CN112592840B - 一种复合微生物制剂及其在防治疫霉中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种复合微生物制剂，其按照如下工艺制备而得：将康氏木霉‑丝孢酵母混合发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液按照5‑8:2‑3:2‑3的体积比混合均匀，然后真空冷冻干燥制得菌粉，即得。本发明复合微生物制剂中采用四种生防菌株，能够协同共生，配伍合理，互不拮抗，大大提高防治疫霉的效果，并且对人畜和农作物无害，环境友好，制备工艺也相对简单，使用方法便捷，应用前景广阔。

Description

一种复合微生物制剂及其在防治疫霉中的用途

交叉引用

本申请要求2018年4月2日提交的发明名称为“一种复合微生物制剂及其在防治疫霉中的用途”的第2018102802880号中国专利申请的优先权，其公开的内容整体引用本文。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种复合微生物制剂及其在防治疫霉中的用途。

背景技术

疫霉属（Phytophthora），霜霉目（Peronosporales）致病菌，低等的孢子囊梗与菌丝无明显区别，高等的有区别，孢子囊柠檬形或卵形，顶端有乳突，引致马铃薯晚疫病，芋头疫病等。菌丝初无隔多核，分枝多呈锐角，常在分枝处缢缩，粗2-10μm，有少数种可产生吸器，有时形成菌丝膨大体。孢囊梗从与菌丝区别不大至分化明显，不规则分枝、合轴分枝，或从空孢子囊内层出。孢子囊形态变化大，一般为卵形、倒梨形、椭圆形，也有不规则形，大小变化大；顶部具乳突、半乳突或无乳突；一般单独顶生于孢囊梗上，偶尔间生；成熟后脱落或不脱落，脱落者具长柄（>20μm）、中柄（5-20μm）或短柄（<5μm）；可直接萌发产生芽管，或间接萌发产生游动孢子。游动孢子卵形或蚕 豆形，侧生双鞭毛，休止后形成细胞壁，球形，称为休止孢子。厚垣孢子如形成多为球形，薄壁或厚壁，无色至深色，顶生或间生。藏卵器球形或近球形、漏斗形，壁平滑或 具纹饰，无色、黄色至褐色。雄器大小形状不一，无色，围生（穿雄生）或侧生。卵孢子球形，厚壁或薄壁，无色至浅色，满器或不满器。

辣椒生产受多种病虫害的影响，其中辣椒疫霉病是主要的土传虫害之一。辣椒疫霉病在辣椒全生育期地上绿色部分及根部均受害，苗期发病茎基部呈暗绿色水渍状软腐或伏倒，即苗期得病时的茎基部呈黑褐色，幼苗枯萎蔫死，木质的幼茎根茎组织腐烂，茎叶急速萎蔫，幼苗枯死。成株主茎基部及分枝受害初产生较少褐斑病，然后迅速向四周扩展，包括全茎，后期病部呈褐色，与健康组织界线明显。根部感染病株须根减少，侧根为淡褐色或深褐色，后期腐烂。主茎或根部全株枯死，侧枝受害，其上枝条枯死。叶片发病呈水渍状由边缘向内扩展，后为淡褐色。 花器官发病表现为变褐软腐、脱落。果实多从蒂部发病，初期呈水渍状病斑，潮湿时软腐，病健交界明显。如环境适宜迅速向外扩大，导致果实腐烂。

辣椒疫霉病由鞭毛菌亚门真菌辣椒疫霉引起。病菌主要以卵孢子、 厚桓孢子在病残体或土壤及种子上越冬其中土壤病残体带菌率高，是主要浸染源。条件适宜时，越冬后的病菌经雨水飞溅或灌溉水传到茎基部或近地面植株上，引起发病。因此，辣椒疫霉病成为发病周期短、流行速度迅猛的毁灭性病害。高温、高湿、降雨日数多、雨量大，有利于病害发生。目前防治方法主要包括：农业防治、化学防治以及生物防治。农业防治主要包括合理倒茬以及科学种植。合理倒茬是农业生产中不可忽视的耕作措施，合理的耕作制度与布局，对辣椒的生长非常有利。化学防治包括土壤用药和田间用药；但是化学用药容易产生残留造成环境污染，而且拮抗菌的产生使得化学防治效果越累越差。生物防治主要采用拮抗微生物，环境友好性强，不会产生污染。现有技术的单一菌剂比较多见，例如链霉菌、枯草芽孢杆菌等，但是单一菌株往往存在防治效果低下、药效慢等缺陷，目前多个科研院所已经进行复合生防制剂的研究。复合生防制剂一般是指包括两种以上的微生物的制剂，选择复合生防制剂中的菌株较为关键，也是难点；如果选择不慎，菌株之间反而会起到相互拮抗的反作用。

