色谱固定相技术领域，具体涉及一种万古霉素磁性硅胶微球固定相及其制备方法和应用。
背景技术
自然界里的手性化合物随处可见，但如果想获取单一手性的药物，只能利用各种材料的分离特点将其分离。随着科学技术的发展，单一手性药物在医药等用途被广泛应用，因此也促进了拆分对映体材料的发展。对映体之间的化学结构、光学结构和物理性质都比较大同小异，在拆分的过程遇到的困难很多，因此，急迫的需要具有高强度分离性质的分离材料以获得纯手性药物。
在对映体分离技术中，具有手性固定相(CSP)的高效液相色谱(HPLC)被认为是手性分离的最主要方法。自1994年Armstrong等人首次将大环抗生素用作手性选择剂以来，基于万古霉素的CSP已广泛用于通过液相色谱(LC)以不同模式分离各种手性药物、农药和工业物质。使用万古霉素固定化的二氧化硅作为反相液相色谱中的CSP，可以有效分离多种酸性药物(Armstrong et.al“Macrocyclic antibiotics as a new class of chiralselectors for liquid chromatography”《Analytical Chemistry》,1994,66(9),1473-1484.)。大环抗生素类手性固定相是继环糊精和蛋白质之后的常用固定相之一。与其他的手性选择剂不同，该类抗生素的结构不仅多样化还携带着显著的官能基团。另外，为了帮助提高手性化合物的对映体分离效率或开发新的手性分离方法，迫切需要探索新的有效合成方法和识别机制。然而万古霉素(Vancomycin)具有多功能基团，空腔和许多立体定位中心，能够为氢键，偶极-偶极相互作用，π-π相互作用和静电相互作用提供活性位点(Svenssonet.al“Immobilized vancomycin as chiral stationary phase in packed capillaryliquid chromatography”《Chirality》,2015,10,273-280.)。万古霉素的分子结构是一个三维环，其中手性中心的含量达到了数十个，连接最紧密的是氨基，其次是羟基、芳香基团等常见的。其结构上的多样性，可以加强固定相与物质之间的偶极、疏水和π-π等化学反应作用。所以万古霉素手性固定相的优点是可以反相模式下使用、具有较高的适应性和广泛的手性药物拆分范围(Rocchi et.Al“Enantiomers separation by nano-liquidchromatography:use of a novel sub-2μm vancomycin silica hydride stationaryphase”《Journal of Chromatography A》,2015,1381,149-159.)。然而水解不稳定性，繁琐的合成路径以及万古霉素低负载量使得氨基连接的万古霉素手性固定相在含水流动相中具有很强的局限性(Armstrong et.al“Cyclodextrin bonded phases for the liquidchromatographic separation of optical,geometrical,and structural isomers”《Journal of Chromatographic Science》,1984,22(9),411-415.)。因此选择键合量高并且省时高效的万古霉素手性固定相是目前急需研究的合成方法。另外，把手性选择剂固定在色谱固定相上，其优点在于一根手性柱可以被成千次地重复使用，无需特殊技术和特别装置，也无需补充手性试剂；检测方法方便，可靠使得其成为发展最快、最有应用前景的分离手性化合物的方法。
本发明选择了磁性硅胶微球作为基质，Fe3O4作为磁性粒子典型代表，因其制备简单成本低廉而被广泛应用。磁性硅胶微球材料可省去离心等繁琐步骤(Fang et.al“Afacile process for the preparation of organic gel-assisted silica microspherematerial for multi-mode liquid chromatography”《Journal of Chromatography A》,2020,1628(27),461472.)。而且本发明手性固定相制备中作为环氧刷子的甲基丙烯酸缩水甘油酯具有的高吸附性和易反应性，使得该手性选择剂在化学结构方面占了更大的优势，对手性药物和手性化合物的拆分有了更大的选择范围。本发明采用了简单经济的方法制备出了新的万古霉素手性固定相，并成功的将其应用于手性化合物的分离。
