CN112574185A - 一种金黄霉素a的规模化制备方法 - Google Patents

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倪宏进
储消和
章华伟
柳鹏福
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    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond

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Abstract

本发明属于分离提纯领域，具体涉及一种金黄霉素A的规模化分离纯化方法。所述分离纯化方法是将金黄霉素发酵液板框过滤后烘干得到干菌渣，粉碎后用有机溶剂超声提取，提取液浓干后加入溶剂清洗水溶性杂质，再加入二氯甲烷萃取，二氯甲烷萃取液脱色后抽滤，滤液浓干得金黄霉素A粗品，将其加入溶剂溶解后上制备色谱分离得到金黄霉素A纯品。所述方法操作简单，有机溶剂用量很少，避免了因使用大孔树脂、硅胶或有机溶剂结晶而产生大量废水和有机溶剂，且最终金黄霉素A的收率达到95％以上，获得的金黄霉素A纯品中金黄霉素A的含量在96％以上，纯度在98％以上，更适合规模化生产，成本低，效益高。

Description

一种金黄霉素A的规模化制备方法
技术领域
本发明属于分离提纯领域，具体涉及一种金黄霉素A的规模化分离纯 化方法。
背景技术
金黄霉素(Chrysomycin)是由海洋链霉菌Streptomyces sp.891发酵产 生的，分为金黄霉素A和金黄霉素B两种组份，其中金黄霉素A因其8 位的乙烯基而具有很好的抗耐药金黄色葡萄球菌活性。其A、B结构式分 别为：
Figure BDA0002712428890000011
由于金黄霉素A和B结构极为相似，因此分离纯化极其困难。目前国 内外对金黄霉素A的分离纯化主要采用大孔树脂吸附、一次性硅胶分离和 有机溶剂结晶等三种方法。其中大孔树脂吸附和一次性硅胶分离两种方法 的过程中：树脂和硅胶的前期预处理要消耗大量的酸碱溶液，在洗脱过程 中有机溶剂使用量大，有机溶剂回收条件要求高，上样量小，收率低，成 本高；同时有机溶剂结晶方法具有：有机溶剂使用量大，多种有机溶剂混 合使用，有机溶剂回收困难，成本高等缺点。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术问题，提供一种金黄霉素A的规模化 分离纯化方法。避免了在金黄霉素A分离纯化过程中因使用大孔树脂、硅 胶或有机溶剂结晶而造成的大量废水和有机溶剂的产生，开辟了一种全新 的金黄霉素A分离纯化的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种金黄霉素A的规模化制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将金黄霉素发酵液板框过滤，得到湿菌渣，真空烘干；
(2)干菌渣粉碎后用有机溶剂搅拌超声提取，过滤得到提取液；
(3)将提取液浓缩至干，加入溶剂溶解搅拌，以去除大部分的水溶性 杂质，达到清洗效果；
(4)向步骤(3)得到的溶液加入二氯甲烷溶剂进行萃取；
(5)二氯甲烷萃取液加活性炭、无水硫酸钠脱色后抽滤，滤液浓缩至 干得金黄霉素A粗品；
(6)金黄霉素A粗品加溶剂溶解；
(7)上制备色谱分离，得金黄霉素A。
优选的，所述步骤(2)中，有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种或 几种的混合物。
优选的，所述步骤(3)中，溶剂为水、甲醇、丙酮中的一种或几种的 混合物。
优选的，所述步骤(6)中，溶剂为二甲基亚砜、乙腈、四氢呋喃中的 一种或几种的混合物。
优选的，所述步骤(6)中，溶剂为二甲基亚砜、乙腈和四氢呋喃按体 积比(1-5)：(1-3)：(1-3)配制的混合溶剂；更优选的，所述步骤(6)中， 溶剂为二甲基亚砜、乙腈和四氢呋喃按体积比(1-3)：1：1配制的混合溶 剂；更优选的，所述步骤(6)中，溶剂为二甲基亚砜、乙腈和四氢呋喃按 体积比(2-3)：1：1配制的混合溶剂。
优选的，所述步骤(7)中，制备色谱的填料为C18，粒径为5μm，制 备柱直径为15cm，高度为50cm，填料装量为2kg。上样量为填料重量的 2％，流动相为甲醇：水＝60:40，检测波长为254nm，保留时间为150min， 泵流速为300ml/min。
本发明中所述的浓缩至干是指将提取液浓缩到没有溶剂进一步挥出， 包括常见的如旋转蒸发、真空油泵抽取等技术手段。
本发明的有益效果是：本发明分离纯化金黄霉素A的方法操作简单， 有机溶剂用量少，避免了因使用大孔树脂、硅胶或有机溶剂结晶而产生大 量废水和有机溶剂。在上制备色谱柱前，得到的金黄霉素A粗品中金黄霉 素A的含量可以达到85％以上。随后对于金黄霉素A粗品的进一步提纯过 程中，选取的溶解金黄霉素A粗品的溶剂对金黄霉素A的溶解度是常规溶 剂的20倍，制备色谱一次制备的金黄霉素A的产量是常规制备色谱的3 倍，极大的减少了制备色谱纯化过程中有机溶剂的用量。且最终金黄霉素 A的收率达到95％以上，获得的金黄霉素A纯品中金黄霉素A的含量在 96％以上，纯度在98％以上，更适合规模化生产，成本低，效益高。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1