发明内容

为了克服现有技术中单一生防菌剂防治效果差、药效慢等缺陷，本发明提供了一种复合微生物制剂及其在防治疫霉中的用途。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种复合微生物制剂，其按照如下工艺制备而得：将康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液按照5-8:2-3:2-3的体积比混合均匀，然后真空冷冻干燥制得菌粉，即得。

进一步地，所述复合微生物制剂用于防治疫霉。

进一步地，所述疫霉为辣椒疫霉。

优选地，

所述康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液按照如下步骤制备而得：

1）将丝孢酵母划线接种在YPDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到YPD液体培养基上培养，30℃培养24h，得到丝孢酵母种子液，待用；

2）将康氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基上培养，30℃、200rpm摇床培养36h，得到康氏木霉种子液，待用；

3）先将康氏木霉种子液按照10%的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养6小时，然后将丝孢酵母种子液按照5%的接种量接入到发酵培养基，继续以30℃培养18小时，得到康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液。

优选地，

所述沼泽红假单胞菌发酵液按照如下步骤制备而得：

将沼泽红假单胞菌在LB平板上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落接入种子培养基上培养至对数生长期，培养条件为：30-32℃，光照3000-4000Lux，制成种子液；然后按照10%的接种量接入到发酵培养基中，30-32℃培养24h，得到沼泽红假单胞菌发酵液。

优选地，

所述枯草芽孢杆菌发酵液按照如下步骤制备而得：

将枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落接入种子培养基上，30℃、200rpm摇床培养至对数生长期，制成种子液；然后按照8%的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养36h，得到枯草芽孢杆菌发酵液。

优选地，

所述发酵培养基的组分为：玉米秸秆粉16g/L、豆粕10g/L、氯化铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.01g/L。

优选地，

所述沼泽红假单胞菌种子培养基和发酵培养基的组分均为：葡萄糖 8g/L、酵母提取物5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、碳酸氢钠0.1g/L、硫酸镁0.01g/L。

优选地，

所述枯草芽孢杆菌种子培养基和发酵培养基的组分均为：葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵3g/L、尿毒1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、氯化钙0.02g/L、硫酸亚铁0.01g/L。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

丝孢酵母和康氏木霉之间无拮抗作用，可以相互共生，木霉菌能够分泌纤维素酶，将秸秆纤维素分解为丝孢酵母可利用的碳源，从而使得丝孢酵母利用碳源进行生长，减低了发酵成本；采用先接入康氏木霉的方式，6小时后接入酵母菌；酵母菌反过来还能促进康氏木霉的生长，并且使得木霉的产酶量也大大提高，从而提高拮抗灰霉菌的能力。沼泽红假单胞菌和枯草芽孢杆菌可以分泌多种抑菌物质，还能够与病原菌竞争营养和空间；本发明复合微生物制剂中采用四种生防菌株，能够协同共生，配伍合理，互不拮抗，大大提高防治疫霉的效果；本发明制剂对人畜无害，对农作物无害，环境友好，其制备工艺也相对简单，使用方法便捷，应用前景广阔。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种复合微生物制剂，其包括丝孢酵母、康氏木霉、枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌。

具体地，所述复合微生物制剂按照如下工艺制备而得：

将丝孢酵母划线接种在YPDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到YPD液体培养基上培养，30℃培养24h，得到种子液，待用；

YPD培养基的配方：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，补充蒸馏水至1000mL；

YPDA培养基的配方：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，琼脂20g ,补充蒸馏水至1000mL；

将康氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基上培养，30℃、200rpm摇床培养36h，得到种子液，待用；