发明内容
本发明的目的在于提供一种万古霉素磁性硅胶微球固定相及其制备方法和应用，其可用作高效液相色谱的固定相高效快速地完成对映体的分离。
本发明一方面提供了一种万古霉素磁性硅胶微球固定相(Vancomycin-CSP)，以单分散的磁性硅胶微球为基质，在其表面修饰甲基丙烯酸缩水甘油酯，再将万古霉素接枝到修饰后的磁性硅胶微球上，形成单分散的万古霉素磁性硅胶微球固定相，其结构示意图如图1所示。
优选地，所述的万古霉素磁性硅胶微球固定相粒径为4-6μm，孔径为18-20nm，比表面积为98.5732-109.4316m2/g。
本发明一方面提供了一种上述的万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备方法，具体步骤如下(制备反应示意图如图2所示)：
(1)磁性硅胶微球的制备：将6-8g水解的硅胶微球分散到80-100mL氯仿中，加入1.5-3.0g Fe3O4纳米颗粒，升温至80℃，机械搅拌，使Fe3O4磁性纳米粒子充分进入硅胶微球孔中，待冷却至室温，过滤微球，真空干燥，得到磁性硅胶微球，即Fe3O4@SiO2；
(2)磁性硅胶微球表面修饰γ-氨丙基三乙氧基硅烷(TM-550)：取0.8-1.2g步骤(1)得到的磁性硅胶微球，超声分散在50-70mL干燥甲苯中，在氮气保护下，逐滴加γ-氨丙基三乙氧基硅烷8-10mL，升温至110℃，回流反应24h，取出磁性硅胶微球，甲苯、甲醇洗涤，真空干燥，得到磁性硅胶微球-NH2，即Fe3O4@SiO2-NH2；
(3)磁性硅胶微球-Br的制备：在冰浴条件下，将3-5g步骤(2)得到的磁性硅胶微球-NH2分散在70-90mL二氯甲烷中，冰浴40min，加入4-6mL三乙胺，冰浴10min，再加入3-5mLα-溴异丁酰溴(2-Bromoisobutyryl bromide)和30-40mg 4-二甲氨基吡啶，冰浴1h，升温至25℃反应24h，用二氯甲烷、乙醇、水洗涤，真空干燥，制得磁性硅胶微球-Br，即Fe3O4@SiO2-Br；
(4)磁性硅胶微球-GMA的制备：取干燥甲苯20-40mL和干燥甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)3-5mL混合，超声30min密封，得到混合物A，取步骤(3)得到的磁性硅胶微球-Br3.0-5.0g，2,2联吡啶(Bpy)2.0-3.0g和CuBr0.1-0.5g混合，加入磁子密封，得到混合物B；向混合物A和混合物B中通入氮气，在氮气保护下，将混合物A通入混合物B中，迅速密封，磁力搅拌，用水、甲醇溶液洗涤，真空干燥，制得磁性硅胶微球-GMA，即Fe3O4@SiO2-GMA；
(5)万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备：取万古霉素0.5-1.5g溶于20mL水中，超声溶解，取步骤(4)得到的磁性硅胶微球-GMA 3.0-5.0g，磁力搅拌，抽滤，用水和甲醇洗涤，真空干燥后将产物加入到20mL甲醇中，45℃下回流1h，甲醇洗涤，真空干燥，得到万古霉素磁性硅胶微球固定相，即万古霉素-CSP。
优选地，步骤(2)和步骤(3)中所述的真空干燥的条件是的50-70℃真空干燥箱中干燥20-30h；步骤(4)和步骤(5)中所述的真空干燥的条件是50-70℃真空干燥箱中干燥10-14h；步骤(5)中所述的磁力搅拌是在50-70℃下搅拌10-14h。
优选地，步骤(4)中所述的通入氮气的时间为20-40min；所述的磁力搅拌的时间为20-30h；步骤(5)中超声溶解时间为5-15min。
上述的万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备方法，具体步骤如下：