将金黄霉素发酵液板框过滤，得到湿菌渣，真空烘干得到干菌渣，取 干菌渣100g，加甲醇300ml，超声搅拌3h，过滤得甲醇提取液250ml(含 金黄霉素A1％)；甲醇提取液浓缩回收甲醇，浓缩至干后用水100ml溶解 搅拌清洗，以将大部分水溶性杂质溶解到水中，得到略微混浊的水溶液 100ml。加100ml二氯甲烷到水溶液中，充分搅拌后静置分层，收集二氯甲 烷溶液，加10g活性炭和5g无水硫酸钠脱色1h，过滤得脱色液，浓缩回 收二氯甲烷，浓干后得金黄霉素A粗品(金黄霉素A的含量达到85％以上)， 加溶剂溶解(溶剂为二甲亚砜、乙腈和四氢呋喃按3:1:1配制)配成50ml 溶液(含金黄霉素A5.0％)；每次取15-20ml溶液上制备色谱分离，流动相 为甲醇：水＝60:40，在60分钟金黄霉素A开始出峰时开始收集至出峰结束。 溶解后的溶液都经过制备色谱分离后，所有收集液合并后减压浓缩蒸干甲 醇后剩余液体离心，滤饼60℃真空烘干，得黄色金黄霉素A结晶2.45克， 液相含量为96.8％，纯度为98.5％。
其中，制备色谱的条件为：制备色谱的填料为C18，粒径为5μm，制 备柱直径为15cm，高度为50cm，填料装量为2kg。上样量为填料重量的 2％，流动相为甲醇：水＝60:40，检测波长为254nm，保留时间为150min， 泵流速为300ml/min。
实施例2
取干菌渣100g，加乙醇300ml，超声搅拌3h，过滤得乙醇提取液250ml (含金黄霉素A1％)；乙醇提取液浓缩回收乙醇，浓干后用50％甲醇溶液 100ml溶解清洗，得到甲醇水溶液100ml，加100ml二氯甲烷到甲醇水溶液 中，充分搅拌后静置分层，收集二氯甲烷溶液，加10g活性炭和5g无水硫 酸钠脱色1h，过滤得脱色液，浓缩回收二氯甲烷和甲醇，浓干后加溶剂溶 解(溶剂为二甲亚砜、乙腈和四氢呋喃按2:1:1配制)配成50ml溶液(含 金黄霉素A4.5％)；取15ml溶液上制备色谱分离，流动相为甲醇：水＝60:40， 在60分钟金黄霉素A开始出峰时开始收集至出峰结束。所有收集液合并后 减压浓缩蒸干甲醇后离心，滤饼60℃真空烘干，得黄色金黄霉素结晶2.32 克，液相含量为96％，纯度为98.5％。制备色谱条件同实施例1。
实施例3
取干菌渣100g，加甲醇：丙酮＝1:1的溶液300ml，超声搅拌5h，过滤 得提取液250ml(含金黄霉素A1.2％)；提取液浓缩回收甲醇和丙酮，浓干 后用水100ml溶解清洗，得到水溶液100ml。加100ml二氯甲烷到水溶液 中，充分搅拌后静置分层，收集二氯甲烷溶液，加10g活性炭和5g无水硫 酸钠脱色1h，过滤得脱色液，浓缩回收二氯甲烷，浓干后加溶剂溶解(溶 剂为二甲亚砜、乙腈和四氢呋喃按3:1:1配制)配成50ml溶液(含金黄霉 素A6.0％)；取15ml溶液上制备色谱分离，流动相为甲醇：水＝60:40，在 60分钟金黄霉素A开始出峰时开始收集至出峰结束。所有收集液合并后减 压浓缩蒸干甲醇后离心，滤饼60℃真空烘干，得黄色金黄霉素结晶2.95克， 液相含量为97.1％，纯度为99％。制备色谱条件同实施例1。
实施例4
取干菌渣100g，加甲醇300ml，超声搅拌3.5h，过滤得提取液250ml (含金黄霉素A1％)；提取液浓缩回收甲醇，浓干后用水100ml溶解清洗， 得到水溶液100ml。加100ml二氯甲烷到水溶液中，充分搅拌后静置分层， 收集二氯甲烷溶液，加10g活性炭和5g无水硫酸钠脱色1h，过滤得脱色 液，浓缩回收二氯甲烷，浓干后加溶剂溶解(溶剂为二甲亚砜、乙腈和四 氢呋喃按5:3:2配制)配成50ml溶液(含金黄霉素A5.5％)；取15ml溶液 上制备色谱分离，流动相为甲醇：水＝60:40，在60分钟金黄霉素A开始出 峰时开始收集至出峰结束。所有收集液合并后减压浓缩蒸干甲醇后离心， 滤饼60℃真空烘干，得黄色金黄霉素结晶2.68克，液相含量为97％，纯度 为98.5％。制备色谱条件同实施例1。
实施例5
取干菌渣100g，加甲醇300ml，超声搅拌3h，过滤得提取液250ml(含 金黄霉素A1％)；提取液浓缩回收甲醇，浓干后用水100ml溶解清洗，得 到水溶液100ml。加100ml二氯甲烷到水溶液中，充分搅拌后静置分层， 收集二氯甲烷溶液，加10g活性炭和5g无水硫酸钠脱色1h，过滤得脱色 液，浓缩回收二氯甲烷，浓干后加溶剂溶解(溶剂为二甲亚砜、乙腈和四 氢呋喃按1:1:1配制)配成50ml溶液(含金黄霉素A4.0％)；取15ml溶液 上制备色谱分离，流动相为甲醇：水＝60:40，在60分钟金黄霉素A开始出 峰时开始收集至出峰结束。所有收集液合并后减压浓缩蒸干甲醇后离心， 滤饼60℃真空烘干，得黄色金黄霉素结晶2.24克，液相含量为96.4％，纯 度为98.6％。制备色谱条件同实施例1。
以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式 上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体 及改型。