先将康氏木霉种子液按照10%的接种量（接种密度为1×10⁷CFU/ml）接入到发酵培养基中，30℃培养6小时，然后将丝孢酵母种子液按照5%的接种量（接种密度为1×10⁷CFU/ml）接入到发酵培养基，继续以30℃培养18小时，得到康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液；所述发酵培养基的组分为：玉米秸秆粉16g/L、豆粕10g/L、氯化铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.01g/L；

将沼泽红假单胞菌在LB平板上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落接入种子培养基上培养至对数生长期，培养条件为：30-32℃，光照3000-4000Lux，制成种子液；然后按照10%的接种量（接种密度为3×10⁷CFU/ml）接入到发酵培养基中，30-32℃培养24h，得到沼泽红假单胞菌发酵液；所述种子培养基和发酵培养基的组分均为：葡萄糖 8g/L、酵母提取物5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、碳酸氢钠0.1g/L、硫酸镁0.01g/L；

将枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落接入种子培养基上，30℃、200rpm摇床培养至对数生长期，制成种子液；然后按照8%的接种量（接种密度为5×10⁶CFU/ml）接入到发酵培养基中，30℃培养36h，得到枯草芽孢杆菌发酵液；所述种子培养基和发酵培养基的组分均为：葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵3g/L、尿毒1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、氯化钙0.02g/L、硫酸亚铁0.01g/L；

将康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液按照8:3:3的体积比混合均匀，然后真空冷冻干燥制得菌粉，即得。

所述康氏木霉为ATCC 66766；所述丝孢酵母为ATCC 201110；所述沼泽红假单胞菌为ATCC 17001；所述枯草芽孢杆菌为ATCC 6633。

实施例2

一种复合微生物制剂，其包括丝孢酵母、康氏木霉、枯草芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌。

具体地，所述复合微生物制剂按照如下工艺制备而得：

将丝孢酵母划线接种在YPDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到YPD液体培养基上培养，30℃培养24h，得到种子液，待用；

YPD培养基的配方：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，补充蒸馏水至1000mL；

YPDA培养基的配方：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，琼脂20g ,补充蒸馏水至1000mL；

将康氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基上培养，30℃、200rpm摇床培养36h，得到种子液，待用；

先将康氏木霉种子液按照10%的接种量（接种密度为1×10⁷CFU/ml）接入到发酵培养基中，30℃培养6小时，然后将丝孢酵母种子液按照5%的接种量（接种密度为1×10⁷CFU/ml）接入到发酵培养基，继续以30℃培养18小时，得到康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液；所述发酵培养基的组分为：玉米秸秆粉16g/L、豆粕10g/L、氯化铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.01g/L；

将沼泽红假单胞菌在LB平板上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落接入种子培养基上培养至对数生长期，培养条件为：30-32℃，光照3000-4000Lux，制成种子液；然后按照10%的接种量（接种密度为3×10⁷CFU/ml）接入到发酵培养基中，30-32℃培养24h，得到沼泽红假单胞菌发酵液；所述种子培养基和发酵培养基的组分均为：葡萄糖 8g/L、酵母提取物5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L、碳酸氢钠0.1g/L、硫酸镁0.01g/L；

将枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落接入种子培养基上，30℃、200rpm摇床培养至对数生长期，制成种子液；然后按照8%的接种量（接种密度为5×10⁶CFU/ml）接入到发酵培养基中，30℃培养36h，得到枯草芽孢杆菌发酵液；所述种子培养基和发酵培养基的组分均为：葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、硫酸铵3g/L、尿毒1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、氯化钙0.02g/L、硫酸亚铁0.01g/L；

将康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液、沼泽红假单胞菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液按照5:2:2的体积比混合均匀，然后真空冷冻干燥制得菌粉，即得。

所述康氏木霉为ATCC 66766；所述丝孢酵母为ATCC 201110；所述沼泽红假单胞菌为ATCC 17001；所述枯草芽孢杆菌为ATCC 6633。

实施例3

本发明复合微生物制剂对辣椒疫霉病菌的防治效果

组别：实验组：实施例1；对照组1：仅仅采用康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液，其余同实施例1；对照组2：仅仅采用沼泽红假单胞菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液，其余同实施例1；对照组3：将康氏木霉和丝孢酵母分开进行发酵，再将四种发酵液混合，其余同实施例1；空白对照：同等量的清水。