(1)磁性硅胶微球的制备：将6-8g水解的硅胶微球分散到80-100mL氯仿中，加入1.5-3.0g Fe3O4纳米颗粒，升温至80℃，机械搅拌，使Fe3O4磁性纳米粒子充分进入硅胶微球孔中，待冷却至室温，过滤微球，真空干燥，得到磁性硅胶微球，即Fe3O4@SiO2；
(2)磁性硅胶微球表面修饰γ-氨丙基三乙氧基硅烷：取0.8-1.2g步骤(1)得到的磁性硅胶微球，在超声作用下分散在50-70mL干燥甲苯中，在氮气保护下，并逐滴加γ-氨丙基三乙氧基硅烷8-10mL，升温至110℃，回流反应24h，取出磁性硅胶微球，用甲苯、甲醇各洗涤三次，然后置于50-70℃真空干燥箱中干燥20-30h，得到磁性硅胶微球-NH2，即Fe3O4@SiO2-NH2；
(3)磁性硅胶微球-Br的制备：在冰浴条件下，将3-5g步骤(2)得到的磁性硅胶微球-NH2分散在70-90mL二氯甲烷中，冰浴40min，加入4-6mL三乙胺，冰浴10min，再加入3-5mLα-溴异丁酰溴和30-40mg 4-二甲氨基吡啶，冰浴1h，升温至25℃反应24h，用二氯甲烷、乙醇、水各洗涤三次，置于烘箱中50-70℃真空干燥箱中干燥20-30h，制得磁性硅胶微球-Br，即Fe3O4@SiO2-Br；
(4)磁性硅胶微球-GMA的制备：取干燥甲苯20-40mL和干燥甲基丙烯酸缩水甘油酯3-5mL混合，超声30min密封，得到混合物A，取步骤(3)得到的磁性硅胶微球-Br3.0-5.0g，2,2联吡啶2.0-3.0g和CuBr 0.1-0.5g混合，加入磁子密封，得到混合物B；向混合物A和混合物B中通入氮气20-40min，在氮气保护下，将混合物A通入混合物B中，迅速密封，在室温下磁力搅拌反应聚合20-30h，依次用水、甲醇溶液多次洗涤，50-70℃真空干燥箱中干燥10-14h，制得磁性硅胶微球-GMA，即Fe3O4@SiO2-GMA；
(5)万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备：取万古霉素0.5-1.5g溶于20mL水中，超声5-15min使其充分溶解，取步骤(4)得到的磁性硅胶微球-GMA3.0-5.0g，50-70℃下搅拌10-14h，砂芯漏斗抽滤，依次用水和甲醇充分洗涤，50-70℃真空干燥箱中干燥10-14h后，将产物加入到20mL甲醇中，45℃下回流1h，用甲醇充分洗涤，50-70℃真空干燥箱中干燥10-14h，得到万古霉素磁性硅胶微球固定相，即，万古霉素-CSP。
本发明另一方面还提供了一种上述的万古霉素磁性硅胶微球固定相的应用，所述的万古霉素磁性硅胶微球固定相可用于对映体的手性分离。
具体地，上述的万古霉素磁性硅胶微球固定相在高效液相色谱柱中的填装方法如下：
取万古霉素磁性硅胶微球固定相2.0-4.0g，并向其中加入30-50mL丙酮，超声分散20-40min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入高效液相色谱柱管中，色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)，填充压力为20-30MPa。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种万古霉素磁性硅胶微球固定相及其制备方法，该手性固定相的制备方法简单，反应条件温和，反应效率高，利于万古霉素磁性硅胶微球的快速、简便、绿色、省时、高效合成。
(2)本发明提供的一种万古霉素磁性硅胶微球固定相可用作高效液相色谱的固定相，能够高效快速地完成对映体的分离。本发明中甲基丙烯酸缩水甘油酯化的磁性硅胶微球，一方面增加磁性硅胶微球表面的环氧基团，使得磁性硅胶微球表面接枝的功能单体密度高，另一方面磁性硅胶微球-GMA更容易与万古霉素分子进行反应，磁性硅胶微球反应洗涤分离过程更省时简便高效，有利于实现手性拆分。另外，万古霉素磁性硅胶微球手性固定相拓展了磁性硅胶微球的使用范围，使得在实验过程中更方便省时的进行洗涤与反应，这在反相模式下有利于与各种类型的对映体化合物形成包合复合物。
附图说明
图1为万古霉素磁性硅胶微球固定相的结构示意图。
图2为万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备示意图。
图3为材料的红外光谱图：(a)万古霉素-CSP、(b)磁性硅胶微球-Br和(c)磁性硅胶微球。