Claims (8)

1.一种金黄霉素A的规模化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将金黄霉素发酵液板框过滤，得到湿菌渣，真空烘干；
(2)干菌渣粉碎后用有机溶剂搅拌超声提取，过滤得到提取液；
(3)将提取液浓缩至干，加入溶剂溶解搅拌；
(4)向步骤(3)得到的溶液加入二氯甲烷溶剂进行萃取；
(5)二氯甲烷萃取液加活性炭、无水硫酸钠脱色后抽滤，滤液浓缩至干得金黄霉素A粗品；
(6)金黄霉素A粗品加溶剂溶解；
(7)上制备色谱分离，得金黄霉素A。
2.根据权利要求1所述一种金黄霉素A的规模化制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮中的一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述一种金黄霉素A的规模化制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，溶剂为水、甲醇、丙酮中的一种或几种的混合物。
4.根据权利要求1所述一种金黄霉素A的规模化制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，溶剂为二甲基亚砜、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求4所述一种金黄霉素A的规模化制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，溶剂为二甲基亚砜、乙腈和四氢呋喃按体积比(1-5)：(1-3)：(1-3)配制的混合溶剂。
6.根据权利要求5所述一种金黄霉素A的规模化制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，溶剂为二甲基亚砜、乙腈和四氢呋喃按体积比(1-3)：1：1配制的混合溶剂。
7.根据权利要求6所述一种金黄霉素A的规模化制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，溶剂为二甲基亚砜、乙腈和四氢呋喃按体积比(2-3)：1：1配制的混合溶剂。
8.根据权利要求1所述一种金黄霉素A的规模化制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中，制备色谱的填料为C18，粒径为5μm，制备柱直径为15cm，高度为50cm，填料装量为2kg，上样量为填料重量的2％，流动相为甲醇：水＝60:40，检测波长为254nm，保留时间为150min，泵流速为300ml/min。
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