制剂预处理：将制剂添加到100倍重量的水中，搅拌均匀，备用。

土壤处理：辣椒疫霉菌经固体培养4天后，接入V8液体培养基中，25℃培养4天，倾出液体培养基，菌丝称重，按10g/公斤土壤的量接入到各小区土壤中。

处理方式：辣椒试验田，分为五个小区，每个小区对应各组别；分别将辣椒幼苗（牛角椒）在各制剂的稀释液中浸泡60min，然后取出，移栽到各小区；

检测标准：疫霉病发病程度分为6级。0级为根系未发病；1级为根系发病率≤30％，叶片正常；2级为30％<根系发病率≤60％，叶片正常；3级为60％<根系发病率≤80％；叶片变黄，4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎，5级为整株死亡，叶片干枯。病情指数和防治效果分别按照下列公式计算:病情指数＝[(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)] ×100。防治率＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数] ×100％。21天后取样统计发病程度，计算病情指数；见表1。还检测了植株总鲜重和根鲜重，具体见表2.

表1

组别	病情指数	防治率%
			实验组	9.3	89.2
对照组1	27.1	68.6
			对照组2	32.6	62.3
对照组3	14.9	72.8
			空白对照	86.5	---

表2

组别	植株总鲜重g	根鲜重g
			实验组	129.6	33.5
对照组1	104.6	25.1
			对照组2	96.1	23.7
对照组3	113.2	28.9
			空白对照	81.4	19.8

结论：如表1所示，实验组对辣椒疫霉的防治率最高，可达到89.2%，明显高于对照组1-2，也高于分开发酵方式的对照组3，说明丝孢酵母和康氏木霉之间可以共同发酵，首先接入木霉菌，其分泌纤维素酶，将纤维素分解为丝孢酵母可利用的碳源，从而使得后续接种的丝孢酵母利用碳源进行生长，减低了发酵成本，酵母菌反过来还能促进康氏木霉的生长，并且使得木霉的产酶量也大大提高，从而提高拮抗灰霉菌的能力。植物是靠根系从土壤中吸取利用矿质养分，求维持自身的生长和繁殖，根系越发达，植物生长越好；植株代表植物的生物量，可以作为评估果实产量和品质的重要指标；如表2所示，实验组、对照组1-3的植株总鲜重和根鲜重均明显高于空白对照，其中实验组增重最明显，提示，实验组的果实产量和品质也会优于其他组别。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种复合微生物制剂在防治辣椒疫霉中的应用，其特征在于，所述复合微生物制剂按照如下工艺制备而得：将康氏木霉（Trichoderma-Koningii）-丝孢酵母（Trichosporonsp.）混合发酵液、沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）发酵液、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵液按照5-8:2-3:2-3的体积比混合均匀，然后真空冷冻干燥制得菌粉，即得；

所述康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液按照如下步骤制备而得：

1）将丝孢酵母划线接种在YPDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到YPD液体培养基上培养，30℃培养24h，得到丝孢酵母种子液，待用；

2）将康氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基上培养，30℃、200rpm摇床培养36h，得到康氏木霉种子液，待用；

3）先将康氏木霉种子液按照10%的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养6小时，然后将丝孢酵母种子液按照5%的接种量接入到发酵培养基，继续以30℃培养18小时，得到康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液；

所述沼泽红假单胞菌发酵液按照如下步骤制备而得：

将沼泽红假单胞菌在LB平板上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落接入种子培养基上培养至对数生长期，培养条件为：30-32℃，光照3000-4000Lux，制成种子液；然后按照10%的接种量接入到发酵培养基中，30-32℃培养24h，得到沼泽红假单胞菌发酵液；

所述枯草芽孢杆菌发酵液按照如下步骤制备而得：

将枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落接入种子培养基上，30℃、200rpm摇床培养至对数生长期，制成种子液；然后按照8%的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养36h，得到枯草芽孢杆菌发酵液；

所述康氏木霉为康氏木霉ATCC66766，所述丝孢酵母为丝孢酵母ATCC201110，所述沼泽红假单胞菌为沼泽红假单胞菌ATCC17001，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC6633。