图4为扫描电镜图，(a)磁性硅胶微球和(b)万古霉素-CSP。
图5为万古霉素磁性硅胶微球的磁滞回线图：(a)Fe3O4、(b)磁性硅胶微球和(c)万古霉素-CSP。
图6为反相色谱条件下对映体分离的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与效果易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备方法，具体步骤如下：
(1)磁性硅胶微球的制备：将7.0g水解的硅胶微球分散到90mL氯仿中，加入2.2gFe3O4纳米颗粒，升温至80℃，机械搅拌，使Fe3O4磁性纳米粒子充分进入硅胶微球孔中，待冷却至室温，过滤微球，真空干燥，得到磁性硅胶微球，即Fe3O4@SiO2；
(2)磁性硅胶微球表面修饰γ-氨丙基三乙氧基硅烷：取1.0g步骤(1)得到的磁性硅胶微球，在超声作用下分散在60mL干燥甲苯中，在氮气保护下，并逐滴加γ-氨丙基三乙氧基硅烷9.0mL，升温至110℃，回流反应24h，取出磁性硅胶微球，用甲苯、甲醇各洗涤三次，真空干燥，得到磁性硅胶微球-NH2，即Fe3O4@SiO2-NH2；
(3)磁性硅胶微球-Br的制备：在冰浴条件下，将4.0g步骤(2)得到的磁性硅胶微球-NH2分散在80mL二氯甲烷中，冰浴40min，加入5.0mL三乙胺，冰浴10min，再加入4.0mLα-溴异丁酰溴和35mg 4-二甲氨基吡啶，冰浴1h，升温至25℃反应24h，用二氯甲烷、乙醇、水各洗涤三次，真空干燥，制得磁性硅胶微球-Br，即Fe3O4@SiO2-Br；
(4)磁性硅胶微球-GMA的制备：取干燥甲苯30mL和干燥甲基丙烯酸缩水甘油酯4mL混合，超声30min密封，得到混合物A，取步骤(3)得到的磁性硅胶微球-Br4.0g，2,2联吡啶2.5g和CuBr 0.3g混合，加入磁子密封，得到混合物B；向混合物A和混合物B中通入氮气30min，在氮气保护下，将混合物A通入混合物B中，迅速密封，在室温下磁力搅拌反应聚合24h，依次用水、甲醇溶液多次洗涤，真空干燥，制得磁性硅胶微球-GMA，即Fe3O4@SiO2-GMA；
(5)万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备：取万古霉素1.0g溶于20mL水中，超声10min使其充分溶解，取步骤(4)得到的磁性硅胶微球-GMA4.0g，60℃下磁力搅拌反应12h，砂芯漏斗抽滤，依次用水和甲醇充分洗涤，60℃真空干燥12h后，将产物加入到20mL甲醇中，45℃下回流1h，用甲醇充分洗涤，真空干燥，万古霉素磁性硅胶微球固定相，即万古霉素-CSP。
万古霉素磁性硅胶微球固定相在高效液相色谱柱中的填装方法如下：
取万古霉素磁性硅胶微球固定相3.0g，并向其中加入50mL丙酮，超声分散30min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入高效液相色谱柱管中，色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)，填充压力为25MPa。
实施例2
万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备方法，具体步骤如下：
(1)磁性硅胶微球的制备：将6.0g水解的硅胶微球分散到80mL氯仿中，加入1.5gFe3O4纳米颗粒，升温至80℃，机械搅拌，使Fe3O4磁性纳米粒子充分进入硅胶微球孔中，待冷却至室温，过滤微球，真空干燥，得到磁性硅胶微球，即Fe3O4@SiO2；
(2)磁性硅胶微球表面修饰γ-氨丙基三乙氧基硅烷：取0.8g步骤(1)得到的磁性硅胶微球，在超声作用下分散在50mL干燥甲苯中，在氮气保护下，并逐滴加γ-氨丙基三乙氧基硅烷8.0mL，升温至110℃，回流反应24h，取出磁性硅胶微球，用甲苯、甲醇各洗涤三次，然后置于50℃的真空干燥箱中干燥20h，得到磁性硅胶微球-NH2，即Fe3O4@SiO2-NH2；
(3)磁性硅胶微球-Br的制备：在冰浴条件下，将3.0g步骤(2)得到的磁性硅胶微球-NH2分散在70mL二氯甲烷中，冰浴40min，加入4.0mL三乙胺，冰浴10min，再加入3.0mLα-溴异丁酰溴和30mg 4-二甲氨基吡啶，冰浴1h，升温至25℃反应24h，用二氯甲烷、乙醇、水各洗涤三次，置于烘箱中50℃真空干燥20h，制得磁性硅胶微球-Br，即Fe3O4@SiO2-Br；
(4)磁性硅胶微球-GMA的制备：取干燥甲苯20mL和干燥甲基丙烯酸缩水甘油酯3mL混合，超声30min密封，得到混合物A，取步骤(3)得到的磁性硅胶微球-Br3.0g，2,2联吡啶2.0g和CuBr 0.1g混合，加入磁子密封，得到混合物B；向混合物A和混合物B中通入氮气20min，在氮气保护下，将混合物A通入混合物B中，迅速密封，在室温下磁力搅拌反应聚合20h，依次用水、甲醇溶液多次洗涤，50℃真空干燥10h，制得磁性硅胶微球-GMA，即Fe3O4@SiO2-GMA；
(5)万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备：取万古霉素0.5g溶于20mL水中，超声5min使其充分溶解，取步骤(4)得到的磁性硅胶微球-GMA3.0g，50℃下磁力搅拌反应12h，砂芯漏斗抽滤，依次用水和甲醇充分洗涤，50℃真空干燥10h后，将产物加入到20mL甲醇中，45℃下回流1h，用甲醇充分洗涤，50℃真空干燥15h，万古霉素磁性硅胶微球固定相，即万古霉素-CSP。
万古霉素磁性硅胶微球固定相在高效液相色谱柱中的填装方法如下：
取万古霉素磁性硅胶微球固定相2.0g，并向其中加入50mL丙酮，超声分散20min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入高效液相色谱柱管中，色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)，填充压力为20MPa。
实施例3
万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备方法，具体步骤如下：
(1)磁性硅胶微球的制备：将8.0g水解的硅胶微球分散到100mL氯仿中，加入3.0gFe3O4纳米颗粒，升温至80℃，机械搅拌，使Fe3O4磁性纳米粒子充分进入硅胶微球孔中，待冷却至室温，过滤微球，真空干燥，得到磁性硅胶微球，即Fe3O4@SiO2；
(2)磁性硅胶微球表面修饰γ-氨丙基三乙氧基硅烷：取1.2g步骤(1)得到的磁性硅胶微球，在超声作用下分散在70mL干燥甲苯中，在氮气保护下，并逐滴加γ-氨丙基三乙氧基硅烷10.0mL，升温至110℃，回流反应24h，取出磁性硅胶微球，用甲苯、甲醇各洗涤三次，然后置于70℃的真空干燥箱中干燥30h，得到磁性硅胶微球-NH2，即Fe3O4@SiO2-NH2；
(3)磁性硅胶微球-Br的制备：在冰浴条件下，将5.0g步骤(2)得到的磁性硅胶微球-NH2分散在90mL二氯甲烷中，冰浴40min，加入6.0mL三乙胺，冰浴10min，再加入5.0mLα-溴异丁酰溴和40mg 4-二甲氨基吡啶，冰浴1h，升温至25℃反应24h，用二氯甲烷、乙醇、水各洗涤三次，置于烘箱70℃真空干燥30h，制得磁性硅胶微球-Br，即Fe3O4@SiO2-Br；
(4)磁性硅胶微球-GMA的制备：取干燥甲苯40mL和干燥甲基丙烯酸缩水甘油酯5mL混合，超声30min密封，得到混合物A，取步骤(3)得到的磁性硅胶微球-Br5.0g，2,2联吡啶3.0g和CuBr 0.5g混合，加入磁子密封，得到混合物B；向混合物A和混合物B中通入氮气40min，在氮气保护下，将混合物A通入混合物B中，迅速密封，在室温下磁力搅拌反应聚合30h，依次用水、甲醇溶液多次洗涤，70℃真空干燥14h，制得磁性硅胶微球-GMA，即Fe3O4@SiO2-GMA；
(5)万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备：取万古霉素1.5g溶于20mL水中，超声10min使其充分溶解，取步骤(4)得到的磁性硅胶微球-GMA5.0g，70℃下磁力搅拌反应14h，砂芯漏斗抽滤，依次用水和甲醇充分洗涤，70℃真空干燥14h后，将产物加入到20mL甲醇中，45℃下回流1h，用甲醇充分洗涤，70℃真空干燥14h，万古霉素磁性硅胶微球固定相，即万古霉素-CSP。
万古霉素磁性硅胶微球固定相在高效液相色谱柱中的填装方法如下：
取万古霉素磁性硅胶微球固定相4.0g，并向其中加入50mL丙酮，超声分散40min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入高效液相色谱柱管中，色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)，填充压力为30MPa。
实施例4
以实施例1制备的万古霉素-CSP为例，进行万古霉素磁性硅胶微球固定相的检测：
2.1对Fe3O4@SiO2-GMA微球和万古霉素-CSP在有机元素分析仪中使用惰性气体并在其中高温裂解来进行元素分析，结果如表1所示。
表1：元素分析结果
表1：Fe3O4@SiO2-GMA微球和万古霉素-CSP元素分析结果
材料 C(％) H(％) N(％)
Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>@SiO<sub>2</sub>-GMA 4.213 0.486 0.56
万古霉素-CSP 8.737 0.896 1.213
由表1可知，在磁性硅胶微球中与万古霉素手性固定相中对比，碳氮氢的含量相对于磁性硅胶微球都有所增加，这说明万古霉素成功接枝到磁性硅胶微球表面。
2.2利用红外光谱检测万古霉素-CSP，结果如图3所示：在FT-IR谱中，Fe-O吸收峰在469cm-1处观察到，792cm-1，948cm-1，1081cm-1分别为Si-O的吸收峰，Si-O-H的吸收峰，Si-O-Si的红外吸收峰，表明磁性纳米粒子已成功合成。曲线b是Fe3O4@SiO2-Br的红外光谱图，在图中有着和曲线c中一样的469cm-1Fe-O吸收峰和792cm-1处Si-O的红外吸收峰，1656cm-1为2-溴异丁酰溴中的C＝O键的伸缩振动峰，这表明Fe3O4@SiO2-Br大分子引发剂已成功制备，在3500-2800cm-1的峰归属于N-H伸缩振动峰，万古霉素-CSP在2955cm-1处的氨基吸收峰，该特征峰的出现说明万古霉素成功接枝到磁性硅胶微球表面。
2.3利用透射电镜观察万古霉素-CSP，结果如图4所示：图a为磁性硅胶微球，图b为是万古霉素-CSP，从图中可以看出该微球有着大小均一和良好的单分散性质。图b与图a相比可知，磁性硅胶微球表面包覆了一层万古霉素层，由此可以说明，万古霉素成功在微球的表面接上。另外，万古霉素-CSP比磁性硅胶微球大，粒径为4-6μm，孔径为18-20nm，比表面积为98.5732-109.4316m2/g，说明得到的产物是成功的且符合实验的要求。
2.4利用振动样品磁强计测定磁性，结果如图5所示：在磁滞回线(VSM)图谱中，曲线a是Fe3O4磁性纳米粒子的磁滞回线，其饱和磁化率为61.67emu/g。曲线b为磁性硅胶微球的磁滞回线，其饱和磁化率为27.56emu/g。可以看出，Fe3O4磁性纳米粒子和磁性硅胶微球的磁强度正在逐渐降低。磁性硅胶微球的磁性强度比Fe3O4纳米粒子低，因为它被一层非磁性材料覆盖。曲线c是饱和磁化率的磁滞回线，其饱和磁化率是20.15emu/g，磁化饱和值降低表明万古霉素成功接枝到磁性硅胶微球表面。
2.5流动相和样品的制备：甲醇/水，包含0.01％冰醋酸和0.01％三乙胺，甲醇等流动相在使用前用超声仪超声30min，甲醇将上述样品分别配制成0.1mg/mL的溶液，低温保存。样品A,B,C,D分别为：阿替洛尔，普萘洛尔，氟西汀和氨氯地平。
反相色谱条件：流动相：I、甲醇/水，40/60(v/v)，流速，0.3mL/min；II、甲醇/水，50/50(v/v)；III、甲醇/水，30/70(v/v)；流速：0.3mL/min；IV甲醇/水，20/80(v/v)；流速：0.3mL/min，进样量为5μL。
反相色谱条件下对映体分离的色谱图如图6所示，分离结果如表2所示。其中，保留因子(k)由公式k＝(tR–t0)/t0计算，其中tR代表样品保留时间，t0代表初始时间，分离因子(α)是由k2/k1计算，而分离度(Rs)由公式Rs＝2(tR2–tR1)/(W1+W2)计算,其中tR2和tR1分别代表第二个光学纯异构体和第一个光学纯异构体的保留时间，W1和W2分别代表色谱峰的峰底宽度。分离结果如图6和表2所示。
表2：反相色谱条件下对映体的分离结果
表2：反相色谱条件下对映体的分离结果
Figure BDA0002795142510000111
由图6和表2结果可知，4种对映体化合物在万古霉素磁性硅胶微球固定相上的分离效果好，速度快。同样，用实施例2和3制备得到的万古霉素磁性硅胶微球固定相分离4种对映体化合物，其分离效果好，速度快。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化。

Claims (6)

1.一种万古霉素磁性硅胶微球固定相，其特征在于，以单分散的磁性硅胶微球为基质，在其表面修饰甲基丙烯酸缩水甘油酯，再将万古霉素接枝到修饰后的磁性硅胶微球上，形成单分散的万古霉素磁性硅胶微球固定相。
2.根据权利要求1所述的万古霉素磁性硅胶微球固定相，其特征在于，所述的万古霉素磁性硅胶微球固定相粒径为4-6μm，孔径为18-20nm，比表面积为98.5732-109.4316m2/g。
3.一种权利要求1所述的万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)磁性硅胶微球的制备：将6-8g水解的硅胶微球分散到80-100mL氯仿中，加入1.5-3.0gFe3O4纳米颗粒，升温至80℃，机械搅拌，使Fe3O4磁性纳米粒子充分进入硅胶微球孔中，待冷却至室温，过滤微球，真空干燥，得到磁性硅胶微球，即Fe3O4@SiO2；
(2)磁性硅胶微球表面修饰γ-氨丙基三乙氧基硅烷：取0.8-1.2g步骤(1)得到的磁性硅胶微球，超声分散在50-70mL干燥甲苯中，在氮气保护下，逐滴加γ-氨丙基三乙氧基硅烷8-10mL，升温至110℃，回流反应24h，取出磁性硅胶微球，甲苯、甲醇洗涤，真空干燥，得到磁性硅胶微球-NH2，即Fe3O4@SiO2-NH2；
(3)磁性硅胶微球-Br的制备：在冰浴条件下，将3-5g步骤(2)得到的磁性硅胶微球-NH2分散在70-90mL二氯甲烷中，冰浴40min，加入4-6mL三乙胺，冰浴10min，再加入3-5mLα-溴异丁酰溴和30-40mg 4-二甲氨基吡啶，冰浴1h，升温至25℃反应24h，用二氯甲烷、乙醇、水洗涤，真空干燥，制得磁性硅胶微球-Br，即Fe3O4@SiO2-Br；
(4)磁性硅胶微球-GMA的制备：取干燥甲苯20-40mL和干燥甲基丙烯酸缩水甘油酯3-5mL混合，超声30min密封，得到混合物A，取步骤(3)得到的磁性硅胶微球-Br3.0-5.0g，2,2联吡啶2.0-3.0g和CuBr 0.1-0.5g混合，加入磁子密封，得到混合物B；向混合物A和混合物B中通入氮气，在氮气保护下，将混合物A通入混合物B中，迅速密封，磁力搅拌，用水、甲醇溶液洗涤，真空干燥，制得磁性硅胶微球-GMA，即Fe3O4@SiO2-GMA；
(5)万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备：取万古霉素0.5-1.5g溶于20mL水中，超声溶解，取步骤(4)得到的磁性硅胶微球-GMA3.0-5.0g，磁力搅拌，抽滤，用水和甲醇洗涤，真空干燥后将产物加入到20mL甲醇中，45℃下回流1h，甲醇洗涤，真空干燥，得到万古霉素磁性硅胶微球手性固定相，即万古霉素-CSP。
4.根据权利要求3所述的万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述的真空干燥的条件是的50-70℃真空干燥箱中干燥20-30h；步骤(4)和步骤(5)中所述的真空干燥的条件是50-70℃真空干燥箱中干燥10-14h；步骤(5)中所述的磁力搅拌是在50-70℃下搅拌10-14h。
5.根据权利要求3所述的万古霉素磁性硅胶微球固定相的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的通入氮气的时间为20-40min；所述的磁力搅拌的时间为20-30h；步骤(5)中超声溶解时间为5-15min。
6.一种权利要求1所述的万古霉素磁性硅胶微球固定相的应用，其特征在于，所述的万古霉素磁性硅胶微球固定相可用于对映体的手性分离。
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